李毅力，高 寒，李達(dá)學(xué),李巧立

1.重慶市婦幼保健院乳腺科，重慶 400013;2.重慶市忠縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，重慶 404300

隨著社會(huì)生活節(jié)奏的加快，漿細(xì)胞性乳腺炎(PCM)的發(fā)病率正在逐年升高，占我國的乳腺疾病的1.9%～5.0%。PCM為臨床上以女性為常見的乳腺實(shí)質(zhì)非特異性炎癥性疾病，好發(fā)于女性各個(gè)年齡階段，以年輕和非哺乳期的婦女較為常見[1-5]。臨床上其主要的病理學(xué)變化為乳腺導(dǎo)管周圍炎癥、乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張和壁纖維化，炎癥組織又浸潤大量漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，因此本病又被稱為導(dǎo)管周圍性乳腺炎和乳管擴(kuò)張癥[6-7]。PCM的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，近年研究認(rèn)為免疫分子和免疫細(xì)胞為重要的發(fā)病機(jī)制[8-9]。有研究表明，因患者體內(nèi)的炎癥因子發(fā)生變化，PCM患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)數(shù)目及比例發(fā)生異常[1,10]。此外，有研究證明，醋酸潑尼松具有明顯的治療PCM的作用[7,11]。因此，本研究探討醋酸潑尼松對(duì)PCM患者的Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例以及二者的比值與炎癥因子的表達(dá)情況，以期針對(duì)PCM建立針對(duì)性的治療策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年10月至2019年10月重慶市婦幼保健院乳腺科收治的PCM患者80例，將其隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，每組40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)空芯針穿刺經(jīng)過細(xì)胞學(xué)檢查，同時(shí)經(jīng)過超聲檢查確診為PCM；(2)非哺乳期婦女；(3)未進(jìn)行激素治療；(4)無炎癥性疾?。?5)臨床資料較為完整，同意并服從安排。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期利用激素治療的患者；(2)伴有其他感染性疾病患者；(3)合并出血傾向、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、心肺肝腎功能疾病、血液系統(tǒng)疾病和嚴(yán)重的精神系統(tǒng)疾病患者；(4)依從性差不能配合完成研究的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。按照中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)婦女保健分會(huì)乳腺保健與疾病防治學(xué)組對(duì)PCM的分期，將其分為溢液期、腫塊期、膿腫期和瘺管期。兩組患者年齡、病程和PCM分期情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法 對(duì)照組患者給予哌拉西林舒巴坦(國藥準(zhǔn)字H20060431)治療，每次4.50 g，每天3次，連續(xù)靜脈滴注7 d；觀察組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上給予口服醋酸潑尼松片(國藥準(zhǔn)字H44024469)治療，每次30 mg，每天1次；治療7 d后，每次25 mg；治療14 d后，每次20 mg，依次減停藥。在兩組患者入院時(shí)(治療前)及治療結(jié)束后(治療后)分別抽取清晨空腹靜脈血2管(每管約3 mL)。(1)一管采用抗凝管，靜置30 min，取血清和下層紅細(xì)胞之間的分層處血液約500 μL，用來分析免疫細(xì)胞。Treg細(xì)胞的前處理過程：將所取得的細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液，重懸(緩慢搖動(dòng))，室溫靜置5 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)；然后4 ℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS重懸(緩慢搖動(dòng))；靜置3 min，取上部12 mL，移入新管；4 ℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS重懸，細(xì)胞濃度為(4～10)×109個(gè)/L；取樣100 μL，加CD3 2 μL，加CD4 4 μL，加CD25，4 μL，振蕩混勻，室溫避光靜置15 min；加PBS，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加破膜劑foxp3 900 μL，振蕩混勻，室溫避光靜置60 min；加PBS 1 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加抗體foxp3-PE 5 μL，振蕩混勻，室溫避光靜置60 min；加PBS 1 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清，4 ℃避光保存，待測(cè)。Th細(xì)胞的前處理過程：將所取得的細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液，重懸，室溫靜置5 min，加入PBS；加入刺激劑2 μL，刺激4～6 h；加PBS，4 ℃，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用5 μL血清封閉，37 ℃孵育30 min；取出后加抗體(CD3、CD4、CD25)2.5 μL，用槍頭將細(xì)胞和抗體吹勻，4 ℃ 孵育30 min，加2 mL PBS重懸，400×g離心5 min，棄上清；加Fix/Perm 1 mL重懸，4 ℃ 孵育40～50 min后加1 mL wash buffer洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后加2 mL wash buffer重懸，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加80～100 μL wash buffer及抗體[干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-4、foxp3和IL-17]2.5 μL，4 ℃ 靜置40～50 min，加2 mL wash buffer，400×g離心5 min，棄上清，再加2 mL wash buffer，400×g離心5 min，棄上清，4 ℃避光保存，待測(cè)。利用BD公司的流式細(xì)胞分析儀，分析血液中的Treg細(xì)胞及Th細(xì)胞。(2)另一管則采用促凝管，靜置30 min，采用卓越 400 全自動(dòng)生化分析儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)測(cè)定炎癥因子IL-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值比較 兩組患者治療前Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過治療后，兩組患者Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例均較治療前得到改善，且觀察組的Treg細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2兩組患者治療前后炎癥指標(biāo)比較 治療前，檢測(cè)兩組患者的炎癥因子(CRP、IL-6和TNF-α)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，然而治療后，兩組患者的炎癥因子水平均較治療前降低，觀察組炎癥因子水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值比較

表3 兩組患者治療前后炎癥指標(biāo)比較

3 討 論

PCM臨床癥狀以乳頭溢液、凹陷，乳房疼痛腫脹和有腫塊為主，嚴(yán)重影響女性的身體健康和生活質(zhì)量，其病因不明，多認(rèn)為與乳頭內(nèi)陷、上皮細(xì)胞角質(zhì)化、乳房外傷、厭氧菌感染、吸煙、內(nèi)分泌紊亂、免疫功能紊亂等有關(guān)，其中免疫紊亂和炎癥為當(dāng)下發(fā)現(xiàn)的PCM的重要發(fā)病機(jī)制[8,12-13]。醋酸潑尼松為臨床上常用的具有較強(qiáng)抗炎作用的糖皮質(zhì)激素[14]。因此，本研究利用醋酸潑尼松治療的方式對(duì)PCM進(jìn)行治療，并觀察其對(duì)患者免疫細(xì)胞和炎癥因子表達(dá)情況的影響，并且通過研究發(fā)現(xiàn)，醋酸潑尼松可明顯改善免疫細(xì)胞的功能，PCM發(fā)生時(shí)患者Treg細(xì)胞比例降低，然而Th17細(xì)胞比例升高。

Treg細(xì)胞和Th細(xì)胞均為CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，在正常條件下二者保持動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體的免疫應(yīng)答的穩(wěn)態(tài)[15-16]。PCM發(fā)生時(shí)，乳腺導(dǎo)管因阻塞而導(dǎo)致擴(kuò)張，阻塞導(dǎo)管的病理物質(zhì)可刺激管壁發(fā)生炎癥浸潤，進(jìn)而發(fā)生纖維組織的增生，乳腺導(dǎo)管上皮發(fā)生脫落，刺激乳腺腺體發(fā)生免疫反應(yīng)，使得漿細(xì)胞浸潤，因此PCM為自身免疫性疾病[7-8]。有研究表明，Th17細(xì)胞增多，說明機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，而Treg細(xì)胞減少，提示其抑制炎癥的作用降低[17]。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例失調(diào)也提示PCM患者處于炎癥狀態(tài)[1]。本研究中，通過治療后Treg細(xì)胞比例升高，Th17細(xì)胞比例降低，因此Th17/Treg比值降低。

研究顯示，醋酸潑尼松可以明顯改善人體的免疫功能，其作為臨床上常用的一類人工合成的皮質(zhì)類固醇激素，可以通過抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)而減輕毛細(xì)血管得擴(kuò)張、滲出和水腫，可以起到調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的作用[18-20]。PCM發(fā)生的一個(gè)重要得病理機(jī)制為感染厭氧菌，使乳腺從無菌性炎癥轉(zhuǎn)化為化膿性炎癥。醋酸潑尼松可與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，通過作用于IL-6、IL-8和環(huán)氧化酶等多種炎癥因子發(fā)揮抗炎作用[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醋酸潑尼松可明顯抑制機(jī)體炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，治療療效肯定，值得推廣應(yīng)用。