曹慶生，李志超，韓立旺，張永華，張艷莉，胡穎杰，李紅莉，張文亞

1.河北省唐山市玉田縣醫(yī)院病理科，河北唐山 064100，2.河北省唐山市玉田縣中醫(yī)醫(yī)院疼痛科，河北唐山 064100

肝臟受到各種慢性損傷時，可刺激免疫調(diào)控細(xì)胞分泌大量免疫調(diào)控因子，使肝星狀細(xì)胞活化、增殖，合成大量膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)肝內(nèi)大量沉積，纖維化形成。同時，活化的肝星狀細(xì)胞也可通過自分泌和旁分泌作用于免疫調(diào)控細(xì)胞，維持自身活化并激活臨近肝星狀細(xì)胞。因此，免疫調(diào)控在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1-2]。由于肝纖維化機(jī)制復(fù)雜，西醫(yī)治療肝纖維化缺乏顯著效果的藥物。我國是傳統(tǒng)中藥大國，利用中藥治療肝病歷史悠久，且中草藥來源廣泛、種類繁多。中藥黃酮類有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥因子、保肝的作用，在肝纖維化預(yù)防和治療方面具有多靶點(diǎn)、費(fèi)用低、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，已成為目前新藥研究的熱點(diǎn)[3-4]。矮地茶為紫金?？浦参镒辖鹋rdisiajaponica(Hornst.)BL.的干燥全草，我國南方各省均有分布，《本草綱目》中記載有“解毒破血”的功效，臨床治療咳嗽、咳痰、慢性支氣管炎、利尿祛濕、濕熱黃疸等?，F(xiàn)代研究表明，矮地茶具有黃酮類(槲皮素)、香豆素(巖白菜素和異巖白菜素)、揮發(fā)油等化合物，具有祛痰止咳、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、降血糖等功效[5]。前期研究已證實(shí)，矮地茶黃酮對四氯化碳所致急性肝損傷有保護(hù)作用，對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有降酶、保肝、抗氧化等功效[6]。因此，本文通過觀察矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平的影響，同時觀察肝纖維化其他指標(biāo)，如血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平，肝臟纖維化分級以及肝臟波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)情況，并進(jìn)行對比及相關(guān)性分析，探討矮地茶黃酮能否通過影響機(jī)體免疫功能達(dá)到防治肝纖維化的效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 60只SPF級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠由桂林醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，并在動物實(shí)驗(yàn)中心完成肝纖維化模型制備及藥物干預(yù)，許可證號：SCXK2013-0001。

1.2藥物與試劑 矮地茶購自桂林六合路藥材市場并由張可鋒教授鑒定，制備成矮地茶黃酮。矮地茶黃酮制備方法：取矮地茶全草1 kg，粉碎后加入60%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，提取液過濾后，減壓回收乙醇，濃縮成矮地茶黃酮浸膏。浸膏加蒸餾水充分混勻，鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5，D102型大孔吸附樹脂純化，流速3 mL/min，靜置12 h后，分別用35%乙醇(2倍樹脂體積)、70%乙醇(4倍樹脂體積)洗脫，流速2.5 mL/min，收集70%乙醇洗脫液，測定其總黃酮濃度為71.2%(硝酸鋁絡(luò)合分光度法)。TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司；Vimentin、α-SMA一抗購自深達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.3模型制備及藥物干預(yù) 將SD大鼠按隨機(jī)原則分為5組(正常組，模型組，矮地茶黃酮高、中、低劑量組)，每組12只。參考高雅等[7]方法構(gòu)建肝纖維化模型：用蒸餾水將二甲基亞硝胺稀釋為0.5%，按2 mL/kg的劑量腹腔注射，隔天1次，共8周。同時，矮地茶黃酮組按600、400、200 mg/kg灌胃給藥，正常組、模型組灌服等量蒸餾水，均每天1次。

1.4觀察指標(biāo) 禁食、禁飲后，于大鼠眼球取血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平。剖開腹腔取肝左葉標(biāo)本，常規(guī)取材脫水制片，顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟纖維化程度，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[8]，免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠肝臟Vimentin、α-SMA表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Vimentin、α-SMA以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細(xì)胞。按染色強(qiáng)度打分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細(xì)胞比例打分：陰性0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分，二者相加，給出得分。

2 結(jié) 果

2.1矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，正常組無死亡，模型組死亡3只，矮地茶黃酮高、中、低劑量組分別死亡2、2、1只。模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；矮地茶黃酮高、中劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；矮地茶黃酮低劑量組大鼠血清中血清中TNF-α、IL-1β水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平的影響 模型組大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯高于正常組，矮地茶黃酮高、中劑量組大鼠血清中血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；矮地茶黃酮低劑量組大鼠血清HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，矮地茶黃酮低劑量組大鼠血清LN水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-1β 的影響

表2 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平的影響

2.3各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠肝臟顏色紅潤，光滑，柔軟，有光澤；模型組大鼠肝臟顏色灰黃，光滑度下降，表面結(jié)節(jié)狀，邊緣不規(guī)則，質(zhì)地硬，缺少光澤；各用藥組大鼠肝臟顏色、質(zhì)地、光滑度優(yōu)于模型組。顯微鏡觀察觀察病理切片，正常大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無變性壞死，肝竇有出血，匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞變性壞死，匯管區(qū)內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多，大量炎癥細(xì)胞浸潤，纖維增生明顯，部分有假小葉形成。矮地茶黃酮高劑量組、矮地茶黃酮中劑量組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞變性壞死輕、匯管區(qū)毛細(xì)血管增生不明顯，纖維化程度輕，小葉結(jié)構(gòu)較完整，纖維化程度與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。矮地茶黃酮低劑量組部分大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，變性壞死不明顯，匯管區(qū)毛細(xì)血管數(shù)量增多，炎細(xì)胞浸潤和纖維化程度改善不明顯，有假小葉形成，纖維化程度與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3及圖1。

表3 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠肝臟纖維化程度的影響(n)

注:A為正常組；B為模型組；C為矮地茶黃酮高劑量組；D為矮地茶黃酮中劑量組；E為矮地茶黃酮低劑量組。

2.4各組大鼠肝臟中Vimentin、α-SMA表達(dá)情況 利用Vimentin染色觀察各組大鼠肝臟細(xì)胞外基質(zhì)增生情況，模型組大鼠肝臟匯管區(qū)Vimentin彌漫陽性，染色范圍及強(qiáng)度均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，矮地茶黃酮高劑量組、矮地茶黃酮中劑量組大鼠肝臟細(xì)胞外基質(zhì)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，矮地茶黃酮低劑量組大鼠肝臟細(xì)胞外基質(zhì)降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4及圖2。利用α-SMA染色標(biāo)記活化的肝星狀細(xì)胞，觀察各組大鼠肝臟活化的肝星狀細(xì)胞增生情況，模型組大鼠肝臟染色范圍及強(qiáng)度明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，矮地茶黃酮高劑量組、矮地茶黃酮中劑量組大鼠肝臟活化的肝星狀細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，矮地茶黃酮低劑量組大鼠肝臟活化的肝星狀細(xì)胞降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4及圖3。

表4 矮地茶黃酮對肝纖維化大鼠肝臟中Vimentin、α-SMA表達(dá)的影響

注：A為正常組；B為模型組；C為矮地茶黃酮高劑量組；D為矮地茶黃酮中劑量組；E為矮地茶黃酮低劑量組。

注：A為正常組；B為模型組；C為矮地茶黃酮高劑量組；D為矮地茶黃酮中劑量組；E為矮地茶黃酮低劑量組。

2.5TNF-α、IL-1β與肝纖維化各指標(biāo)的相關(guān)性分析 模型組中，血清TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)水平與肝纖維化分級均呈正相關(guān)(r=0.906、0.814、0.811、0.748、0.811、0935、0.748、0.686，均P<0.05)；血清TNF-α 水平與IL-1β、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(guān)(r=0.740、0.797、0.746、0.898，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.898、0.704，均P<0.05)，血清TNF-α水平與LN水平無相關(guān)性(r=0.545，P>0.05)；血清IL-1β水平與HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(guān)(r=0.854、0.887、0.996、0.904，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.799、0.781,均P<0.05)。

矮地茶黃酮組中，血清TNF-α、IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)水平與肝纖維化分級均呈正相關(guān)(r=0.934、0.922、0.627、0.500、0.917、0.870、0.799、0.729，均P<0.05)；血清TNF-α水平與IL-1β、HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(guān)(r=0.922、0.645、0.515、0.957、0.941，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.804、0.712,均P<0.05)；血清IL-1β水平與HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平呈正相關(guān)(r=0.665、0.548、0.927、0.862，均P<0.05)，與肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.851、0.733,均P<0.05)。

3 討 論

肝纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。有研究表明，肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展與人體免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)，如作為機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞，在肝星狀細(xì)胞的增殖、活化中發(fā)揮著重要作用，而肝星狀細(xì)胞的增殖、活化在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮核心作用；巨噬細(xì)胞受到外界有害因素刺激時，其受體能將其識別并產(chǎn)生應(yīng)答，分泌大量轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子β1、TNF-α、IL-1β等炎癥因子，進(jìn)一步活化肝星狀細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積，巨噬細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子β1、白細(xì)胞介素等還能夠維持成纖維細(xì)胞的增殖與分化[9-10]。除巨噬細(xì)胞外，肝臟中的自然殺傷(NK)細(xì)胞和NKT細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等對肝星狀細(xì)胞的活化、增殖亦起著重要的調(diào)控作用[11]。總之，免疫細(xì)胞在損傷因子的刺激下，產(chǎn)生各種免疫因子，并通過刺激肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而影響肝纖維化，在肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。降低促纖維化免疫因子分泌、增加抑制纖維化免疫因子分泌，可能是防治肝纖維化的一個新的契機(jī)。中醫(yī)藥對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)具有很好的療效，深入研究其與免疫調(diào)節(jié)的作用及機(jī)制具有重要意義。

王磊等[12]利用清熱利濕的茵陳蒿湯治療二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，發(fā)現(xiàn)其能夠有效逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化,證實(shí)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的主要中醫(yī)方證為濕熱、瘀熱內(nèi)蘊(yùn)兼氣虛，因此，本研究在制備肝纖維化模型時采用二甲基亞硝胺進(jìn)行腹腔注射。結(jié)果顯示，模型組大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平明顯升高，細(xì)胞外基質(zhì)增加，肝臟出現(xiàn)纖維化、提示二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化模型成功，α-SMA表達(dá)表達(dá)增加證實(shí)肝星狀細(xì)胞活化在二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化的形成中發(fā)揮了重要作用。模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高，證實(shí)在二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠中存在著免疫系統(tǒng)功能紊亂，TNF-α、IL-1β與肝纖維化分級正相關(guān)，與肝纖維化血清學(xué)標(biāo)志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平正相關(guān)，與肝α-SMA、Vimentin的表達(dá)正相關(guān)，提示TNF-α、IL-1β在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，具體機(jī)制可能為促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖與活化，使細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，生成增加，最終導(dǎo)致肝纖維化。矮地茶黃酮高、中劑量組大鼠肝臟纖維化明顯得到改善，膠原纖維生成較少，活化的肝星狀細(xì)胞亦低于模型組，肝纖維化標(biāo)志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平降低，均提示矮地茶黃酮對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化有較好的防治作用。矮地茶黃酮低劑量組大鼠肝臟纖維化改善不明顯，膠原纖維生成、肝星狀細(xì)胞活化、肝纖維化標(biāo)志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平較模型組變化不明顯，亦提示矮地茶黃酮對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化的防治作用與劑量有關(guān)。治療組中，TNF-α、IL-1β水平低的大鼠，其肝纖維化級別也較低，肝纖維化標(biāo)志物HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平降低，Vimentin的表達(dá)水平降低，肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物α-SMA表達(dá)水平亦降低，提示矮地茶黃酮能通過降低固有免疫細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β水平，影響機(jī)體免疫功能，進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞增殖與活化，使細(xì)胞外基質(zhì)降解增加、生成減少，進(jìn)而阻止肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。