張 喆，陳俊杰，武冠廷，支 尹，陳國梁，董曉強，何宋兵

蘇州大學附屬第一醫(yī)院普外科,江蘇蘇州 215006

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,在所有癌癥相關(guān)病死率中的排名僅次于肺癌[1],特別是已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的晚期患者，5年生存率更是不足10%，且近年來發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。結(jié)腸癌具有高度異質(zhì)性的特點，即使同一類型具有相似特征的腫瘤也會出現(xiàn)不同的生物學行為。隨著精準醫(yī)療時代下全基因組測序技術(shù)的飛速發(fā)展,傳統(tǒng)的診療手段已經(jīng)不能滿足人們個體化治療的需求。因此從分子水平區(qū)分個體差異,探索腸癌相關(guān)特異性基因，是完善結(jié)腸癌診療及預后評估體系的重要途徑。

ANO1也被稱為跨膜蛋白16A(TMEM16 A)，是鈣激活的氯離子通道的分子基礎(chǔ)，該基因定位于染色體11q13，編碼具有8個結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白[3]。ANO1在體內(nèi)各組織中廣泛存在,參與不同的信號傳導途徑，調(diào)節(jié)跨膜離子轉(zhuǎn)運、細胞增殖、平滑肌收縮、神經(jīng)和心臟興奮性等多種生理功能[4]，近年來其在前列腺癌[5]、頭頸鱗癌[6]、食管鱗癌[7]、乳腺癌[8]等多類腫瘤的進展中發(fā)揮作用也已有證實[9-10]。ANO1在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)中的顯著表達，被作為GIST臨床診斷的特異性標志[11]，而有關(guān)ANO1在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義的報道相對少見。本課題組利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫研究了ANO1在結(jié)腸癌中的差異表達及其對患者預后的影響，旨在探討ANO1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，以期為精準醫(yī)療下結(jié)腸癌的個體化診療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)材料收集 從TCGA數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https://portal.gdc.cancer.gov/)下載結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達RNA-seq數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，得到RNA-seq研究樣本共437例，納入相關(guān)臨床樣本385例。

1.2數(shù)據(jù)整理和基因差異分析 整理RNA-seq樣本并使用R語言進行歸一化處理，同時對患者臨床數(shù)據(jù)進行篩選和整理，刪除臨床資料中失訪及目標信息不完整的病例。提取ANO1單基因樣本及相對應的臨床資料樣本，利用R語言Wilcox.Test方法鑒別目標基因在腫瘤和癌旁組織的表達差異。

1.3ANO1與臨床病理參數(shù)和預后的相關(guān)性分析 根據(jù)ANO1表達數(shù)據(jù)由低至高排列，以表達量中位數(shù)為界限分別定義高、低表達組，研究ANO1表達與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。將各樣本ANO1表達量和生存信息結(jié)合，利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫對結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集進行生存分析，進一步驗證ANO1的預后價值。

1.4基因集富集分析(GSEA) 使用GSEA 3.0版軟件對應分析ANO1高表達組和低表達組對相關(guān)基因集的影響。選用GSEA中c2.cp.kegg.V7.0.symbols.gmt 規(guī)范化基因集，運用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計方法，每次分析對基因組進行1 000次排列。

1.5統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學分析使用R3.6.1版本軟件。對ANO1基因在腫瘤組織和癌旁組織中表達量的差異分析采用R語言Wilcox.Test方法。采用Kruskal.Test和Logistic回歸方法分析基因表達與臨床特征的關(guān)系。結(jié)腸癌患者生存分析采用Kaplan-Meier曲線聯(lián)合Log-rank 檢驗，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。GSEA中將錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05且P<0.05作為顯著性富集的判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1ANO1在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達 對TCGA中ANO1在結(jié)腸癌癌旁組織(39例)和結(jié)腸癌腫瘤組織(398例)中的相對表達量分析顯示，在腫瘤組織中，ANO1的表達量明顯增高(P<0.01)，提示ANO1表達上調(diào)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。見圖1。

圖1 ANO1在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達

2.2ANO1表達與結(jié)腸癌臨床病理因素的相關(guān)性 將398例結(jié)腸癌腫瘤樣本ANO1 mRNA表達情況與相對應的臨床病理參數(shù)進行分析，結(jié)果顯示ANO1的表達與N分期即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，隨著N分期的升高ANO1相對表達量遞增(P<0.05)，見圖2。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，ANO1的表達量與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、分期，以及腫瘤是否突破肌層、是否存在遠處轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

圖2 ANO1相對表達量與N分期的相關(guān)性

表1 ANO1表達與結(jié)腸癌臨床病理因素的相關(guān)性分析

2.3ANO1 表達對結(jié)腸癌患者預后的影響 以ANO1相對表達量中位數(shù)為界將結(jié)腸癌患者分為高表達和低表達組，生存分析結(jié)果顯示，ANO1高表達和低表達患者1、3、5年生存率分別為0.83、0.70、0.52和0.90、0.82、0.70，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示ANO1高表達可能與結(jié)腸癌的不良預后有關(guān)，見圖3。單因素Cox分析結(jié)果提示，年齡、T分期、N分期、M分期及ANO1表達量能夠影響患者總體生存時間(P<0.05)，而性別對預后情況并無明顯影響。將以上因素納入Cox回歸模型進行多變量分析，結(jié)果顯示，除年齡外，只有ANO1表達量是患者預后的獨立影響因素(HR=1.03，95%CI：1.00～1.06，P=0.047)。見表2。

圖3 ANO1表達量與結(jié)腸癌患者預后的關(guān)系

表2 影響預后參數(shù)的單因素和多因素分析

2.4ANO1相關(guān)富集基因集 GSEA結(jié)果顯示，ANO1高表達樣本富集至鈣離子信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、WNT、JAK/STAT、HEDGEHOG、NOTCH 腸癌相關(guān)信號通路等基因集；同時，ANO1對胰腺癌、前列腺癌等多個癌癥通路的激活亦有促進作用，提示ANO1高表達可能與腸癌發(fā)生和進展密切相關(guān)。見表3。

表3 GSEA中ANO1相關(guān)富集基因集

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個多基因共同參與的多階段復雜過程，涉及遺傳學和表觀遺傳學相關(guān)分子表達的改變，具有高度異質(zhì)性[12]。結(jié)腸癌起病隱匿，多數(shù)患者出現(xiàn)臨床癥狀時已錯過最佳的治療時機。精準醫(yī)療的時代背景下，醫(yī)學研究者對于疾病的轉(zhuǎn)歸需要有更深層次的認識，因此，從基因水平研究結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，以期獲得更有效的預后標志物和治療靶點，是近年來結(jié)腸癌的研究熱點。

2008年，CAPUTO等[13]研究證實ANO1是經(jīng)典的鈣激活氯離子通道蛋白家族中的一員，腫瘤細胞內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運的異常對腫瘤細胞增殖和凋亡等活動有重要影響，上皮細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)被破壞及細胞膜表面離子通道表達異常是誘導癌癥進展的原因之一[14]。ANO1所位于的人類染色體11q13 區(qū)域，其在多種上皮組織來源癌癥中發(fā)生擴增和該區(qū)域部分基因在相關(guān)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，已引起眾多學者的關(guān)注。

ANO1通過其氯離子通道蛋白活性參與腫瘤細胞增殖和侵襲，影響相關(guān)腫瘤的進展[15]。LIU等[16]在前列腺癌的研究中，通過不同方法沉默內(nèi)源性ANO1可抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，證明了ANO1在前列腺癌腫瘤中過表達，并與腫瘤細胞增殖及高風險轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為前列腺癌診斷和預后的潛在生物標志物。一項關(guān)于頭頸鱗癌的研究表明，ANO1可作為頭頸鱗癌遠處轉(zhuǎn)移的標志物，是影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期分期的因素之一[17]。此外，ANO1在乳腺癌[8]、肺癌[18]等腫瘤中的促癌作用已被證實，ANO1過表達有望成為腫瘤不良預后的標志物[19]。SUI等[20]關(guān)于ANO1與結(jié)腸癌關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，敲除大腸癌ANO1后可明顯抑制腫瘤細胞的增殖。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫進一步驗證了ANO1在結(jié)腸癌中的表達對預后生存的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中ANO1表達明顯高于癌旁組織，ANO1高表達可促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與N分期相關(guān)。本研究結(jié)果與AYOUB等[17]和RODRIGO等[21]的結(jié)論相似。ANO1過表達促進癌細胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而增加患者不良預后的可能性。在進一步的生存和預后分析中可以看到，ANO1高表達結(jié)腸癌患者的遠期生存率顯著下降，是不良預后的獨立影響因素，進一步說明ANO1基因可作為評價結(jié)腸癌患者臨床預后的指標。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往受特定的信號轉(zhuǎn)導通路影響，鈣離子和氯離子通路參與細胞凋亡，在癌癥發(fā)生和進展中發(fā)揮作用[22-23]。MAPK信號通路在腫瘤的發(fā)生和進展中具有重要意義。通過自身氯離子通道活性來激活和影響MAPK細胞內(nèi)信號傳導通路可能是ANO1參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的另一條重要途徑[24]。此外，ANO1還可通過干擾CAMK、HEDGEHOG、EGFR等其他信號通路的活動來影響癌細胞的生物學行為[19]，部分結(jié)果在本研究中也得到了驗證。GSEA結(jié)果顯示，ANO1高表達樣本除了在鈣離子信號通路高度富集，同時也富集至MAPK、WNT、JAK/STAT、HEDGEHOG、NOTCH 等腸癌相關(guān)通路等基因集，不僅如此，ANO1對前列腺癌、胰腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌對多個癌癥通路的激活亦有促進作用。由此可以推測ANO1可以通過對多條信號通路的調(diào)節(jié)影響多種腫瘤的發(fā)生和進展。

綜上所述，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學分析，進一步證實了ANO1基因在結(jié)腸癌中高表達且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是結(jié)腸癌患者不良預后的標志物，補充了結(jié)腸癌的診療和預后體系。另外，ANO1參與調(diào)節(jié)多條癌癥相關(guān)信號通路有可能成為結(jié)腸癌靶向治療的新藥物靶點，為精準時代下個體化診療提供方向。本研究選擇的數(shù)據(jù)庫樣本量較大，數(shù)據(jù)庫的可信度較高，但仍存在不足之處，因TCGA數(shù)據(jù)庫所提供的數(shù)據(jù)均為mRNA水平，并不能完全反映ANO1在蛋白水平的實際表達情況，后續(xù)本課題組將結(jié)合病理免疫組織化學方法進一步研究和探討ANO1在結(jié)腸癌中的臨床意義及其相關(guān)分子機制。