王海濱，門慶玲，蔡艷麗，周文龍，郭海志，陳瑞祥

(資陽市第一人民醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科； 2.心血管內(nèi)科，四川 資陽 641300；3.云南省第三人民醫(yī)院 藥劑科，云南 昆明 650011)

缺血缺氧性腦損傷(hypoxia ischemia brain-damage，HIBD)是機體腦部因缺乏或限制氧氣和葡萄糖供應而造成結構損傷和功能紊亂，長時間的局部缺血可導致大腦嚴重或致命的損害[1]。在新生兒中，HIBD是導致其死亡和感覺運動、認知功能嚴重受損的主要因素[2]。目前，雖然大量學者對新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)進行研究，但其具體發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床治療缺乏特異性藥物。因此，從分子水平對HIE發(fā)病機制的研究對其臨床診治具有重要意義。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)不僅是機體抗氧化的主要調(diào)節(jié)因子，也是抗感染、解毒蛋白基因表達的細胞保護因子[3]，抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)是其主要靶點，血紅素加氧酶(heme oxyge-nase, HO-1)是ARE主要作用因子，Nrf2-ARE在腦損傷性疾病、帕金森等認知功能障礙性疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]。左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)是常見的抗癲癇藥，可以有效治療熱性驚厥所引起腦損傷[6]，但關于LEV對HIE的作用研究報道較少，本研究通過觀察LEV對HIBD新生大鼠的影響，探究其可能作用機制，為HIE的臨床診治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物: SPF級雄性SD大鼠50只，7日齡，體質(zhì)量15g左右[北京維通利華公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006，合格證號：0015675]。

1.1.2 試劑: LEV(上海邁瑞爾化學科技有限公司)白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α (TNF-α)ELISA試劑盒(Abcam公司)；丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；鼠單克隆抗Caspase-3抗體、鼠單克隆抗Bcl-2抗體(Santa Cruz公司)；兔源多克隆抗Nrf2抗體、兔源多克隆抗HO-1抗體、兔源單克隆抗GAPDH抗體(CST公司)；辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠免疫球蛋白(IgG)二抗(Abbkine公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 隨機挑選40只新生大鼠，參考文獻[7]構建HIBD新生大鼠模型，另選10只為sham組。將造模成功的40只新生大鼠隨機分成：model組(灌胃等量0.9%氯化鈉溶液)、L、M、H LEV組[灌胃10、30、50 mg/(kg·d)]，每組各10只，連續(xù)8 d，末次給藥24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 采集組織標本: 取小鼠眼球靜脈叢血，1 800 r/min離心10 min取血清，儲存于-20 ℃冰箱保存。取其腦部組織，剪取約0.5 g用于提取組織蛋白，儲存在-80 ℃冰箱中備用。剩余腦組織，用4%多聚甲醛溶液固定，做常規(guī)石蠟切片，備用。

1.2.3 HE染色觀察腦組織病理變化: 腦組織切片，脫蠟至水化，蘇木精染色、伊紅染液復染，脫水，透明，封片，鏡下觀察腦組織病理變化。

1.2.4 TUNEL檢測腦組織神經(jīng)元凋亡: 脫蠟至水化，TUNEL染色、脫水、透明、封片，鏡下觀察腦組織神經(jīng)元凋亡情況。TUNEL陽性胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒，鏡下隨機選取5個視野，計算每個視野凋亡率，凋亡率(%)=TUNEL陽性細胞/總細胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測血清中炎性因子IL-10、IL-6、TNF-α及氧化應激因子MDA含量、SOD活性: 取血清，用ELISA試劑盒分別檢測IL-10、IL-6、TNF-α、MDA的含量以及SOD活性表達，具體操作步驟參考其說明書。

1.2.6 Western blot檢測腦組織caspase-3、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表達: 提取腦組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調(diào)整上樣蛋白至50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜、加一抗(caspase-3、Bcl-2、Nrf2、HO-1、GAPDH，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日，加二抗室溫孵育2 h，洗膜，加ECL發(fā)光液，用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測蛋白吸光度信號，Image J軟件定量分析蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織病理學變化結果

model組大鼠腦組織細胞排列紊亂呈彌漫性分布，空泡化增加，出現(xiàn)炎性浸潤現(xiàn)象；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠腦組織細胞排列較整齊，組織病理改變明顯減少(圖1)。

2.2 LEV對各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響

與sham組相比，model組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2, 3)。

2.3 LEV對各組大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α的影響

與sham組相比，model組血清中IL-6、TNF-α表達顯著升高(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠血清中IL-6、TNF-α表達顯著降低(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠血清中IL-6、TNF-α表達顯著降低(P<0.05)(圖4)。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色圖

圖2 各組大鼠腦組織TUNEL染色圖Fig 2 TUNEL staining of brain tissue of rats in each group(scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group圖3 LEV對各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率的影響Fig 3 Effects of LEV on the apoptosis rate of neurons in brain tissue of rats in each

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group圖4 LEV對各組大鼠血清中炎性因子IL-6、 TNF-α的影響Fig 4 Effects of LEV on inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in serum of rats in each group

2.4 LEV對各組大鼠血清中氧化應激因子MDA含量、SOD活性的影響

與sham組相比，model組大鼠血清中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group圖5 LEV對各組大鼠血清中氧化應激因子MDA含量、 SOD活性的影響Fig 5 Effects of LEV on MDA and SOD expression in serum of rats in each n=10)

2.5 LEV對各組大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達的影響

與sham組相比，model組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖6)。

2.6 LEV對各組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

與sham組相比，model組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與model組相比，LEV低、中、高濃度組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與LEV低、中濃度組相比，高濃度組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖7)。

3 討論

HIE是引起新生兒腦損傷，導致其死亡的重要原因之一，腦部缺氧缺血性發(fā)作與胎齡、 代謝、 腦部感染、持續(xù)性腦損傷等多種因素有關[8]，臨床HIE患者出現(xiàn)不同程度腦水腫，神經(jīng)細胞病變、腦組織壞死等病理變化[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，model組大鼠腦組織細胞排列紊亂呈彌漫性分布，細胞空泡增加，出現(xiàn)炎性浸潤，與報道一致[7]，提示HIBD新生大鼠model構建成功。HIE存活者常出現(xiàn)智力障礙、癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病后遺癥，嚴重危害患者的生命健康和生活質(zhì)量。LEV對新生兒缺氧缺血性腦病引起的癲癇發(fā)作有治療作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，HIBD新生大鼠的病理癥狀明顯減輕，提示LEV對HIBD癥狀有一定緩解作用。

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 ompared with the LEV medium concentration group

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group

腦部局部缺血引起原發(fā)性損傷，由于細胞凋亡、炎性因子紊亂導致腦損傷，加劇腦病，IL-6、TNF-α是炎性反應中重要調(diào)控因子。LEV可以減輕HIBD新生大鼠體內(nèi)炎性反應[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著降低，提示LEV可以抑制炎性反應因子IL-6、TNF-α分泌，減輕機體炎性反應。Caspase-3是促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，共同調(diào)控細胞凋亡機制。LEV可以抑制腦缺血再灌注損傷后促凋亡蛋白表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率、caspase-3蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，提示LEV可以抑制Caspase-3蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達，抑制HIBD腦組織神經(jīng)元細胞凋亡。

氧化應激是引起新生兒腦損傷的重要因素，細胞中促氧化劑和抗氧化劑之間比例不平衡造成氧化應激發(fā)生，MDA和SOD是評估氧化應激的生化標志物。在小兒癲癇痰火擾神證中LEV可抑制MDA含量，促進SOD活性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠血清MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，提示LEV可以調(diào)控MDA、SOD蛋白表達，減輕HIBD新生大鼠體內(nèi)氧化應激反應。Nrf2是機體抗氧化保護機制中重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以編碼抗氧化劑酶HO-1，不僅可以防止氧化損傷，調(diào)節(jié)細胞凋亡，還調(diào)節(jié)炎性以及促進血管生成[14]。研究顯示，LEV可以通過調(diào)控Nrf2-ARE通路，使HO-1蛋白表達增多，起到抗癲癇的作用[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高，提示LEV可通過降低MDA含量，升高SOD活性，發(fā)揮抗氧化作用可能與Nrf2-ARE通路激活有關。

綜上所述，LEV可抑制腦細胞凋亡，減輕HIBD新生大鼠體內(nèi)炎性反應和氧化應激反應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，可能與Nrf2-ARE通路激活有關，但其具體作用機制需進一步研究。