王海燕，黃明全，潘廣銳，汪貴林，梁 斌，權(quán) 毅

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 乳腺外科，四川 瀘州 646000)

女性惡性乳腺腫瘤現(xiàn)已成為世界公認的衛(wèi)生問題，2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)是乳腺癌的獨立危險因素，患2型糖尿病的女性患乳腺癌的風險較未合并糖尿病的女性提高了約17%[1]。合并2型糖尿病乳腺癌患者預(yù)后較差，促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在機制仍未清晰。研究表明，腫瘤低氧微環(huán)境是惡性腫瘤的基本特征之一，局部微環(huán)境低氧對腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的發(fā)生有顯著影響[2]。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)通過上調(diào)靶基因在促腫瘤發(fā)生中起重要作用，這些靶基因涉及能量代謝、血管生成、細胞存活、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥[3]。蛋白酶激活受體(protease activated receptor，PAR)-1的異常表達與腫瘤的侵襲性以及癌細胞的存活率有關(guān)，缺氧增強了乳腺癌細胞中PAR-1的表達[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可由多種細胞分泌，包括癌細胞和外周血單個核細胞，在低氧環(huán)境中受HIF-1α調(diào)控[5]。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中HIF-1α、PAR-1、VEGF表達異常，但其在低氧微環(huán)境下對乳腺癌生物學(xué)行為的影響尚缺乏深入的研究[3-5]。因此，本研究分析合并2型糖尿病乳腺癌組織中HIF-1α、PAR-1、VEGF表達及低氧微環(huán)境對MCF-7細胞侵襲和增殖及HIF-1α、PAR-1、VEGF表達的影響，對指導(dǎo)此類乳腺癌患者的個性化治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源：選擇2016年1月至2019年6月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院合并2型糖尿病乳腺癌手術(shù)切除送檢的標本37份，同期手術(shù)切除的乳腺癌癌旁組織作為對照。其中乳腺癌組織標本來源患者年齡31～69歲，平均(46.9±11.2)歲。所有患者均經(jīng)組織病理和影像學(xué)檢查確診；手術(shù)治療前均未行放化療治療，均為首次確診，入院前無惡性腫瘤病史及慢性傳染性疾病史。標本來源患者年齡無顯著差異。所有樣本已獲得西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的審查批準及受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑：人源性乳腺癌細胞系MCF-7(中科院上海細胞生物所細胞庫)，細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，胎牛血清(Hyclon公司)，青霉素、鏈霉素(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RNA提取試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，SYBR Green熒光染料試劑盒(Roche公司)，引物序列(上海生工生物技術(shù)有限公司)，抗-HIF-1α、-PAR-1、-VEGF、-β-catin抗體(一抗)和抗IgG抗體(二抗)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測HIF-1α、PAR-1、VEG表達：固定的組織經(jīng)脫蠟、水合、熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)后，加入HIF-1α、PAR-1、VEGF一抗，室溫培養(yǎng)1 h。使用生物素標記的二抗，新鮮配置的DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用奧林巴斯-Bx41顯微鏡觀察，并用Image-Pro Plus軟件進行分析。

1.2.2 計數(shù)微血管密度(microvessel density，MVD)：切片通過低倍光鏡視野下選取血管分布最為集中的高血管密度區(qū)域，在高倍鏡視野下觀察CD34呈棕黃色的血管數(shù)量，隨機選取5個視野進行計數(shù)，以5個視野血管數(shù)的平均值計為該例腫瘤的MVD值，排除存在炎性反應(yīng)、壞死的血管。

1.2.3 乳腺癌MCF-7細胞的培養(yǎng)：將MCF-7置于10%小牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，取對數(shù)增殖期細胞，制成細胞懸液，調(diào)整濃度為2×107個/L，把細胞懸液按每孔150 μL接種于96孔板，分為對照組(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、低氧組(1% O2，5% CO2，94% N2)、高糖低氧組(30 mmol/L葡萄糖+1% O2，5% CO2，94% N2)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，低氧組設(shè)置參數(shù)于三氣培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，于培養(yǎng)24及48 h后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、拍照。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖：將細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，肉眼觀察細胞孔中顏色由黃色變成深橙色，通過酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞侵襲：細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用不含血清的細胞培養(yǎng)液把細胞調(diào)整為1×104個/mL，在實驗前3 h，取基質(zhì)膠加入到Transwell小室中，于37 ℃孵育濕化3 h，待基質(zhì)膠凝固后，在小室中加入不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育40 min，取適量的細胞懸浮液加入Transwell小室中，放在24孔板中，小室外側(cè)加入細胞培養(yǎng)液，37 ℃孵育48 h后，用PBS洗滌Transwell小室，把沒有穿膜的細胞用棉簽擦掉，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色30 min，隨機選取每孔6個視野，并通過顯微鏡觀察侵襲細胞數(shù)。

1.2.6 RT-qPCR檢測HIF-1α、PAR-1、VEGF mRNA：RNA提取試劑盒提取各組細胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR儀進行RT-qPCR。引物序列：HIF-1α：上游5′-CATCCAAGAAGCCCTA ACGTGT-3′，下游5′-TTAACTTGATCCAAAGCTCTG AG-3′；PAR-1：上游5′-GCCTGCTTCAGTCTGTGCG-3′，下游5′-CAATCACTGCCGGAAAAGTA-3′；VEGF：上游5′-ATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA-3′，下游5′-GGGCACACAGGATAACTTGAAGATGT-3′；GADPH：上游5′-ATCCCATCACCATCTTCCCA G-3′，下游5′-CCATCACGCCAGTTTTCC-3′，以GAPDH內(nèi)參。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸20 s，40個循環(huán)，2-△△CT用于定量比較。

1.2.7 Western blot檢測HIF-1α、PAR-1、VEGF蛋白表達：RIPA裂解液提取細胞總蛋白，在冰上裂解細胞，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，加熱使蛋白樣品變性，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h。一抗HIF-1α、PAR-1、VEGF均1∶500稀釋和β-catin在4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h。以β-actin為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒暗室顯色，通過Image-ProPlus軟件分析吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中HIF-1α、PAR-1、VEGF表達及MVD計數(shù)

乳腺癌組織HIF-1α、PAR-1、VEGF表達及MVD計數(shù)均明顯高于癌旁組織(P<0.05)(圖1A～H)。

2.2 低氧、高糖對MCF-7細胞形態(tài)的影響

與培養(yǎng)24 h相比，48 h各組細胞的數(shù)量明顯增多(P<0.01)(圖2)。

2.3 低氧、高糖對MCF-7細胞侵襲和增殖的影響

與對照組比較，低氧高糖組MCF-7穿過基膜的細胞數(shù)及細胞存活率明顯升高(圖3A～C)。

2.4 低氧、高糖對MCF-7細胞HIF-1α、PAR-1、VEGF表達的影響

低氧組、低氧高糖組HIF-1α、PAR-1、VEGF mRNA及蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.05)(圖4A,B)。

3 討論

乳腺癌是女性癌死亡的主要原因之一，嚴重威脅著女性健康[1]。隨著腫瘤細胞的不斷增殖，細胞的耗氧量隨之不斷增加，使得腫瘤局部微環(huán)境低氧。由于合并2型糖尿病乳腺癌患者長期處于高糖微環(huán)境，從而加深組織缺氧，促進腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。因此，探討相關(guān)因子在低氧、高糖微環(huán)境下與乳腺癌的相關(guān)性對指導(dǎo)乳腺癌個性化治療具有重要意義。

HIF-1通過上調(diào)靶基因參與能量代謝、血管生成、細胞存活、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥，HIF-1α已被確定為癌治療的重要分子靶點，可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞低氧激活VEGF的表達促進血管生成[7]。在胰腺癌中HIF-1α呈高表達并抑制其表達后可延緩胰腺癌的發(fā)展[8]。HIF-1α在胃癌病灶中的表達明顯高于癌旁組織，且在胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[9]。

A.expression of HIF-1α in breast cancer and paracancer tissues; B.expression of PAR-1 in breast cancer and paracancer tissues; C.expression of VEGF in breast cancer and paracancer tissues; D.MVD count in breast cancer tissues and paracancerous; E.protein expression of HIF-1α in breast cancer and paracancer tissues; F.protein expression of PAR-1 in breast cancer and paracancer tissues; G.protein expression of VEGF in breast cancer and paracancer tissues; H.MVD count in breast cancer tissues and paracancerous; *P<0.05, **P<0.01 compared with paracancerous

圖2 低氧、高糖對MCF-7細胞形態(tài)和侵襲的影響Fig 2 Effect of hypoxia and high glucose on morphology and invasion of MCF-7 cells

A.cell invasion; B.number of migrated cells; C.cell proliferation; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.expression of HIF-1α, PAR-1 and VEGF mRNA in MCF-7 cells; B.protein expression of HIF-1α, PAR-1 and VEGF in MCF-7 cells; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

此外，HIF-1α在乳腺癌組織中廣泛表達，且與乳腺癌病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]。本研究顯示，乳腺癌組織中HIF-1α呈高表達，提示其參與乳腺癌的發(fā)展。PARs可介導(dǎo)凝血酶的許多細胞效應(yīng)，在多種細胞中促進增殖、存活，PAR-1是主要的受體，已證明PAR-1與細胞存活有關(guān)[11]。低氧微環(huán)境下PAR-1可能是黑色素瘤細胞的生存因子，通過siRNA-PAR-1轉(zhuǎn)染黑色素瘤裸鼠發(fā)現(xiàn)腫瘤縮小、肺轉(zhuǎn)移灶減少[12]。本研究顯示，乳腺癌組織中PAR-1高表達，提示其與腫瘤進展相關(guān)。VEGF是血小板衍生生長因子家族的一員，參與腫瘤血管生成的發(fā)生和發(fā)展，VEGF水平升高是腫瘤細胞侵襲性的征兆，并且與相對較差的預(yù)后相關(guān)[13]。本研究顯示，乳腺癌組織中VEGF呈高表達，提示其參與乳腺癌的進展。研究顯示HIF-1α與VEGF在腫瘤中的表達呈正相關(guān)，阻斷癌細胞HIF-1α表達可降低VEGF表達并抑制移植腫瘤的生長[14]。抑制HIF-1α可導(dǎo)致乳腺癌MDA-MB-231細胞PAR-1表達顯著降低[15]。提示HIF-1α、PAR-1、VEGF能夠通過相互調(diào)控參與腫瘤進展。盡管低氧代表微環(huán)境壓力，但腫瘤細胞在低氧微環(huán)境中存活和增殖。本結(jié)果顯示，HIF-1α、PAR-1、VEGF在低氧、高糖MCF-7細胞中過表達，由于細胞遷移的調(diào)節(jié)是腫瘤侵襲性的關(guān)鍵步驟，結(jié)果表明在低氧、高糖微環(huán)境下細胞增殖、侵襲明顯增強。因此，低氧、高糖條件下HIF-1α、PAR-1、VEGF的激活可以保護乳腺癌細胞免于死亡。

綜上所述，合并2型糖尿病乳腺癌組織中HIF-1α、PAR-1、VEGF存在過度表達現(xiàn)象，參與其發(fā)病過程，MCF-7細胞學(xué)實驗證明低氧、高糖環(huán)境能夠使HIF-1α、PAR-1、VEGF激活并促進MCF-7細胞的增殖和侵襲。