孫志超，王秀芝，楊舒慧，浦 洋*

(1.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生理學系，北京 100005；2.中國科學院北京基因組研究所(國家生物信息中心) 精準醫(yī)學重點實驗室，北京 100020)

腎癌(kidney cancer)是泌尿系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤，目前，占全球成人惡性腫瘤的5%左右，且發(fā)病率逐年上升[1]。約80%的腎癌被臨床診斷為腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)[2]。大約30%的腎細胞癌患者在初診時就有轉(zhuǎn)移性病灶[3]。20%～40%的術(shù)后病例會發(fā)生局部復發(fā)[4]。此外，傳統(tǒng)的化學藥物治療和放射治療對腎透明細胞癌的治療基本無效[5]。因此，迫切需要進一步理解腎透明細胞癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制，以識別新的生物標志物和開發(fā)更有效的治療腎透明細胞癌的方法。

RNF43是一種E3泛素化連接酶[6]。RNF43缺失能激活Wnt/β-catenin信號通路[6-8]。RNF43在癌發(fā)生過程中的促進或抑制作用頗受爭議。RNF43在肝癌中起促進作用，而在胰腺癌、胃癌和大腸癌中起抑制作用[7,9-10]。但是RNF43對腎透明細胞癌細胞生物學功能的影響尚不清楚，其是否參與腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展，以及其在臨床診斷與治療中的作用有待探究。

本研究重點探討RNF43對腎透明細胞癌增殖、遷移和侵襲的影響，為腎透明細胞癌發(fā)生的分子機制、診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人腎透明細胞癌細胞系786-O(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑：胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Corning公司)；β-actin抗體(Santa Cruz 公司)；β-catenin和 Non-phospho (Active) β-catenin抗體(Cell Signaling Technology公司)；DDK抗體、RNF43過表達質(zhì)粒和空載質(zhì)粒(OriGene公司)；抗兔和鼠的熒光二抗(LI-COR公司)；CCK-8 試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Roche公司)；VigoFect 高效真核轉(zhuǎn)染試劑(威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司)；LGK974(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 TCGA突變數(shù)據(jù)庫分析: 使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析人腎透明細胞癌組織中的基因表達。

1.2.2 細胞的培養(yǎng)及分組干預：用90% RPMI1640 培養(yǎng)基+10%血清+1%青霉素鏈霉素雙抗配制成的細胞培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)786-O細胞。細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿(生長面積21 cm2)中，待細胞增殖至70%～80%時，進行RNF43質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染或用Wnt通路抑制劑LGK974處理。

1.2.3 免疫印跡實驗：收集相關(guān)處理組別的細胞，加入適量RIPA細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，冰上裂解30 min。13 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清總蛋白混合液到一個新的1.5 mL離心管中，用BCA法測定蛋白樣品濃度。用5×蛋白上樣緩沖液稀釋蛋白樣品，95 ℃加熱10 min使其變性。每組取15～30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，利用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。最后使用Odyssey CLx成像系統(tǒng)對蛋白條帶進行檢測。利用β-actin蛋白作為內(nèi)參對照，進行相關(guān)組別蛋白表達定量。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖: 取96孔板，每孔加入2 000個細胞，每組6個復孔。待細胞貼壁后第0、24、48和72 h，使用CCK-8試劑盒測定細胞在450 nm波長的吸光度值，繪制細胞增殖曲線，評估細胞活力。

1.2.5 克隆形成檢測細胞克隆形成：取6孔板，每孔加入200個細胞，每組3個復孔。10 d后棄去上清，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗后，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，拍照并統(tǒng)計克隆數(shù)。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移：取12孔板，將劃痕實驗插件放入12孔板內(nèi)，使其緊貼在底部。用完全培養(yǎng)基稀釋細胞至濃度為5×105個/mL，并吸取70 μL(約3 500個細胞)加入劃痕插件中，每組3個復孔，培養(yǎng)24 h。取出劃痕插件，用PBS輕柔漂洗細胞2～3次，然后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 0、10 h在顯微鏡下觀察拍照，測量并統(tǒng)計細胞間的劃痕面積。

1.2.7 Transwell小室檢測細胞侵襲：取24孔板，每孔加入600 μL完全培養(yǎng)基，放入Transwell小室，在小室中加入200 μL 無血清培養(yǎng)基，稀釋濃度為1.5 ×105個/mL細胞懸液，每組做3個復孔。培養(yǎng)14 h后取出Transwell小室，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定25 min，PBS洗滌后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦掉上層未遷移細胞。在顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)細胞并統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 RNF43在人腎透明細胞癌組織中低表達且與預后不良相關(guān)

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，與正常組織相比，人腎透明細胞癌組織中的RNF43顯著低表達，且隨著分期的進展進一步降低。RNF43高表達的腎透明細胞癌患者生存時間明顯比RNF43低表達患者長。

2.2 過表達RNF43抑制786-O細胞增殖

RNF43過表達細胞與陰性對照組相比，RNF43表達上升，而細胞增殖能力與集落形成能力均明顯降低(圖1)。

2.3 過表達RNF43抑制786-O細胞遷移和侵襲

與陰性對照組相比，RNF43過表達組的細胞遷移和侵襲能力均明顯減弱(圖2A,B)。

2.4 過表達RNF43抑制786-O細胞Wnt/β-catenin通路

與對照組相比，RNF43過表達組Wnt/β-catenin通路中，β-catenin和non-phospho (active) β-catenin的表達顯著降低(P<0.05)(圖3)。

2.5 Wnt抑制劑抑制786-O細胞增殖

Wnt抑制劑LGK974處理786-O細胞后，β-catenin、 non-phospho (active) β-catenin和RNF43的表達顯著降低(P<0.05)(圖4A,B)。LGK974處理組與對照組相比，細胞增殖能力與集落形成能力均明顯降低(圖4C,D)。

A.protein level of RNF43 in control and RNF43 over-expression group; B.effect of RNF43 over-express on proliferation of renal clear cell carcinoma; C.effect of RNF43 over-express on clone formation ability of renal clear cell carcinoma; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group

A.effect of RNF43 over-express on migration of renal clear cell carcinoma; B.effect of RNF43 over-express on invasion of renal clear cell carcinoma; *P<0.001 compared with control group

protein level of β-catenin and non-phospho (active) β-catenin in control and RNF43 over-expression group; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group

3 討論

腎透明細胞癌約占腎臟惡性腫瘤的80%，是全球常見的惡性腫瘤之一[1-2,5]。世界上有超過40萬人遭受此病的困擾,造成每年約17.5萬人死亡[11]。由于治療選擇有限，治愈晚期和轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌仍然是一個挑戰(zhàn)，5年存活率僅為12%[1]。因此，進一步研究腎透明細胞癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制尤為重要。

A.protein level of β-catenin and non-phospho (active) β-catenin in control and LGK974 treated group; B.RNF43 expression in control and LGK974 treated group; C.effect of LGK974 on proliferation of renal clear cell carcinoma; D.effect of LGK974 on clone formation ability of renal clear cell carcinoma; *P<0.05,**P<0.001 compared with control group

本研究探討了RNF43在腎透明細胞癌中的表達規(guī)律、臨床意義和生物學功能，包括對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。RNF43在癌發(fā)生發(fā)展中的作用頗有爭議。先前的報道表明，在肝癌中RNF43可以促進癌的發(fā)生發(fā)展，在胰腺癌、胃癌和大腸癌中RNF43可以抑制癌的發(fā)生發(fā)展[7,9-10]。然而，這樣一個有趣的基因在腎癌中的作用還未被研究。本研究發(fā)現(xiàn)，RNF43在腎透明細胞癌組織中表達降低，且與患者預后不良相關(guān)。提示RNF43在腎透明細胞癌中可能起抑癌作用。本研究的細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲實驗均證明了這一假設，過表達RNF43抑制了腎透明細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

多項研究表明，RNF43能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路[6-8]。本研究在786-O細胞中也證明了這一點。為探究過表達RNF43抑制786-O細胞的增殖、遷移和侵襲是否與Wnt/β-catenin信號相關(guān)。本研究對786-O細胞給予LGK974處理。LGK974是一種PORCN抑制劑，可以特異性地抑制Wnt蛋白的分泌，并阻斷RNF43突變PDAC細胞系來源的小鼠異種移植的生長[7]。該抑制劑目前正在進行1期臨床試驗(NCT01351103)，用于治療Wnt配體依賴的惡性腫瘤患者。結(jié)果表明，LGK974處理同過表達RNF43帶來了一致的效果，即抑制了786-O細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究首次揭示了人腎透明細胞癌中RNF43下調(diào)，且與預后不良相關(guān)。RNF43能夠通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路來抑制人腎透明細胞癌786-O細胞的增殖、遷移及侵襲。因此，RNF43可作為腎透明細胞癌預后的指標，且可對RNF43低表達的腎透明細胞癌的患者給予Wnt抑制劑LGK974進行聯(lián)合治療。