楊倩，湯靜潔，朱艷嬌，黃俊生，孟飛，黃冬婷，項輝*

（1.中山大學生命科學學院，廣東廣州510006；2.廣東省科學院生物工程研究所，廣東廣州510316；3.廣東省綠色制糖工程技術研究中心，廣東廣州510316）

多廿烷醇（policosanol），是由C20 到C34 等多種飽和一元脂肪醇組成的混合物，主要從甘蔗蠟、蜂蠟、米糠中獲得，從甘蔗蠟提取的多廿烷醇中，二十八烷醇的含量最高，占比約為60%～70%[1-2]。自古巴學者報道多廿烷醇可降血脂以來，許多學者指出，多廿烷醇能顯著降低血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平，同時還能升高高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的水平，具有顯著的降脂效用，而且具有良好的耐受性和極高的安全性[3-8]。此外，多廿烷醇還能預防和治療動脈血栓、血管內(nèi)皮功能不良、動脈粥樣硬化、間歇性跛行等諸多心血管疾病[9-11]。然而，也有研究者報道了動物實驗和臨床試驗中的陰性結果[12-16]，這引起了人們對多廿烷醇降脂功能的質(zhì)疑。

血脂異常是造成心血管疾病的主要因素之一，合理應用他汀類藥物可以降低膽固醇水平[17-18]，但是許多患者在接受了較大劑量他汀治療后，膽固醇水平仍不能得到有效控制[19]；而且他汀類藥物會對部分患者造成肝臟功能和骨骼肌損害，甚至有誘發(fā)骨骼肌溶解導致患者死亡的危險，此外還有致血糖異常和誘導糖尿病的風險[20]。近年來，膽固醇吸收抑制劑依折麥布作為一種新型調(diào)酯藥物，在治療高膽固醇血癥中發(fā)揮的作用正日益受到關注[21-22]。受此啟發(fā)，結合先前的研究，本文探討了多廿烷醇對腸道膽固醇吸收的影響，進一步說明其降脂作用效果，并嘗試分析其降脂機制。

1 材料方法

1.1 實驗動物

5 周齡～6 周齡、7 周齡～8 周齡SPF 級健康SD 雄性大鼠、5 周齡～6 周齡KM 雄性小鼠：中山大學實驗動物中心，喂食基礎飼料或高脂飼料（配方：蔗糖20%、豬油15%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預混料0.4%、基礎飼料52.2%），所有動物實驗均按中山大學實驗動物管理和使用委員會以及中山大學實驗動物倫理委員會的實驗指導原則進行。

1.2 藥品與試劑

膽固醇標準品、辛伐他汀陽性對照藥：大連美侖生物技術有限公司；甲醇（色譜級）、正己烷（色譜級）：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、異丙醇（色譜級）：廣州化學試劑廠；吐溫80：sigma 公司；多廿烷醇：廣東省科學院生物工程研究所。由于多廿烷醇極不溶于水，在配制時，先按照配制體積的10%加入無水乙醇，沸水浴加熱1 min 使其充分溶解，后加入吐溫80 一滴，充分搖勻，加水至總體積，漩渦振蕩15 min，再超聲30 min，即得多廿烷醇溶液，同時配制不加多廿烷醇的上述溶液作為溶媒劑（10%乙醇）。

1.3 多廿烷醇對喂食高脂飼料7 d 小鼠膽固醇吸收的影響

39 只雄性KM 小鼠，22 g～28 g，分成正常對照組、模型對照組、溶媒組、多廿烷醇低、中、高劑量組，其中前3 組每組6 只，后3 組每組7 只，正常對照組喂食常規(guī)飼料，其他組連續(xù)喂食高脂飼料7 d。第8 天，正常對照組和模型對照組用生理鹽水灌胃，溶媒組用溶媒劑灌胃，多廿烷醇低、中、高3 組的給藥劑量分別為10、20 mg/kg 和100 mg/kg，灌胃體積均為0.2 mL/10 g。于6、12、18、24 h 收集每組糞便測定膽固醇含量，收集糞便過程中動物正常喂食。實驗結束后，取血測定總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）指標。

1.4 多廿烷醇對喂食高脂飼料10 d 大鼠膽固醇吸收的影響

雄性SD 大鼠36 只，150 g～180 g，隨機分成6 組，每組6 只，包括正常對照組、模型對照組、溶媒組和多廿烷醇低、中、高劑量組。除正常對照組用基礎飼料喂養(yǎng)外，其余5 組均用高脂飼料喂養(yǎng)，其他條件均一致，飼養(yǎng)10 d。第11 天正常對照組和模型對照組用生理鹽水灌胃，溶媒組用溶媒劑灌胃，多廿烷醇低、中、高3 個劑量組的給藥劑量分別為10、20 mg/kg 和50 mg/kg，灌胃體積均為1 mL/100g。給藥結束后，以6 h 為單位，收集各組大鼠24 h 糞便測定膽固醇，給藥后24 h 動物不再喂食飼料，實驗結束時取血測定TC、TG 指標。

1.5 多廿烷醇對喂食高脂飼料30 d 大鼠膽固醇吸收的影響

雄性SD 大鼠30 只，180 g～220 g，隨機分為6 組，每組5 只，具體的分組、飼養(yǎng)及給藥情況與1.4 一致，在高脂飲食時同時進行灌胃給藥并持續(xù)30 d。每天稱重，記錄體重變化。給藥期間，每7 d 收集一次每組大鼠一晝夜（24 h）的糞便測定膽固醇含量，共收集4 周。實驗結束后，均按50 mg/kg 劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，下腔靜脈取血，所有血液于常溫（25 ℃）放置20 min，而后3 000 r/min 離心15 min，得新鮮無溶血血清，測定TC、TG、HDL-C、LDL-C 等血脂指標。

1.6 相關指標測定

參照曹曉鋼等的方法處理糞便[23]，具體為將所收集到的糞便進行干燥處理，并用研缽將糞便充分碾磨混勻后，準確稱取200 mg 于15 mL 離心管中，加入10 mL 甲醇超聲30 min，1 500 r/min 離心15 min，取上清，0.45 μm 有機濾膜過濾，濾液作為供試品溶液，采用高壓液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定膽固醇濃度，具體條件如下[23]：色譜條件，色譜柱ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶異丙醇（80 ∶20，體積比），檢測波長210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量為10 μL。

采用全自動血脂測試儀對血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 進行測定。大鼠實驗的血脂測定由廣州金域醫(yī)學檢驗中心完成。

2 結果與分析

2.1 HPLC 測定結果

膽固醇標準品HPLC 色譜圖及樣品色譜圖見圖1。膽固醇定量標準曲線見圖2。

圖1 膽固醇標準品HPLC 色譜圖及樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of cholesterol standard and sample

圖2 膽固醇定量標準曲線Fig.2 Quantitative standard curve of cholesterol

在HPLC 測定條件下，對膽固醇標準品進行色譜分析（圖1 A），得到此色譜條件下的膽固醇保留時間在10.5 min 左右，再對樣品進行色譜分析（圖1 B），可以看到目標物質(zhì)與膽固醇標準品的出峰時間一致，且與非目標物質(zhì)的分離度良好，證明該條件適合試驗樣品的分析，能達到測定要求，再對一系列濃度梯度的膽固醇標準品分析之后制得標準曲線（圖2）。

此外，在此HPLC 條件下，進行以下試驗：取某一樣品，每4 h 進樣1 次，共進樣5 次，進行穩(wěn)定性試驗；選取0.04 mg/mL 標準品溶液，連續(xù)進樣5 次，進行精密度試驗；準確稱取大鼠同一份糞便5 份，連續(xù)進樣5次，進行重復性試驗；取5 份濃度已知的樣品，分別加入等體積0.06 mg/mL 膽固醇標準品溶液，陸續(xù)進樣，進行加樣回收率測定試驗。膽固醇HPLC 測定的穩(wěn)定性、精密度和重復性試驗結果見表1，大鼠糞便中膽固醇加樣回收率測定結果見表2。

表1 膽固醇HPLC 測定的穩(wěn)定性、精密度和重復性試驗結果Table 1 The HPLC experimental results of stability，precision and reproducibility of cholesterol

表2 大鼠糞便中膽固醇加樣回收率測定結果Table 2 The results of recovery rate test of cholesterol in rat feces

從穩(wěn)定性試驗、精密度試驗和重復性試驗（表1）以及加樣回收率試驗（表2）得到的相對標準偏差來看，儀器性能良好，試驗數(shù)據(jù)具有很強的可信度。

2.2 多廿烷醇單次給藥對喂食高脂飼料7 d 小鼠膽固醇吸收的影響

正常喂養(yǎng)的小鼠糞便中含一定量的膽固醇，這與動物膽固醇的代謝機理是一致的。正常情況下，腸道內(nèi)膽固醇75%來源于膽汁，25%源自食物[21]，動物糞便膽固醇一方面來自飼料中未被吸收的部分，但主要由未被吸收的腸道內(nèi)膽汁產(chǎn)生。多廿烷醇對喂食高脂飼料7 d 小鼠糞便膽固醇及血脂的影響見表3。

結果顯示，小鼠經(jīng)過7 d 高脂飼料喂養(yǎng)，糞便膽固醇濃度成10 倍以上增加，而血液中TC 和TG 含量分別增加了83%和34%，說明糞便膽固醇的增加主要源于高脂飼料中未被吸收的膽固醇，體現(xiàn)了機體物質(zhì)代謝平衡的機制。模型對照組與正常對照組比較，血脂TC、TG 均有顯著增加，說明高脂飼料對動物脂肪代謝影響較大。溶媒劑（10%乙醇）在灌胃的12 h 內(nèi)促進膽固醇吸收，因此使糞便中膽固醇濃度明顯減少，6 h 和12 h的糞便膽固醇含量僅為模型對照組的49%和54%，隨著乙醇代謝完畢，該數(shù)值逐漸升高至與模型對照組相近。與模型對照組相比，一次灌胃多廿烷醇3 個劑量均在12 h 內(nèi)增加了膽固醇的排出量，使糞便膽固醇濃度升高，其中6 h 的糞便膽固醇含量分別提升46%（P-10）、35%（P-20）和42%（P-100），12 h 后也有13%～24%的增長率。與模型對照組和溶媒組比較，多廿烷醇對血液中TC 含量未有明顯影響，但中、高劑量組血液中TG 含量顯著降低，表現(xiàn)出一定的降脂作用。

表3 多廿烷醇對喂食高脂飼料7 d 小鼠糞便膽固醇及血脂的影響Table 3 The effect of policosanol on fecal cholesterol and blood lipid in mice fed high-fat diet for 7 days

2.3 多廿烷醇單次給藥對喂食高脂飼料10 d 大鼠膽固醇吸收的影響

多廿烷醇對喂食高脂飼料10 d 大鼠糞便膽固醇及血脂的影響見表4。

正常大鼠糞便中同樣含有一定量的膽固醇（表4），這與小鼠一致。盡管糞便收集是一組一起收集，只有一個測定值，但這個測定值是一組6 只動物產(chǎn)生的，也反映一定的實驗規(guī)律。在利用高脂飼料喂食10 d后，進行灌胃給藥，然后禁食來研究藥物進入體內(nèi)后對于體內(nèi)代謝和排出膽固醇的情況。實驗結果證明了多廿烷醇在一定程度上能夠抑制機體對于膽固醇的吸收，促進了機體膽固醇的排泄。無論是正常對照組，還是高脂飼料喂食的模型對照組，在開始禁食的18 h內(nèi)，糞便膽固醇含量都是明顯降低的，這與膽固醇停止攝入有關。24 h 的糞便膽固醇濃度均有升高，而高脂飼料喂養(yǎng)的動物更明顯，說明高脂飼料喂養(yǎng)導致體內(nèi)膽固醇水平升高，排泄到腸道的也增多。對于高脂飼料喂食10 d 的大鼠，多廿烷醇3 個劑量組使糞便膽固醇濃度增加，抑制了食物中膽固醇的吸收；與溶媒組相比較，在24 h 時，P-10、P-20 和P-50 的膽固醇濃度分別升高了60%、81%和123%，這說明多廿烷醇也促進了體內(nèi)膽固醇的排出。本實驗結果說明，多廿烷醇能明顯抑制機體消化系統(tǒng)對膽固醇的吸收，也增加了機體對膽固醇的排泄。多廿烷醇高劑量組的TC 和TG水平比模型對照組和溶媒組顯著降低，尤其TG 已達到正常水平，可能是其對膽固醇代謝調(diào)節(jié)的結果。

表4 多廿烷醇對喂食高脂飼料10 d 大鼠糞便膽固醇及血脂的影響Table 4 The effect of policosanol on fecal cholesterol and blood lipid in rats fed high-fat diet for 10 days

2.4 多廿烷醇連續(xù)給藥對喂食高脂飼料30 d 大鼠膽固醇吸收的影響

多廿烷醇連續(xù)給藥對喂食高脂飼料30 d 大鼠糞便膽固醇含量的影響見表5。

表5 多廿烷醇連續(xù)給藥對喂食高脂飼料30 d 大鼠糞便膽固醇含量的影響Table 5 The effect of continuous administration of policosanol on cholesterol content in feces of rats fed with high-fat diet for 30 days

與2.2 和2.3 實驗結果一致，高脂飼料喂養(yǎng)，使動物糞便中膽固醇含量大幅增加，而且隨著高脂飼料喂養(yǎng)時間延長，大鼠糞便膽固醇含量也呈增加的趨勢，如表5 所示，模型對照組第4 周比第1 周糞便膽固醇含量明顯增多，增長量高達42%。結合2.2 和2.3 實驗結果，到第4 周時高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠糞便膽固醇濃度的增加表明動物排泄到腸道的膽固醇也增加了。溶媒組（10%乙醇）的結果顯示整體上每周24 h 糞便膽固醇濃度都比模型對照組高，這說明10%乙醇對動物膽固醇的代謝影響很大，糞便中膽固醇增加是機體膽固醇水平升高的結果。此外，發(fā)現(xiàn)多廿烷醇3 個劑量組中，糞便膽固醇含量大多數(shù)在溶媒組和模型對照組之間，一方面說明多廿烷醇對高脂飼料喂養(yǎng)動物脂肪代謝有一定調(diào)節(jié)作用，另一方面也說明多廿烷醇對乙醇影響膽固醇水平的作用有一定影響。

大鼠血脂四項水平見表6。

表6 大鼠血脂四項水平Table 6 The level of four blood lipids items mmol/L

30 d 后取血測定的血脂四項的結果大體上與糞便膽固醇測定結果相符。與正常對照組相比（表6），模型對照組血脂TC 和LDL-C 水平顯著升高，分別增加78%和335%，而HDL-C 水平降低了17%，表明高脂飼料影響了機體的脂肪代謝。而溶媒組（10%乙醇）與模型對照組比較，盡管血脂四項水平同樣處于異常，但幾項指標沒有顯著性差別，這可能與溶媒組動物有較高的膽固醇排出量有關，但這個機制尚不明確。與溶媒組相比，多廿烷醇3 個劑量組LDL-C 水平有下降，但在目前樣本量下沒有顯著性差別，綜合血脂TC 和HDL-C 結果來看，多廿烷醇對脂肪代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。

3 討論與結論

古巴學者的系列研究證明多廿烷醇具有極好的降脂作用，且沒有明顯的副作用，被譽為“血管的清道夫”，加之具有來源廣、低成本的特點，多廿烷醇已經(jīng)被作為第五大降脂藥物應用于臨床。隨著研究增加也出現(xiàn)了一些陰性結果，例如，美國[12]和德國[16]進行的隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗，分別以40 例和143例高血脂癥患者為研究對象，分成口服多廿烷醇20、40 mg/d 和80 mg/d 劑量和安慰劑8 周～12 周，結果顯示，治療組與對照組間血脂TC、TG 和HDL 水平變化無顯著性差異。為了進一步明確多廿烷醇的效果，為臨床應用提供明晰的依據(jù)，本文從機體的膽固醇代謝入手來探討多廿烷醇的作用。

動物機體（包括人）血液中膽固醇主要來源于肝臟與外周組織生物合成的內(nèi)源性膽固醇和食物的腸道吸收外源性膽固醇[21]。機體膽固醇的生物合成與腸道吸收處于一種代償平衡，生物合成受抑制時，吸收會增加，反之亦然。本文通過高脂飼料分別喂養(yǎng)小鼠7 d、大鼠10 d 和30 d，均顯著增加了動物糞便膽固醇排出量，也顯著增加了血脂水平。高脂飼料會大大促進食物中脂肪和膽固醇被動物吸收進入機體，導致血液TC 和TG 升高，而血液TC 水平上升后也會增加膽固醇的排出量，因此食物中未被吸收的膽固醇和膽汁排出的膽固醇都會使糞便膽固醇量增加。實驗發(fā)現(xiàn)，乙醇與高脂飼料同時存在，可促進動物對膽固醇的吸收，也許因為平衡的機制，膽固醇的排出也會增加。

在高脂喂食7 d 小鼠實驗和10 d 大鼠實驗中，多廿烷醇能顯著地增加動物膽固醇的排泄量，既能抑制膽固醇的吸收，也能增加高血脂大鼠對膽固醇的排出，這揭示多廿烷醇能對機體膽固醇的代謝產(chǎn)生影響。高脂喂食30 d，與溶媒組比較，多廿烷醇組膽固醇的排泄量減少，這可能是其通過其他機制降低了血液膽固醇水平，而使機體通過膽汁排泄膽固醇減少。結果表明多廿烷醇能發(fā)揮降脂作用，機制之一就是對膽固醇代謝的影響。

綜上所述，多廿烷醇具有一定的降脂作用，其降脂作用既可能與抑制膽固醇腸道吸收、調(diào)節(jié)膽固醇的代謝有關，也可能存在其他機制來降低血脂水平。