張盼盼，張麗芬，2，潘潤森，陳復(fù)生*，賴少娟

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052；2.河南省南街村（集團(tuán)）有限公司，河南漯河462600）

櫻桃番茄又稱圣女果、小番茄，因果實(shí)口味酸甜可口，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞。櫻桃番茄富含維生素C 和酚類化合物等活性成分，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗癌和減緩心血管病的作用。櫻桃番茄采摘后，果實(shí)的呼吸作用產(chǎn)生活性氧，激活苯丙氨酸解氨酶基因，促進(jìn)了果實(shí)中酚類化合物生物合成。但是，隨著貯藏時(shí)間延長，在氧化酶與活性氧作用下，維生素C和酚類化合物被消耗，含量下降[1-2]。因此，采用貯藏保鮮技術(shù)保持櫻桃番茄果蔬營養(yǎng)品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值具有重要意義。

超聲具有高效、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在采后果蔬保鮮中。研究發(fā)現(xiàn)，由于水的超聲分解而形成的自由基對植物細(xì)胞系統(tǒng)施加氧化應(yīng)激，并誘導(dǎo)更高的苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，苯丙烷代謝增強(qiáng)，使果蔬中酚類物質(zhì)含量增加[3]。此外，超聲處理能夠抑制果蔬中維生素C 含量的降低，并提高果實(shí)抗氧化能力[4]。超聲與浸漬保鮮聯(lián)合使用，在維持果蔬品質(zhì)特性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。常用的浸漬液有鈣溶液，鈣（Ca2+）在調(diào)節(jié)果蔬采后生理功能過程中起著關(guān)鍵作用。研究表明，鈣作為分子間結(jié)合劑，有助于維持果蔬硬度以及細(xì)胞膜穩(wěn)定性[5]。

因此，本文以櫻桃番茄為原料，研究超聲協(xié)同鈣浸漬處理對櫻桃番茄貯藏過程中酚類物質(zhì)和抗氧化能力的影響，通過對酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性分析，揭示超聲協(xié)同鈣浸漬提高櫻桃番茄品質(zhì)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

櫻桃番茄，品種“圣女1416”，采摘于河南省安陽市種植園。

乳酸鈣（食品級）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；甲酸、乙醇、乙腈（色譜級）：美國CBS 公司；沒食子酸、綠原酸、蘆丁、咖啡酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸（色譜級）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫超聲波清洗機(jī)（SBL-10DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)（GL-10000C）：上海安亭科學(xué)儀器廠；高效液相色譜儀（Waters 1525 Binary Pump）：美國Waters 公司；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Esquire LC）：德國Bruker 公司。

1.3 樣品處理

櫻桃番茄采摘后立即送往實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、成熟度相似的果實(shí)分組進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)共分為4組：對照組（CK 組，未處理的新鮮果實(shí)）；超聲組（U 組，20 W/L、15 ℃、15 min）；鈣浸漬組（Ca 組，2%乳酸鈣、15 ℃、15 min）和超聲協(xié)同鈣浸漬組（U+Ca 組，20 W/L、2%乳酸鈣、15 ℃、15 min）。處理后的樣品裝入帶孔保鮮盒，置于4 ℃環(huán)境中貯藏。

1.4 總酚

總酚測定參照Toor R K 等[6]方法。

1.5 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

取20 mg 冷凍干燥后的總酚樣品，溶于1 mL 流動相中（甲酸∶水=0.8∶99.2，體積比），樣品過0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 色譜柱，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，流動相A（甲酸-水，0.8∶99.2，體積比），流動相B（乙腈，100%），紫外檢測器在280 nm 和330 nm 處進(jìn)行檢測。梯度洗脫程序：0～10 min，5%B；10.01 min～25 min，15%B；25.01 min～40 min，20%B；40.01min～42min，40%B；42.01 min～50 min，0%B。

1.6 抗氧化能力

1，1-二苯基-2-吡啶并肼基自由基清除能力（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH） 測定參照Pataro G 等[7]方法。

1.7 酶活測定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測定參照Luh B S 等[8]方法。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測定參照Zhao R 等[9]方法。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性測定參照Yingsanga P 等[10]方法。

1.8 液質(zhì)聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析

酚類提取液經(jīng)AB-8 大孔吸附樹脂純化后進(jìn)行濃縮，凍干。凍干后的酚類樣品過0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件：同1.5（色譜柱Zorbax SB-C18）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI），離子源噴霧電壓為4.5 kV，毛細(xì)管溫度200°C，霧化器氮?dú)? psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氮?dú)饬魉?0 L/min，掃描范圍為m/z 50～1 000，負(fù)離子模式掃描。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010，SPSS 20 和GraphPad Prism 5 進(jìn)行處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄中酚類含量的影響

櫻桃番茄酚酸高效液相色譜（HPLC）結(jié)果見圖1。

酚類物質(zhì)是果蔬組織重要的次生代謝產(chǎn)物，HPLC分析結(jié)果顯示櫻桃番茄中含有沒食子酸、槲皮素、綠原酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、丁香酸和阿魏酸，其中沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸為主要酚酸。

圖1 櫻桃番茄酚酸色譜圖Fig.1 The chromatogram of phenolic acid in cherry tomatoes

超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酚類含量的影響見圖2。

圖2 超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酚類物質(zhì)含量的影響Fig.2 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on phenolics content of cherry tomatoes during storage

如圖2（a）所示，貯藏過程中，櫻桃番茄中總酚含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，并在第15 天達(dá)到最低值。貯藏10 d ～15 d，Ca 組和U+Ca 組的總酚含量顯著高于CK 組，超聲作用增強(qiáng)苯丙烷代謝，促進(jìn)酚類物質(zhì)的增加，同時(shí)鈣浸漬延緩了酚類物質(zhì)的消耗[3]。因此，超聲協(xié)同鈣浸漬技術(shù)具備維持較高總酚含量的作用。

超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸含量的影響如圖2（b～e）所示，沒食子酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸含量總體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，且在15 d 達(dá)到最高值，此時(shí)U+Ca 組各酚酸含量（26.64、1.70、1.22 μg/g）均顯著高于CK（22.59、1.08、0.78 μg/g）組。沒食子酸和對羥基苯甲酸含量在貯藏第0 天～第5 天呈下降趨勢，可能與果實(shí)消耗對羥基苯甲酸以抵御低溫逆境有關(guān)。綠原酸含量在貯藏第5 天達(dá)到最高值，此時(shí)U+Ca 組（3.97 μg/g）含量顯著高于CK 組（3.53 μg/g）。貯藏末期（30 d），U+Ca 組對羥基苯甲酸和阿魏酸含量（0.77 μg/g 和0.53 μg/g）顯著高于CK 組（0.41 μg/g 和0.23 μg/g）。結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬處理能夠有效延緩酚酸含量的降低。

2.2 超聲波協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酚類抗氧化能力的影響

超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酚類抗氧化能力的影響如圖3 所示。

由圖3 可知，櫻桃番茄貯藏期間抗氧化能力呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，與總酚含量變化相一致。果實(shí)中較高的酚類物質(zhì)含量能夠提供更多的基團(tuán)參與到與自由基的反應(yīng)中，提供更高的抗氧化能力[11-12]。整個(gè)貯藏期間，U+Ca 組DPPH 自由基清除率均顯著高于CK 組，且在貯藏15 d 以后，U+Ca 組DPPH 自由基清除率顯著高于Ca 組，表明超聲協(xié)同鈣浸漬處理能夠有效保持櫻桃番茄貯藏期間較高的抗氧化能力。

圖3 超聲波協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酚類抗氧化能力的影響Fig.3 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on the antioxidant capacity of phenols of cherry tomatoes during storage

2.3 超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酶活的影響

超聲協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酶活的影響研究見圖4。

由圖4 可知，貯藏過程中，櫻桃番茄PPO 和POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在貯藏第15 天達(dá)到最大值，與總酚含量變化趨勢一致。貯藏末期（30 d），U+Ca 組的PPO 和POD 活性[338.33 ΔOD420nm/（min·g）和180.00 ΔOD470nm/（min·g）] 顯著低于CK 組[（379.00 ΔOD420nm/（min·g）和207.73 ΔOD470nm/（min·g）]。較低的PPO 和POD 活性可減少酚類物質(zhì)的消耗，延緩酚類物質(zhì)含量的下降[12-13]。因此，U+Ca 處理能夠顯著抑制貯藏期間PPO 和POD 活性。

圖4 超聲波協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酶活性的影響Fig.4 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on the enzyme activity of cherry tomatoes during storage

櫻桃番茄PAL 酶活隨著貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在貯藏第20 天達(dá)到最大值，這可能與次級代謝產(chǎn)物如酚類物質(zhì)的積累不相同有關(guān)。貯藏末期（30 d），U+Ca 組的PAL 活性[252.40 ΔOD290nm/（h·g）]顯著低于CK 組和U 組[（303.87、313.20 ΔOD290nm/（h·g）]，表明U+Ca 處理有效抑制苯丙烷類代謝系統(tǒng)，減少次級代謝產(chǎn)物（酚類物質(zhì)）的生產(chǎn)，延緩果實(shí)成熟與衰老[14-15]。

2.4 超聲波協(xié)同鈣浸漬對櫻桃番茄貯藏過程中酚酸結(jié)構(gòu)特性的影響

以貯藏30 d 的櫻桃番茄進(jìn)行HPLC-MS 分析，根據(jù)櫻桃番茄負(fù)離子模式下主要化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)對照，已鑒別的化合物的質(zhì)荷比（m/z）以及保留時(shí)間結(jié)果見圖5，酚酸保留時(shí)間及質(zhì)譜特征見表1[16-18]。

圖5 櫻桃番茄酚酸質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectrum of phenolic acids of cherry tomato

表1 櫻桃番茄酚酸保留時(shí)間及質(zhì)譜特征Table 1 Cherry tomato phenolic acids retention time and mass spectrum characteristics

續(xù)表1 櫻桃番茄酚酸保留時(shí)間及質(zhì)譜特征Continue table 1 Cherry tomato phenolic acids retention time and mass spectrum characteristics

新鮮櫻桃番茄中共鑒別出8 種化合物，分別為5-沒食子酸奎寧酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C，但仍有大量化合物未鑒別出。其中，綠原酸、隱綠原酸為同分異構(gòu)體，異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 為同分異構(gòu)體。櫻桃番茄中出現(xiàn)隱綠原酸是由于綠原酸類成分結(jié)構(gòu)母核相同，在一定條件下可以通過分子內(nèi)酯基遷移發(fā)生異構(gòu)化[16]。貯藏第30 天，CK 組櫻桃番茄主要酚酸是咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異綠原酸A；U 組櫻桃番茄主要酚酸是阿魏酸、綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 和異綠原酸C；Ca 組櫻桃番茄主要酚酸是對香豆酸/綠原酸、表沒食子酸兒茶素、蘆丁和異綠原酸A；U+Ca 組櫻桃番茄主要酚酸是咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 和異綠原酸C?，F(xiàn)有結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隱綠原酸存在于CK 組櫻桃番茄中，可能是由于貯藏第30 天CK 組果實(shí)的pH 值更接近中性，使得綠原酸更易轉(zhuǎn)化為隱綠原酸[17-18]。結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬能夠有效抑制貯藏期間櫻桃番茄主要酚酸的消耗，維持酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性。

3 結(jié)論

與對照組相比，超聲協(xié)同鈣浸漬處理有效延緩了櫻桃番茄貯藏過程中總酚含量下降。此外，貯藏末期PPO、POD、PAL 活性[338.33 ΔOD420nm/（min·g）、180.00 ΔOD470nm/（min·g）和252.40 ΔOD290nm/（h·g）]顯著低于CK 組[379.00 ΔOD420nm/（min·g）、207.73 ΔOD470nm/（min·g）和303.87 ΔOD290nm/（h·g）]，表明超聲協(xié)同鈣浸漬技術(shù)顯著抑制貯藏過程中PPO、POD 和PAL 酶活性。質(zhì)譜結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬處理有效延緩櫻桃番茄酚酸消耗，維持櫻桃番茄酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性與抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬處理有效抑制櫻桃番茄貯藏期間多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性，維持較高抗氧化活性和酚類物質(zhì)含量，延緩果實(shí)衰老。