沈金花，邱海婷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北重點實驗室，武漢 430074)

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥，常導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量.全球哮喘報告顯示，哮喘的發(fā)病率約為4.3%，這意味著全世界有大約3.34億人患有不同程度的哮喘.預(yù)計到2025年，這一數(shù)字還將增長1億人，變成4.34億人[1].哮喘目前還無法根治，只能通過有效的管理實現(xiàn)對病情的控制.臨床上已有多種藥物可以用來治療哮喘，這些藥物主要是擴張支氣管和抗炎抗過敏藥.西藥副作用比較多，病情易反復(fù)；而中藥治療哮喘歷史悠久、經(jīng)驗豐富、方法獨特，理論自成體系.

鳳尾草(PterismultifidaPoir)為鳳尾蕨科、鳳尾蕨屬的一種草本植物，又名井欄邊草、山雞尾、鳳凰草等，全草入藥，主要分布在我國南部地區(qū)，常生長在潮濕的地方，其功效主要是清熱利濕、消腫止痛、抗菌消炎、涼血止血[2].鳳尾草藥理活性成分相關(guān)研究表明：鳳尾草主要含有黃酮類、萜類以及苯丙素類物質(zhì)[3]，它能減弱雷公藤甲素的毒性[4]，具有廣譜的抗菌[5]、抗腫瘤[6]及保肝作用[7]等.目前尚沒有關(guān)于鳳尾草用于治療呼吸系統(tǒng)疾病以及肌肉緊張相關(guān)疾病的研究報道.因此，本文以鳳尾草乙醇提取物為材料研究其對小鼠氣管平滑肌的作用及機理，旨在探索中藥鳳尾草的新功能及在治療哮喘方面的作用機理.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性BABL/c小鼠，SPF級，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，飼養(yǎng)在中南民族大學(xué)實驗動物中心.無水乙醇、氯化鉀(國藥集團)；乙酰膽堿(上海源葉)；硝苯地平(Sigma)；生理鹽水(武漢濱湖雙鶴)；高鈣液(physiological saline solution, PSS)、零鈣液(0 Ca2+-PSS)、無鈉溶液(Li-PSS)均參考文獻[8]配制.

PHS-2F pH計、SZM體視顯微鏡、HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟)；DZ-1A真空干燥箱(天津泰斯特)；FlexiVent肺功能儀(加拿大SCIREQ)；JH-2張力換能器(北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所).

1.2 實驗方法

1.2.1 EEPM的制備

稱取購自同仁堂的鳳尾草500 g，用中藥粉碎機研磨成粉末狀后，用70%的乙醇以1∶7的固液比常溫浸泡5～6 d，再將上清液真空抽濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干乙醇，將提取物置于真空干燥箱中干燥至恒重，獲得中藥浸膏.每次取用時，用PSS配制成50 mg·mL-1待用.

1.2.2 小鼠離體氣管環(huán)的獲取

用斷頸法處死小鼠后，腹部朝上，用蛙釘固定于解剖板上，噴灑75%酒精，用剪刀剪開小鼠腹部的皮膚和組織，打開胸腔，從喉結(jié)處垂直剪斷氣管，邊用鑷子提起氣管，邊剪去氣管周圍多余的組織，再將氣管和肺放置于預(yù)冷的高鈣液中.

1.2.3 張力換能器的調(diào)試與使用

打開張力換能器后，依次用酒精、超純水、PSS將水浴槽洗滌3次，在每個水浴槽中加入6 mL PSS溶液，37 ℃溫浴，通過空氣泵向其中泵入空氣.將分離的小鼠氣管環(huán)與專用掛鉤連接，掛于張力換能器上.調(diào)節(jié)氣管初始前負(fù)荷為300 mg.平衡4次，每次15 min，每次平衡結(jié)束換液.平衡完成后，用80 mmol·L-1高鉀溶液或100 μmol·L-1ACh溶液預(yù)刺激氣管，待氣管的收縮穩(wěn)定后，換液洗脫至基線，讓氣管休息10～20 min，再開始正式實驗.

1.2.4 Rrs的測量

小鼠稱重后，注射1%戊巴比妥鈉使其麻醉，用蛙釘將其腹部朝上固定于解剖板上，噴灑酒精，用小剪刀將頸部的皮膚和組織剪開，露出氣管，在氣管上剪出小的“T”型開口，將專用針頭插入下方氣管中，深度大約為4～5個氣管環(huán)，用線將氣管與針頭系牢，再將小鼠通過專用的針頭與肺功能儀相連.根據(jù)軟件提示，通過霧化頭給藥，測定Rrs的大小.

2 結(jié)果

2.1 EEPM舒張高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的小鼠氣管平滑肌

80 mmol·L-1KCl能引起小鼠氣管的收縮，這是因為高K+使平滑肌細(xì)胞膜電位去極化，VDCCs通道被激活，胞外Ca2+內(nèi)流，氣管收縮[9].當(dāng)收縮穩(wěn)定后，向水浴槽中累積加入0.0316～10 mg·mL-1的EEPM，可見EEPM劑量依賴性地舒張由高鉀引起的小鼠氣管平滑肌的收縮(圖1(a))，這種舒張程度達到了(95.14 ± 0.73)%(圖1(b)).當(dāng)EEPM濃度達到10 mg·mL-1時，氣管舒張程度約為100%.通過圖1(d)可見，EEPM對靜息狀態(tài)的小鼠氣管環(huán)無影響.Nifedipine是VDCCs離子通道的特異性阻斷劑，它可以完全舒張由高鉀引起的氣管環(huán)收縮(圖1(c))，這提示EEPM可能是通過影響VDCCs通道發(fā)揮作用.

圖1 EEPM對高K+預(yù)收縮的小鼠氣管平滑肌的舒張作用

2.2 EEPM抑制高鉀引起的Ca2+內(nèi)流

在0 Ca2+的條件下，高K+的加入不會引起氣管的收縮，當(dāng)外界環(huán)境中Ca2+恢復(fù)時，因為外鈣內(nèi)流，氣管產(chǎn)生持續(xù)的收縮，而加入EEPM能使這個收縮作用得到舒張(圖2(a)).而且，在0 Ca2+條件下加入EEPM，即使再加入高K+，氣管也只是產(chǎn)生了非常小幅度的收縮(圖2(b))，這提示EEPM可能大幅度地阻斷了外鈣內(nèi)流的途徑.而高K+能激活VDCCs通道，VDCCs通道是外鈣內(nèi)流的主要途徑.因此推測EEPM能舒張高K+預(yù)收縮的小鼠氣管平滑肌是因為其影響了VDCCs通道而抑制了外鈣內(nèi)流.

圖2 EEPM對高鉀引起的Ca2+內(nèi)流的抑制作用

2.3 EEPM舒張ACh引起預(yù)收縮的小鼠氣管平滑肌

EEPM能夠劑量依賴性地舒張ACh引起收縮的小鼠氣管平滑肌.100 μmol·L-1ACh能使小鼠氣管產(chǎn)生一個持續(xù)的收縮.而0.0032～10 mg·mL-1EEPM的累積加入能夠使小鼠氣管環(huán)的收縮得到抑制(圖3(a)).當(dāng)EEPM濃度達到3.7 mg·mL-1時，小鼠氣管環(huán)舒張程度達到100%(圖3(b)).

圖3 EEPM劑量依賴性舒張ACh預(yù)收縮的氣管平滑肌

2.4 排除VDCCs通道后EEPM舒張小鼠氣管平滑肌

先加入VDCCs通道的特異性阻斷劑Nifedipine，再加入3.7 mg·mL-1EEPM，可見EEPM仍能使預(yù)收縮的小鼠氣管舒張(圖4).這提示EEPM不僅影響VDCCs通道，還影響其他通道從而使ACh預(yù)收縮的小鼠氣管舒張.

圖4 阻斷VDCCs通道后，EEPM對氣管平滑肌的舒張作用

2.5 EEPM抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放

ACh可以激活VDCCs通道和NSCCs通道，導(dǎo)致外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放[10].在0 Ca2+條件下，即使加入ACh，也只能使肌漿網(wǎng)中的Ca2+瞬時釋放，氣管無法產(chǎn)生持續(xù)性收縮.當(dāng)外界Ca2+濃度恢復(fù)，外鈣內(nèi)流，內(nèi)鈣釋放，氣管產(chǎn)生一個持續(xù)的收縮.這種收縮能夠被EEPM完全抑制(圖5(a)).如果提前孵育EEPM，即使外界Ca2+濃度恢復(fù)，氣管也無法發(fā)生收縮(圖5(b)).這說明EEPM能夠抑制外鈣內(nèi)流，內(nèi)鈣釋放.為了更加深入地研究參與ACh引起的內(nèi)鈣釋放的離子通道，利用Nifedipine阻斷了VDCCs通道，在0 Ca2+條件下，加入ACh只能引起肌漿網(wǎng)Ca2+的瞬時釋放，當(dāng)環(huán)境中Ca2+濃度恢復(fù)后，外界鈣可通過NSCCs通道進入細(xì)胞，內(nèi)鈣釋放，氣管仍能產(chǎn)生一個持續(xù)的收縮.這種收縮能夠被EEPM完全舒張(圖5(c)).接著選用2種可以阻斷NSCCs中的TRP通道的阻斷劑：Pyr 3和Gadolinium，可見這兩種阻斷劑均能部分舒張預(yù)收縮的小鼠氣管，EEPM可以使余下的部分完全舒張(圖5(d)).這說明NSCCs通道參與了ACh引起的內(nèi)鈣釋放，而EEPM能夠抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放.

圖5 EEPM對ACh引起的內(nèi)鈣釋放的抑制作用

2.6 EEPM抑制Na+/Ca2+交換

NCX也是與Ca2+內(nèi)流有關(guān)的一種離子通道.在PSS(含Na+)溶液中，ACh可以引起小鼠離體氣管環(huán)的收縮(圖6(a)).但將PSS的Na+用Li+替換掉(Li-PSS)，氣管的基礎(chǔ)張力有所上升，100 μmol·L-1ACh仍能使氣管發(fā)生一定的收縮，加入EEPM后，小鼠氣管舒張直至基礎(chǔ)張力以下(圖6(b)).兩組實驗小鼠氣管的基礎(chǔ)張力和收縮值均有顯著的差異(P<0.01，圖6(c)).以上實驗結(jié)果表明：NCX也參與了小鼠氣管環(huán)的收縮，但是EEPM能夠作用于NCX通道，使收縮的小鼠氣管舒張.

圖6 EEPM對Na+/Ca2+交換的抑制作用

2.7 EEPM對氣管組織活性的影響

為了探究EEPM對小鼠氣管活性的影響，在氣管預(yù)收縮穩(wěn)定時，向其中加入10 mg·mL-1EEPM，使氣管舒張.用PSS將EEPM洗脫下來，向槽中加入6 mL PSS以及100 μmol·L-1ACh或80 mmol·L-1KCl，觀察氣管的收縮幅度(圖7(a)～圖7(d)).可見加入ACh或KCl后，小鼠氣管收縮無法恢復(fù)到原來的數(shù)值，并且兩種激動劑的兩次收縮值間均具有顯著性差異(P<0.01).這可能是因為EEPM對小鼠氣管活性有一定的影響，或者EEPM未洗脫干凈，殘留的藥物影響了氣管的收縮幅度.

圖7(b)和圖7(d)中，兩組實驗中未加入EEPM前與EEPM洗脫后的氣管收縮值均有顯著性差異，**P<0.01.

2.8 EEPM對Rrs的影響

為探究EEPM在活體上對Rrs的影響，利用肺功能儀對對照組和實驗組小鼠的Rrs進行了檢測，發(fā)現(xiàn)EEPM能夠降低Rrs的上升(P<0.01，圖8)，這提示了EEPM對哮喘的治療也能發(fā)揮一定的作用.

圖8 EEPM對小鼠呼吸氣道阻力的影響

3 討論

哮喘是一種異質(zhì)性呼吸系統(tǒng)疾病，患者的臨床表型不同，其誘因也是多種多樣，包括先天遺傳、肥胖、飲食、變應(yīng)原、煙霧和空氣污染等[11].近些年來，全球哮喘患者數(shù)量與日俱增，哮喘的治療越來越受到人們的重視.治療哮喘常用的藥物為β受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、茶堿類藥物、抗膽堿能類藥物、炎性介質(zhì)拮抗劑以及鈣通道阻滯劑.但是，目前沒有特效藥能夠治愈哮喘，因此針對哮喘的藥物治療機理的研究仍有非常重要的價值.通過前期大量的篩選工作與預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，EEPM能夠舒張預(yù)收縮小鼠氣管平滑肌.故本文就對其作用機理做了相關(guān)的研究.

哮喘的典型癥狀之一是氣管平滑肌持續(xù)性收縮，而Ca2+在平滑肌收縮的過程中發(fā)揮著極其重要的作用.外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放共同調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Ca2+濃度，從而使平滑肌細(xì)胞收縮或舒張[12].VDCCs通道可分為L、N、P、Q、R和T型，其中L型VDCCs通道存在于肌肉組織中，與外鈣內(nèi)流有關(guān)[13].NSCCs中的TRP通道可以轉(zhuǎn)運Ca2+以及其他陽離子[14]，而NCX通道可以通過膜電位以及膜兩側(cè)Na+與Ca2+濃度差快速精確地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度[15].這三個通道均參與了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，與氣管平滑肌的收縮舒張密切相關(guān).

利用張力換能器，本文發(fā)現(xiàn)EEPM能夠不同程度地舒張高鉀和ACh預(yù)收縮的小鼠氣管平滑肌，而這可能與氣管平滑肌細(xì)胞上的VDCCs和其他離子通道有關(guān).VDCCs通道介導(dǎo)了外鈣內(nèi)流.本文證實了EEPM能夠像VDCCs阻斷劑Nifedipine一樣阻斷VDCCs離子通道，使外鈣無法內(nèi)流，從而舒張高鉀預(yù)收縮的小鼠氣管.在ACh預(yù)收縮的氣管中，阻斷VDCCs通道后，EEPM能夠通過影響NSCCs和NCX等通道使氣管舒張.而活體實驗結(jié)果也表明EEPM能夠一定程度地降低ACh引起的Rrs的上升.基于EEPM能夠有效地緩解小鼠氣道平滑肌的收縮，它有望成為一種用于哮喘治療的中草藥.

隨著對哮喘發(fā)病機制更深入的研究，人們逐漸意識到哮喘雖是一種異質(zhì)性疾病，但是它的發(fā)病機制和氣道炎癥有一定的關(guān)系[11].氣道炎癥的產(chǎn)生能夠引發(fā)氣道高反應(yīng)，使得氣道平滑肌痙攣[16].本文僅探討了EEPM對收縮的小鼠氣管環(huán)中離子通道的影響，它是否會對小鼠氣道炎癥有影響還需進一步研究.