周蓓 王婧 李仲洋

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性的身心健康。盡管各種治療方法取得一定進(jìn)步，但長期生存率并不樂觀。尋找到一種影響腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的靶向基因迫在眉睫。多項研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織或血清中微小 RNA(microRNAs)差異性表達(dá)，與病人的預(yù)后有關(guān)，如miR-199b-5p、miR-145等[1-2]。miR-597位于人類染色體8p23.1，研究發(fā)現(xiàn)其與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]，但對乳腺癌的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。FOS 樣抗原2(Fos-related antigen 2,FOSL2)屬于 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族，在腫瘤增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要的作用[4]。本研究觀察miR-597對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并探討miR-597與FOSL2的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

2018年1月～2019年4月在我院接受手術(shù)治療的乳腺癌病人30例，年齡38～71歲，平均年齡(60.22±8.02)歲。病理分型：浸潤性導(dǎo)管癌22例，黏液癌6例，浸潤性小葉癌2例。臨床分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期10例，Ⅲ期6例。所有病人均經(jīng)病理明確診斷，前3～5個月內(nèi)均未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。術(shù)中切除的癌組織及正常乳腺組織(30例，距離癌灶邊緣5 cm)迅速液氮凍存以提取RNA用于qRT-PCR檢測。所有標(biāo)本收集均征得病人或家屬同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 目標(biāo)引物序列和大小

二、方法

1.主要試劑、細(xì)胞株及儀器：人乳腺癌細(xì)胞系T-47D,SK-BR-3,MDA-MB-231,MCF7及 BT-474，正常乳腺細(xì)胞株MCF10A(上海生命科學(xué)研究所)。miR-597引物序列，miR-597 mimics、miR-NC對照質(zhì)粒(上海生命科學(xué)研究所)；兔抗人FOSL2、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Sigma公司，美國)；RNA提取試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑盒(武漢博士德生物公司)；氯化丙定(propidium iodide,PI)(BDBiosciences，美國)；熒光素酶檢測試劑盒(BioVision公司，美國)；MTT試劑盒(Kapa Biosystems，美國)；Transwell小室、PCR試劑盒(Sigma公司，美國)；酶標(biāo)儀(上海儀電分析儀器有限公司)；ABI 7900PCR擴(kuò)增儀(上海儀電分析儀器有限公司)；FACS流式細(xì)胞儀(BDBiosciences，美國)。

2.實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測乳腺癌組織及細(xì)胞株中miR-597、FOSL2 mRNA表達(dá)：取癌組織以及正常乳腺組織研磨粉碎，胰酶消化組織，離心，取上清。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，離心。利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上海生工有限公司根據(jù)Gene Bank序列合成目標(biāo)引物序列(表1)，根據(jù)反應(yīng)要求配置反應(yīng)體系，包括SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl+上下游引物10 μM各1 μl，加反應(yīng)水至總體積為25 μl。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為92 ℃ 20秒、96 ℃ 2秒、85 ℃ 20秒、80 ℃ 6秒，共30個循環(huán)，75 ℃讀取熒光，構(gòu)建溶解曲線。2-△△Ct法計算目標(biāo)引物mRNA的相對表達(dá)量。

3.細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：含10% FBS和青、鏈霉素各100 U/L的DMEM培養(yǎng)基， 常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。使用P5RHH搭載miRNA形成納米復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染物質(zhì)分為：NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC空質(zhì)粒)，miR-597組(轉(zhuǎn)染miR-597-mimics)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

4.MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力：分別消化、收集各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×107/L的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中0,48小時,72小時及96小時，終止前每孔加入20 ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，上機(jī)前吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 ml DMSO，水平搖床搖動30分鐘，在酶標(biāo)儀(490 nm波長)上測量吸光度OD值。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：胰酶消化，離心細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×105/L的單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，加入0.2% 小牛血清培養(yǎng)48小時，加入10 μl PI避光條件下4 ℃孵育1小時，流式細(xì)胞儀測定，ModFit軟件分析。

6.Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力：采用無Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室分別進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實驗。遷移實驗：上室每孔加入200 μl無血清細(xì)胞懸浮液，密度為6×104個/孔，下室加入600 μl含20%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時，4%多聚甲醛固定10分鐘，0.5%結(jié)晶紫染色10分鐘。洗滌，光學(xué)顯微鏡下選取5個視野計算細(xì)胞數(shù)量。侵襲實驗：使用4 ℃的無血清DMEM 1∶6稀釋基質(zhì)膠，每個transwell小室中加40 μl Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃放置30分鐘。取出小室吸取多余的液體，其余步驟同遷移實驗。

7.Western Blot檢測FOSL2蛋白量表達(dá)：去除培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入裂解液，冰浴30分鐘，40 ℃ 1 500 r/min離心5分鐘，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μl待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1小時，逐次兔抗人FOSL2、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(1∶100)。曝光成像，Image Lab Software測定光密度[5]。

A 乳腺癌組織、正常乳腺組織中miR-597表達(dá)；B 乳腺癌細(xì)胞株、正常乳腺細(xì)胞株細(xì)胞中miR-597表達(dá)。與乳腺癌組織比較，aP<0.01；與MCF10A比較，bP<0.01

8.熒光素酶實驗驗證miR-195與FOSL2的靶向關(guān)系：按照試劑盒步驟將FOSL2野生型或突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體單獨(dú)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，培養(yǎng)48小時后去除培養(yǎng)液。PBS洗滌3遍，加入細(xì)胞裂解液。4 ℃振蕩10分鐘，40 ℃ 1 000 r/min離心3分鐘，取上清進(jìn)行發(fā)光測定。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.乳腺癌組織及細(xì)胞株中miR-597表達(dá)：乳腺癌組織miR-597水平低于正常乳腺組織，乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞miR-597表達(dá)低于正常乳腺細(xì)胞株細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌細(xì)胞株T-47D、SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF7及BT-474細(xì)胞miR-597表達(dá)低于正常乳腺細(xì)胞，其中MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)最低。因此，本研究選取MDA-MB-231細(xì)胞株用于隨后的實驗研究。見圖1。

2.miR-597過表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響：miR-597組細(xì)胞miR-597水平高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.256，P=0.000)，表明轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實驗。MTT結(jié)果表明，miR-597組細(xì)胞活力明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.833，P=0.000)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，miR-597組G0G1期細(xì)胞百分率(62.82%)高于NC組(30.19%)，S期細(xì)胞百分率(19.19%)低于NC組(40.13%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.215，10.336，P=0.000，0.000)。

3.miR-597過表達(dá)對細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響：miR-597組細(xì)胞侵襲能力低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.404，P=0.000)。miR-597組細(xì)胞遷移能力低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.801，P=0.016)。見圖2。

4.miR-597過表達(dá)對FOSL2蛋白表達(dá)的影響：miR-597組細(xì)胞FOSL2表達(dá)水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.658，P=0.000)。見圖3。

5.FOSL2為miR-597直接調(diào)控的靶基因：生物學(xué)信息分析表明，miR-597與FOSL2之間存在連續(xù)的結(jié)合片段。熒光素酶實驗驗證結(jié)果顯示，miR-597 mimics可抑制野生型3'UTR報告載體熒光素酶活性，而對突變型3'UTR報告載體熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用。見圖4。

討論

近年來發(fā)現(xiàn)多種microRNAs分子乳腺癌組織或細(xì)胞株中差異性表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-3]。焦東曉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p在乳腺癌組織中低表達(dá)，與乳腺癌的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等有關(guān)。另外研究結(jié)果顯示[7]，miR-340可靶向調(diào)控MUO10基因，

A 侵襲能力實驗；B 遷移能力實驗。與NC組比較，aP<0.01;與NC組比較，bP<0.01

A Western Blot檢測兩組FOSL2蛋白表達(dá)；B 統(tǒng)計學(xué)分析。與NC組比較，aP<0.01

圖4 miR-597與FOSL2的靶向關(guān)系

抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。miR-597位于人染色體8p23.1，研究發(fā)現(xiàn) miR-597在結(jié)腸癌，鼻咽癌中低表達(dá)，而在急性髓細(xì)胞白血病中高表達(dá)[8-10]。有研究結(jié)果表明，乳腺癌組織中miR-597低表達(dá)，與腫瘤的惡性病理特征、預(yù)后不良有關(guān)[11]。我們采用Qrt-PCR檢測了乳腺癌組織及細(xì)胞株中miR-597表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-597在組織及細(xì)胞株中均下調(diào)，這與其他人研究結(jié)果一致[11]，提示miR-597可能作為抑癌基因，參與了乳腺癌的發(fā)生。miRNA在腫瘤增殖、遷移及侵襲中的作用已經(jīng)得到研究證實。miRNA作為抑癌基因，可調(diào)控細(xì)胞周期，阻礙細(xì)胞的增殖，失活信號通路進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果提示，過表達(dá)miR-597可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，提示miR-597與乳腺癌的惡性進(jìn)展有關(guān)。

FOSL2在其他多種生理和病理過程中也有一定的作用，如周期調(diào)節(jié)，腫瘤形成和纖維化。多項研究表明，F(xiàn)OSL2在多種腫瘤中差異性表達(dá)，如Guo等[12]研究結(jié)果顯示，凋亡的白血病細(xì)胞FOSL2的水平明顯升高；另外的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中FOSL2蛋白高表達(dá)，敲除FOSL2的肝癌細(xì)胞增殖能力受到抑制，相關(guān)癌基因(CCR4、MYB和MDM2)表達(dá)水平降低[13]；Li等[14]研究表明，F(xiàn)OSL2蛋白的過度表達(dá)會增加卵巢癌細(xì)胞侵襲潛能。FOSL2蛋白可能通過上調(diào)TGF-β信號通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。我們通過生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-597與FOSL2存在互補(bǔ)的基因片段，提示兩者存在一定的聯(lián)系。隨后我們觀察了miR-597 對FOSL2蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 miR-597 mimic的MDA-MB-231細(xì)胞FOSL2表達(dá)下降，提示miR-597的表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞中FOSL2蛋白的表達(dá)，兩者存在調(diào)控作用。隨后雙熒光素酶結(jié)果提示，轉(zhuǎn)miR-597 mimics可抑制野生型3'UTR報告載體熒光素酶活性，進(jìn)一步驗證了miR-597可靶向調(diào)控FOSL2蛋白，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的惡性發(fā)展行為。

綜上所述，miR-597在乳腺癌中低表達(dá)，可靶向調(diào)控FOSL2抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，但FOSL2調(diào)控腫瘤惡性行為的通路尚不清楚，有待進(jìn)一步研究明確。