彭佳佳,黃賽朋,閆宇斌,蔣 萌,高 婷,薛偉明,溫惠云

(西北大學 化工學院,陜西 西安 710069)

姜黃素(curcumin,CUR)是從姜科天南星科植物根莖中提取的多酚化合物,具有抗氧化、抗炎、抗感染、抗腫瘤等藥理活性[1-2]。CUR通過誘導惡性腫瘤細胞分化和凋亡來抑制腫瘤細胞生長，發(fā)揮抗腫瘤作用,在腫瘤治療中具有藥理安全性高和抗多藥耐藥等優(yōu)點。但是CUR水溶性差、光熱穩(wěn)定性不足、代謝速度快、半衰期短等問題嚴重影響了抗腫瘤臨床應用效果[3]。近年來,研究者通過設計膠束[4]、脂質體[5]、聚合物納米粒[6]等實現(xiàn)了疏水性藥物的物理負載與遞送,不僅能改善藥物水溶性和穩(wěn)定性,而且能借助載體靶向腫瘤細胞遞送[4-5]以降低藥物毒副作用和提高生物利用度。

為了提高疏水性抗腫瘤藥物在納米載體中的裝載穩(wěn)定性,一種可行策略是通過二硫鍵將藥物共價鍵合在聚合物分子上并構建還原敏感型前藥聚合物膠束[7-8]。利用腫瘤細胞中還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量高于正常細胞約4倍的環(huán)境特征[9],遞送至腫瘤細胞中的載藥膠束在GSH還原作用下發(fā)生二硫鍵斷裂,引起膠束解聚和藥物釋放[10-11]。

研究表明,多種腫瘤細胞能夠在細胞膜上過度表達CD44受體蛋白[12-13],該蛋白可以與透明質酸(hyaluronic acid,HA)發(fā)生特異性結合，可以利用HA構建聚合物納米膠束的親水骨架[14],通過HA與CD44受體蛋白之間的特異性結合,引導膠束向腫瘤細胞表面遷移并促進細胞對膠束的內吞,賦予膠束具有主動靶向腫瘤細胞遞送藥物特性。

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)又名乙二醇聚氧乙烯醚,具有良好的水溶性、生物相容性和可生物降解性,可在體內長循環(huán)輸運,在藥物載體構建研究中具有優(yōu)勢[15]。重復單元的存在使PEG具有多種分子量形式。Shan等研究了相對分子質量分別為1 000，2 000和5 000的PEG對pH敏感型聚合物膠束藥物遞送的影響,發(fā)現(xiàn)采用PEG2000構建的聚合物膠束具有載藥量高、不易被巨噬細胞攝取、藥物緩釋特征明顯的特點[16]。

本文以HA和PEG為聚合物材料,通過酰胺化反應將模型藥物CUR通過二硫鍵連接到聚合物分子骨架上,合成兼具疏水端和親水骨架的CUR-SS-polymer前藥分子,利用分子自組裝效應構建前藥聚合物納米膠束,對其還原敏感刺激響應控釋性能進行評價。

1 實驗

1.1 主要實驗試劑與儀器

姜黃素(CUR,分析純,北京伊諾凱科技有限公司);胱胺二鹽酸鹽(分析純,上海笛伯化學品技術有限公司);丁二酸酐(SA,分析純,天津福晨化學試劑有限公司);還原型谷胱甘肽(GSH,分析純,上海國藥試劑有限公司);1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,分析純,阿拉丁(上海)試劑有限公司);N-羥基丁二酰亞胺(NHS,分析純,阿拉丁(上海)試劑有限公司);4-二甲氨基吡啶(DMAP,國藥集團化學試劑有限公司);氨基聚乙二醇羧基2000(H2N-PEG2000-COOH,相對分子質量2000,上海梵碩生物科技有限公司);透明質酸(HA,平均相對分子量8500,山東東營佛思特生物工程有限公司);透析袋MD25(截留相對分子質量(MWCO)為3500 和10000,上海綠烏科技有限公司)。

VERTEX70紅外光譜儀(德國布魯克公司);UV-3600紫外分光光度儀(日本島津儀器公司);Nano-ZS-ZEN3600激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司);HitachiH-7700透射電子顯微鏡(株式會社日立制作所);RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津有限公司);AVAE400核磁共振波譜儀(德國布魯克公司)。

1.2 CUR-SS-PEG-HA前藥分子的制備

1)HA-PEG-COOH的制備

準確稱取HA (850 mg,0.1 mmol)、EDC·HCl (28.76 mg,0.15 mmol)和 NHS(17.26 mg,0.15 mmol),超聲溶解于20 mL PBS緩沖溶液(pH=6.0)中,室溫攪拌活化6 h后加入H2N-PEG2000-COOH (150 mg,0.075 mmol)繼續(xù)反應24 h,最后將上述溶液移入透析袋(MWCO=3 500)中,在去離子水中透析48 h,凍干得白色粉末(產率54.1%)。

2)HA-PEG-SS-NH2的制備

HA-PEG-COOH (550 mg)溶于20 mL 去離子水中,加入EDC (287.55 mg,1.5 mmol)和 NHS(172.64 mg,1.5 mmol)室溫攪拌活化 12 h,然后加入胱胺二鹽酸鹽(285.45 mg,1.85 mmol)繼續(xù)反應 24 h,反應結束后在去離子水中透析(MWCO=3 500)48 h,凍干得 HA-PEG-SS-NH2粉末(產率67.3%)。

3)CUR-SS-PEG-HA的制備

SA(0.03 g,0.3 mmol)與DMAP(36 mg,0.3 mmol)超聲溶解于10 mL 二甲基亞砜(DMSO)中,再與適量4A分子篩一起加入三口燒瓶(50 mL)中,N2氛圍65℃活化30 min。將CUR(110 mg,0.3 mmol)加入上述燒瓶中,65℃繼續(xù)反應24 h,得CUR-COOH溶液。取上述溶液1 mL用DMSO稀釋10倍后加入50 mL三口燒瓶中,同時加入20 mg EDC與10 mg NHS,室溫活化12 h,隨后用注射器加入甲酰胺預溶解的HA-SS-PEG-NH2(10 mg/mL,10 mL),N2氛圍65 ℃反應2 d。將反應產物置于透析袋(MWCO=3 500)中,在去離子水環(huán)境中透析24 h后,凍干得聚合物粉末(產率35.7%)。

1.3 CUR-SS-PEG-HA前藥分子結構表征

分別將2 mg的 HA，HA-PEG-COOH，CUR-SS-PEG-HA與200 mg KBr充分研磨,使用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍測定樣品紅外吸收光譜。取5 mg CUR-SS-PEG-HA 溶解于DMSO-d6中,使用AVAE400核磁共振波譜儀測定樣品的核磁共振氫譜(分辨率為4 cm-1,精確度為0.01 cm-1)。

1.4 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束制備

將5 mg CUR-SS-PEG-HA前藥粉末充分溶解于10 mL DMSO中,再將溶液移入透析袋(MWCO=3 500),在去離子水中透析24 h,獲得聚合物前藥膠束溶液,備用。

1.5 臨界膠束濃度(CMC)和載藥量(DLC)測定

1)CMC的測定

“我不知道他結婚了，被打出門也住過院，中途他們沒來看過一次?！蓖跹嗳惚硎?，舉報時很決絕。她在檢舉信中提到，黃道龍父子擁有來歷不明的房產、珠寶、書畫、成套的紅木安居、豪華轎車及大量銀行卡和現(xiàn)金，資產高達幾千萬。

采用芘熒光探針法測定CUR-SS-PEG-HA的臨界膠束濃度。向12個離心管(5 mL)中分別加入100 μL含芘丙酮溶液(10-6mol/L),待丙酮完全揮發(fā)后,向各離心管中加入2 mL不同濃度的CUR-SS-PEG-HA水溶液(2.45×10-4～0.25 mg/mL),室溫孵育24 h,采用熒光分光光度計在激發(fā)波長335 nm處測定溶液熒光強度。

2)DLC的測定

將CUR溶解于DMSO∶水=9∶1(v/v)的混合溶液中,利用梯度稀釋獲得不同濃度的CUR溶液,使用紫外分光光度計在CUR最大吸收波長425 nm處測定溶液吸光度值A。以CUR溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標,以溶液吸光度值A為縱坐標,繪制標準曲線。擬合回歸方程為:C=2.6828A-0.0339,R2=0.9987。

將一定質量的CUR-SS-PEG-HA前藥粉末充分溶解于DMSO∶水=9∶1(v/v)混合溶液中,在425 nm處測定溶液吸光度值并計算CUR含量。按照公式(1)計算載藥量。

(1)

1.6 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束形貌表征

將CUR-SS-PEG-HA前藥納米膠束溶液滴于銅網上,待溶劑自然揮發(fā)后用10 mg/mL磷鎢酸溶液染色2 min,透射電鏡(TEM,100 kV)觀察膠束形貌。

1.7 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束尺寸相關性能表征

1)水合粒徑與表面電位

動態(tài)光散射法(dynamic light scattering,DLS)測定納米膠束水合粒徑和表面電位。

采用馬爾文激光粒度儀和熒光分光光度計,在含有10 mmol/L GSH的PBS緩沖液(pH=7.4,10 mmol/L)中測定CUR-SS-PEG-HA前藥膠束(0.5 mg/mL)的平均粒徑和熒光強度。

1.8 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束體外釋藥實驗

將6 mL CUR-SS-PEG-HA前藥膠束溶液(1 mg/mL)裝入透析袋(MWCO=10 000),分別置于80 mL含有0 mmol/L 和10 mmol/L GSH的PBS緩沖液(pH=7.4,10 mmol/L)中,37℃恒溫搖床100 rpm震蕩透析。隔時取出3 mL溶液,同時補充等量相應GSH濃度的新鮮緩沖液。紫外分光光度計在425 nm處測定吸光度值。根據(jù)CUR標準曲線方程計算藥物累積釋放率。每組實驗平行測定3次。

2 結果與討論

2.1 CUR-SS-PEG-HA前藥分子合成與結構表征

以HA，PEG，CUR為制備材料,本文設計了一種利用酰胺化反應使CUR分子通過二硫鍵鍵合在聚合物分子骨架上的前藥分子合成方法,工藝路線如圖1所示。

圖1 HA-PEG-SS-NH2(A)和CUR-SS-PEG-HA(B)合成路線Fig.1 Synthetic routes of CUR-SS-PEG-HA(A) and CUR-SS-PEG-HA(B)

圖2所示HA，HA-PEG-COOH，CUR-SS-PEG-HA紅外光譜測定結果表明,3種樣品在3 690～3 020 cm-1處均出現(xiàn)O-H伸縮振動寬峰;1 610 cm-1歸屬為HA中羧酸鹽的CO伸縮振動峰,該特征峰在HA-PEG-COOH和CUR-SS-PEG-HA樣品中略有藍移;CUR-SS-PEG-HA樣品在1 283 cm-1和1 411 cm-1分別出現(xiàn)酰胺鍵中C-O和C-N伸縮振動峰。CUR-SS-PEG-HA樣品在1 604 cm-1出現(xiàn)CO(烯醇)伸縮振動峰,證明CUR被成功鍵合。

采用1H-NMR技術進一步證實了CUR-SS-PEG-HA前藥分子的合成。圖3結果表明,1.99×10-6～2.00×10-6，6.67×10-6～7.03×10-6，3.77×10-6處的峰分別歸屬為HA(乙?；?-NHCOCH3)，CUR(芳香氫)，聚乙二醇(亞甲基,-CH2-CH2-O-)的質子峰;3.83×10-6處的單峰歸屬為CUR中-OCH3的質子峰；7.39×10-6～7.43×10-6處的二重峰歸屬為CUR苯環(huán)附近的質子峰；8.11×10-6處歸屬為聚合物分子中酰胺鍵質子峰。

圖2 HA，HA-PEG-COOH，CUR-SS-PEG-HA的紅外吸收光譜Fig.2 FT-IR spectrum of HA,HA-PEG-COOH and CUR-SS-PEG-HA

2.2 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束粒徑與形貌表征

圖4結果表明,采用DLS法測定CUR-SS-PEG-HA前藥膠束的平均水合粒徑為438 nm,PDI為0.017,粒徑分布均一。膠束的Zeta電位為-23.5 mV,表明膠束間較大的靜電斥力是維持膠束穩(wěn)定單分散的重要因素[17]。TEM觀測到膠束呈球形,平均粒徑約100 nm。

圖3 CUR-SS-PEG-HA的核磁共振氫譜圖(DMSO-d6)Fig.3 1H-NMR spectrum of CUR-SS-PEG-HA in DMSO-d6

圖4 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束粒度分布(A)與TEM照片(B)Fig.4 Size distribution (A) and TEM image (B) of CUR-SS-PEG-HA

2.3 CUR-SS-PEG-HA臨界膠束濃度和載藥性能

采用芘熒光探針法測定CUR-SS-PEG-HA納米膠束CMC為0.098 mg/mL,這一特性為載藥膠束在體液輸運環(huán)境中維持穩(wěn)定膠束結構提供了保障。載藥量測定結果可見,100 mg膠束中可負載19.74 mg CUR,表明本文制備工藝能夠實現(xiàn)藥物在膠束中的穩(wěn)定鍵合與高效負載。

2.4 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束還原敏感性能

本文在模擬腫瘤細胞內高濃度GSH環(huán)境中評價了CUR-SS-PEG-HA前藥膠束結構的還原敏感特性。作為還原劑,溶液中的GSH將前藥分子中的二硫鍵還原為巰基,導致前藥分子疏水端CUR脫落,繼而引起膠束結構膨脹和解聚。因此,將CUR-SS-PEG-HA前藥膠束置于10 mmol/L GSH溶液中,膠束平均粒徑隨還原反應時間延長而顯著增大(見圖5),溶液熒光強度顯著增強(見圖6),表明本文制備的前藥膠束具有優(yōu)異的GSH還原敏感性能。

圖5 GSH還原反應時間對CUR-SS-PEG-HA膠束粒徑的影響Fig.5 Influence of GSH reduction time on size of CUR-SS-PEG-HA micelles

圖6 GSH 還原反應時間對CUR-SS-PEG-HA膠束溶液熒光強度的影響Fig.6 Influence of GSH reduction time on fluorescence intensity of CUR-SS-PEG-HA micelles

2.5 CUR-SS-PEG-HA前藥膠束還原敏感藥物釋放

實驗評價了體外釋放環(huán)境中GSH含量對CUR-SS-PEG-HA前藥膠束還原敏感釋放行為的影響。圖7結果表明,當釋放環(huán)境中不含有GSH時,前藥膠束在100 h實驗過程中的CUR累積釋放率低于8%;當GSH濃度增加至10 mmol/L時,CUR在釋放介質中的累積釋放率顯著增加,100 h時CUR累積釋放率達到56.53%。這是由于構成膠束的前藥分子在GSH還原作用下通過斷裂二硫鍵引起CUR釋放,表明CUR-SS-PEG-HA前藥膠束對GSH具有還原敏感刺激響應的藥物控釋特性,圖5和圖6中實驗也支持了這一結論。

圖7 GSH含量對CUR-SS-PEG-HA前藥膠束還原敏感釋放行為的影響Fig.7 Effect of GSH content on reduction dependent release behavior of CUR-SS-PEG-HA prodrug micelles

3 結論

本文以HA和PEG作為聚合物親水骨架,以CUR作為疏水端分子,通過化學鍵合方式構建了具有還原敏感釋放特性的CUR-SS-PEG-HA前藥膠束,改善了CUR的裝載穩(wěn)定性和負載效率。該前藥膠束表現(xiàn)出優(yōu)異的GSH還原敏感刺激的尺寸響應行為與藥物控制釋放行為,為腫瘤治療研究與應用提供了可行性良好的研究思路和方案。