付 懿，羅 琴，李 萌，陳亞蘭，劉秋艷，羅 敏，丁青芝

江蘇大學 食品與生物工程學院 (鎮(zhèn)江 212013)

微藻中油脂含量十分豐富，其中的脂肪酸與植物油中的脂肪酸組成很相似是寶貴的油脂來源[1-2]。微藻中油脂的合成是在細胞內(nèi)部完成并貯存在細胞中，并且微藻細胞核內(nèi)也存在由微藻油脂形成的功能性組織，那么必須能讓有機溶劑穿過微藻緊致的細胞壁和細胞膜，使有機溶劑與微藻油脂充分接觸，才能提取較多油脂。但是由于海藻細胞壁致密性和細胞膜的選擇透過性，所以弱極性的有機溶劑很難進入細胞內(nèi)。因此，在提取微藻油脂之前，必須使用一定的機械或化學手段使微藻細胞壁破裂，例如擠壓膨化、超聲破碎、高壓均質(zhì)、酸熱法等[3-4]。章瑩穎等[5]將溶藻菌和其他細胞壁破碎技術(shù)相結(jié)合運用于到微藻油脂提取，并與其他物理和化學破壁方法進行了比較。結(jié)果表明:生物法和超聲法的油脂提取率相對較高，因而更適合用于對微藻細胞壁破碎預處理。研究表明:微藻油脂提取技術(shù)只有與一定的細胞壁破碎技術(shù)相結(jié)合，才能達到較好的提取效果。機械法和化學法是常用的微藻破壁方法，也可以兩種方法結(jié)合使用[6]。我們將對比研究不同破壁方法對藻油提取的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

超聲波細胞粉碎機，無錫市上佳生物科技有限公司；HH6型恒溫水浴，金壇醫(yī)療儀器廠；超聲波清洗器，無錫市上佳生物科技有限公司；TGL-16型高速臺式冷凍離心機，湘儀離心機；SK-1型快速混勻器，江蘇醫(yī)療儀器廠；BS224S型分析天平(精密度為0.000 1 g)，賽多利斯公司；BCD-639WKPZM型冰箱，美的集團；FJ200-S型實驗室高速分散均質(zhì)機均質(zhì)機，韜越(上海)機械科技有限公司；SHJ-30型擠壓膨化機，南京杰亞擠出設(shè)備有限公司；GC-2010型氣相色譜，日本島津集團。

1.2 試劑和材料

原料微擬球藻、膨化破壁的微擬球藻，山東煙臺。

試劑：正己烷、乙醇均為分析純；色譜純甲醇；無水硫酸鈉、氫氧化鉀、硫酸，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1微藻油脂的提取

將膨化破壁后的微擬球藻干燥至恒重后放入粉碎機中粉碎80目過篩，精確稱取4 g(精確到0.000 1 g)于250 mL的錐形瓶中加入轉(zhuǎn)子，按料液比(w/v)為1∶25加入正己烷∶乙醇=10∶3混合溶劑100 mL封上保鮮膜后放入60 ℃恒溫水浴鍋，并設(shè)置轉(zhuǎn)速800 r/min的磁力攪拌器上攪拌提取6 h，轉(zhuǎn)移至離心杯中，配平后放入轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心機中離心分層15 min，再將含油脂的上清液轉(zhuǎn)移至已稱重的離心管中，底部殘渣轉(zhuǎn)移至已稱重的培養(yǎng)皿中，在70 ℃的鼓風干燥烘箱中烘干至恒重，稱重，計算油脂得率。

1.3.2微藻破壁方式

(1)反復凍融破壁

精確稱取50 g(精度為0.000 1 g)未破壁的微擬球藻于大培養(yǎng)皿中，按照料液比(w/v)為1∶3加入150 mL蒸餾水后攪拌均勻，放入溫度為-20 ℃的冰箱冷凍8 h，取出后放入60 ℃的水浴鍋中融化，再放入-20 ℃的冰箱冷凍8 h，如此反復進行5次，最終溶化后將反復凍融破壁的藻液移入大培養(yǎng)皿中后，放入溫度為70 ℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重，干燥后轉(zhuǎn)移至粉碎機中粉碎后80目過篩，得到反復凍融破壁微藻備用。

(2)高壓均質(zhì)破壁

精確稱取50 g(精度為0.000 1 g)未破壁的微擬球藻于500 mL燒杯中，按照料液比(w/v)為1∶4加200 mL蒸餾水后攪拌均勻，使用高速分散機進行破壁，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，溫度為25 ℃，均質(zhì)5 min，間歇5 min，反復4次，均質(zhì)總時間為20 min，將均質(zhì)破壁后的藻液移入大培養(yǎng)皿中后，放入溫度為70 ℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重，干燥后轉(zhuǎn)移至粉碎機中粉碎后80目過篩，得到均質(zhì)破壁微藻備用。

(3)超聲破壁

精確稱取37.5 g(精度為0.000 1 g)未破壁的微擬球藻與250 mL燒杯中，按照料液比(w/v)為1∶4加150 mL蒸餾水攪拌均勻，設(shè)置超聲2 s，間隙2 s，總時間60 min，超聲功率800 W，40 ℃恒溫水浴，進行超聲破壁，超聲破壁后的藻液移入大培養(yǎng)皿中后，放入溫度為70 ℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重，干燥后轉(zhuǎn)移至粉碎機中粉碎后80目過篩，得到超聲破壁微藻備用。

(4)膨化破壁

擠壓膨化，溫度為110 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，在粉碎機中粉碎后80目過篩，得到超聲破壁微藻。

1.3.3微藻油脂的甲酯化

試劑的配制：10 mol/L的氫氧化鉀溶液；12 mol/L的硫酸溶液。甲酯化(測定反式脂肪酸TFA，游離脂肪總量)操作步驟如下。

(1)分別精確稱取20 mg(精確至0.1 mg)4種破壁方式提取的油脂樣品放在4個帶蓋的玻璃瓶中。

(2)再分別用移液管移入1 mL的內(nèi)標液(1 mg內(nèi)標Methyi pentadecanoate溶于5 mL色譜純正己烷)于四個玻璃瓶中。

(3)接著再各自移入0.7 mL 10 mol/L KOH溶液和5.3 mL的CH4O，混勻。

(4)在水浴鍋中反應90 min，水浴溫度為55 ℃(每10 min混勻)。

(5)冷卻至室溫，移入0.58 mL 12 mol/L H2SO4溶液，翻轉(zhuǎn)搖勻。

(6)再重復(4)中操作。

(7)冷卻至室溫，分別移入3 mL正己烷，漩渦混合器混合5 min。

(8)轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 離心15 min。

(9)將上清液分別移入4個放有1 mm無水硫酸鈉的中號玻璃瓶中，靜置10 min后用0.22 μm微孔過濾到脂肪酸小樣品瓶中備用。

1.3.4微藻油脂脂肪酸含量的測定

脂肪酸檢測時氣相色譜條件為：SPL1溫度250 ℃；SPL1壓力40 kPa；總流量22.2 mL/min；吹掃流量3.0 mL/min；初始壓力452 kPa；色譜柱初始溫度140.0 ℃；FID1溫度250.0 ℃；FID1尾吹N2流量30.0 mL/min，F(xiàn)ID1氫氣流量40.0 mL/min，F(xiàn)ID1空氣流量399.8 mL/min；進樣量2 μL。梯度升溫程序：0～2 min，140 ℃；2～45 min，220 ℃。

將已經(jīng)甲酯化的四種不同破壁方式破壁的微藻油脂脂肪酸樣品在氣相色譜儀上一一進樣檢測，得到不同脂肪酸的氣相色譜圖，整理各自的保留時間和峰面積，計算不同脂肪酸相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 破壁方式對微藻油脂得率的影響

將之前處理的微藻樣品進行混合溶劑(正己烷∶乙醇=10∶3, v/v)提取油脂試驗，對比了反復凍融破壁、均質(zhì)破壁、膨化破壁、超聲破壁四種破壁方式對油脂得率的影響， 并且與未破壁微藻在相同條件下提取油脂的油脂得率進行了對比，結(jié)果見圖1。

圖1 破壁方式對油脂得率的影響

由圖1可知，對比未破壁微藻與破壁微藻，微藻破壁后對油脂得率有著顯著的影響。未破壁微藻的油脂得率僅為18.31%±0.29%，而反復凍融破壁微藻的油脂得率為24.89%±0.25%，均質(zhì)破壁微藻的油脂得率為22.46%±0.17%，膨化破壁微藻的油脂得率為25.56%±0.12%，超聲破壁微藻的油脂得率為26.19%±0.25%。

可以看出均質(zhì)破壁微藻的油脂得率低于其他三種破壁微藻的油脂得率，這是因為均質(zhì)的溫度為室溫25 ℃左右，對細胞壁的破碎程度不夠。反復凍融主要是靠緩慢凍結(jié)形成較大的冰晶體而使微藻細胞壁和細胞膜破裂，并且凍結(jié)時間越長，形成冰晶體的體積會越大，對細胞壁和細胞膜的破壞程度越大，從而油脂得率相對高點。超聲波是近年來備受青睞的破壁方式，可以看出除了與膨化破壁微藻的油脂得率相近以外，其油脂得率高出其他兩種破壁方式的油脂得率。在此次試驗中膨化破壁微藻的油脂得率也較高，這是因為膨化的條件占了很大的優(yōu)勢，膨化的溫度為110 ℃，較高的溫度會使得微藻細胞壁和細胞膜充分破裂，因而油脂得率相對較高。

2.2 脂肪酸組成分析

利用氣相色譜儀分析脂肪酸，破壁方式對微藻油脂脂肪酸相對含量的影響見表1，不同類脂肪酸所占百分比見圖2。

表1 不同破壁方式的微藻油脂脂肪酸相對含量

從表1中可以看出，使用混合溶劑正己烷∶乙醇=10∶3提取微藻中的油脂，經(jīng)過脂肪酸成分的分析，主要成分為棕櫚酸、棕櫚油酸、十七酸和亞麻酸等，其含量較為豐富。對比不同破壁方式提油后脂肪酸分析得出，除了高壓均質(zhì)破壁微藻油脂中亞麻酸含量相對其他破壁方式提取油脂的亞麻酸含量相對高點，其他脂肪酸相對含量相差較小。微藻油脂中含有10%左右的亞麻酸，作為必需脂肪酸，對人體有很大的益處，皮膚病、腎臟肝臟功能的多種疾病是由于攝入的必需脂肪酸不足引起的。

注：橫坐標1表示超聲破壁微藻油脂；2表示反復凍融破壁微藻油脂；3表示高壓均質(zhì)破壁微藻油脂；4表示膨化破壁微藻油脂。 圖2 不同破壁微藻油脂的不同類脂肪酸所占百分比

從圖2可以看出，膨化破壁微藻油脂中飽和脂肪酸百分含量占到了54%，其他3種破壁方式的微藻油脂占到40%左右，說明膨化破壁更易于飽和脂肪酸的提取。橄欖油、菜籽油、花生油和堅果中的MUFA含量也很豐富，能夠清除體內(nèi)血液中的低密度脂蛋白，很受營養(yǎng)學方面的重視，微藻中單不飽和脂肪酸含量為40%，而花生油中含量為32%，橄欖油中含量為74%，大豆油中含量為27%，可見，微藻中MUFA的含量僅次于橄欖油。又因為微藻易于培養(yǎng)，產(chǎn)量高于橄欖，所以微藻具有很大的優(yōu)勢。

3 總結(jié)

(1)對比四種不同破壁方式的微藻通過混合溶劑正己烷∶乙醇(v/v)=10∶3提取油脂的得率大小，超聲破壁和膨化破壁油脂得率相對較高，超聲破壁微藻油脂得率為26.19%±0.25%，而微擬球藻中總脂含量大約30%，提取率達到了80%以上，因而提油效果最好。

(2)通過氣相色譜儀檢測微藻油脂中脂肪酸成分及含量，4種破壁方式對脂肪酸成分的影響較小，得到藻油脂中棕櫚酸、棕櫚油酸、十七酸和亞麻酸含量較為豐富。

(3)通過分析微藻油脂脂肪酸含量，除了膨化破壁微藻油脂中飽和脂肪酸含量為53%之外，其它破壁方式微藻油脂中SFA含量為40%以上，MUFA含量為40%左右，PUFA為10%左右。

(4)通過比較微藻油脂脂肪酸碳數(shù)，分析得到微藻油脂中脂肪酸偶數(shù)碳達到80%以上，因而可以得出微藻油脂中脂肪酸以偶數(shù)碳為主。