韋曉霞 王小安 陳 瑾 賴瑞聯(lián) 吳如健

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，福建福州 350013)

百香果(Passiflora eduliaSims)也稱雞蛋果、紫果西番蓮、黃果西番蓮，廣泛種植于我國(guó)熱帶與亞熱帶地區(qū)，其果實(shí)多汁、香氣濃郁，且富含類黃酮、生物堿等生物活性成分，是一種廣受歡迎的水果[1]。此外，百香果花大而獨(dú)特，多樣性豐富，具備較好的觀賞價(jià)值。因此，百香果是一種兼具食用、藥用與觀賞價(jià)值的藤本果類，具有較高的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。百香果種植于高緯度或高海拔地區(qū)易遭受低溫凍害，即使在現(xiàn)有主產(chǎn)區(qū)，也常受到異常極端低溫天氣的危害。低溫凍害已成為百香果產(chǎn)業(yè)面臨的重要限制因子，影響其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和輻射推廣。然而，目前百香果的研究主要集中在引種、栽培、果實(shí)品質(zhì)以及采后加工等方面[1-3]，在抗寒和低溫脅迫方面的研究較少[4-6]。在已有報(bào)道中，陳穎等[7]研究了百香果在低溫脅迫下生理生化及顯微結(jié)構(gòu)變化，認(rèn)為低溫預(yù)冷是提高其抗凍性的有效措施之一；董萬(wàn)鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi)隨著處理溫度的下降，百香果枝條中相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖及脯氨酸含量呈上升的趨勢(shì)，抗寒性較好的葉片柵/海比例較高、組織結(jié)構(gòu)較為緊密以及具有更大的葉脈突起且葉脈厚而葉片薄的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。然而，關(guān)于百香果低溫脅迫響應(yīng)或抗寒機(jī)理方面的研究較少，一定程度上影響了生物技術(shù)手段在百香果育種和產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。

低溫寒害是熱帶亞熱帶作物產(chǎn)業(yè)中普遍存在的自然限制因子。研究表明，植物受到冷脅迫后，能夠誘導(dǎo)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)或抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而改變細(xì)胞膜特性、調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉以及調(diào)控脯氨酸等物質(zhì)的合成與降解等，進(jìn)而提高植物的抗寒能力[8-10]。水稻細(xì)胞膜上的低溫感受器能夠在感知低溫刺激后觸發(fā)鈣信號(hào)產(chǎn)生，進(jìn)而對(duì)鈣/鈣調(diào)素調(diào)控類受體激酶(calcium/calmodulin-regulated receptor-like kinase，CRLKs)、鈣依賴性蛋白激酶(Ca2＋-dependent protein kinases，CPKs)、鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白(calcineurin Blike protein，CBLs)、鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白激酶(CBLinteracting protein kinase，CIPKs)的表達(dá)水平產(chǎn)生影響，然后通過(guò)ICE1(inducer of CBF expression1) 或CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)等轉(zhuǎn)錄因子影響相關(guān)基因表達(dá)[11]；植物中SnRK2s(sucrose non-fermenting-related protein kinase 2s)在收到低溫信號(hào)后可通過(guò)直接調(diào)控ICE1 或間接調(diào)控HOS1(high expression of osmotically responsive genes 1)轉(zhuǎn)錄[12]，ICE1 再通過(guò)CBFs(C-repeat-binding factors)調(diào)控下游COR(cold-regulated gene)的表達(dá)水平，從而響應(yīng)低溫脅迫[13]。此外，MYBs(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog transcription factors)、WRKYs(WRKYtype transcription factors) 及ZATs(zinc finger protein transcription factors)等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗寒或低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[14]。

茉莉酸(jasmonic acid，JA)是植物體內(nèi)非常重要的一類激素。在香蕉(Musa nanaLour.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、菠菜(Spinacia oleraceaL.)[17]及甜瓜(Cucumis meloL.)[18]等植物上的研究表明，茉莉酸類物質(zhì)可以提高植物對(duì)冷脅迫的抗性，且能夠與脫落酸(abscisic acid，ABA)代謝途徑相互影響[19]。植物茉莉酸代謝過(guò)程較為明確，其中丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase，AOS)與丙二烯氧化物環(huán)化酶(allene oxide cyclase，AOC)調(diào)控茉莉酸類物質(zhì)生物合成[20-24]，茉莉酸氨基合酶(jasmonate resistant 1，JAR1)參與茉莉酸代謝的信號(hào)傳遞[25]，茉莉酸信號(hào)受體蛋白(coronatine-insensitive protein 1，COI1)參與茉莉酸介導(dǎo)的防御響應(yīng)[26]，JAZ 蛋白(jasmonate ZIM-domain)參與茉莉酸信號(hào)傳遞且與MYB、AOC 及MYC2 存在互作關(guān)系[27-32]，MYC2 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor MYC2)是茉莉酸信號(hào)傳遞的核心轉(zhuǎn)錄因子，且可與COI1 及JAZ形成復(fù)合體作為茉莉酸信號(hào)的核心模塊[33]，同時(shí)MYC2在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中可能通過(guò)ABA 受體類蛋白PYL (pyrabactin resistance like )/PYR (pyrabactin resistance)建立聯(lián)系[34]。目前，百香果低溫脅迫下JA代謝途徑在其中的響應(yīng)方式鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以紫果百香果為材料，開(kāi)展百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組研究，并從中挖掘JA 代謝途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因，以期為進(jìn)一步研究百香果抗寒機(jī)制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用同一株生長(zhǎng)正常的百香果植株剪取枝條進(jìn)行扦插，同一水平下進(jìn)行管理，選擇生長(zhǎng)相對(duì)一致、苗高約為60 cm 的扦插苗為試驗(yàn)材料，分別進(jìn)行低溫脅迫處理(LT，0℃處理24 h)和常溫處理(CK，25℃處理24 h)。每個(gè)處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。處理后采集頂端向下第3 和第4 片葉片液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(離心柱型)，北京全式金生物技術(shù)有限公司；mRNA 富集用的磁珠mRNA Capture BeadsRNA，南京諾唯贊生物科技有限公司；文庫(kù)構(gòu)建試劑盒NEBNext? UltraTMRNA Library Prep Kit，美國(guó)New England Biolabs 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel)，北京全式金生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 試劑盒TransStart? Top Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；2720 PCR 儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Vortex-Genie 2 漩渦震蕩器，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；BE-1100 四維旋轉(zhuǎn)儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Illumina HiSeq X-Ten 高通量測(cè)序儀，美國(guó)Illumina 公司；Eppendorf Realplex4熒光定量PCR 儀，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和數(shù)據(jù)組裝 提取樣品總RNA，去除核糖體RNA 后分離純化mRNA 樣品檢測(cè)合格后，基于Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建百香果轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。使用Illumina Hiseq 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，截除Reads 中的測(cè)序接頭以及引物序列并過(guò)濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，最終獲得高質(zhì)量Reads。

1.3.2 基因表豐度檢測(cè)與差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 采用Bowtie 將測(cè)序得到的Reads 與Unigene 庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，結(jié)合RSEM 進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM(fragments per kilobase per million reads)值表示對(duì)應(yīng)Unigene 的表達(dá)豐度。隨后，采用DESeq2 進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，采用Benjamini-Hochberg 方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值進(jìn)行校正，并最終采用校正后的P值，即FDR(false discovery rate)作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。在篩選過(guò)程中，將FDR 小于0.01且差異倍數(shù)FC(fold change)大于等于2 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中，F(xiàn)C 表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值。

1.3.3 DEGs 功能注釋與代謝途徑富集分析 使用BLAST 軟件將Unigene 序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，使用KOBAS 得到Unigene 在KEGG 中的KEGG Orthology結(jié)果[35]，預(yù)測(cè)完Unigene 的氨基酸序列之后使用HMMER 軟件與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得Unigene 的注釋信息[36]。此外，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分類[37]。

1.3.4 JA 代謝途徑相關(guān)基因篩選與驗(yàn)證 通過(guò)分析DEGs 的功能注釋，篩選百香果茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)獲得逆轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)篩選出的基因的Unigene 序列設(shè)計(jì)并合成引物進(jìn)行qRTPCR。檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率后，根據(jù)qRTPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)液，20 μL 反應(yīng)體系中包含反應(yīng)液10 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL、熒光染料Ⅰ(50×) 0.4 μL、cDNA 模板2.0 μL、ddH2O 6.8 μL。引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性30 s；94℃變性10 s，退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40 次；之后溫度回升至94℃保持15 s，隨后降至60℃保持15 s，再以0.11℃·s-1的速度升溫至94℃保持15 s，繪制溶解曲線。所采集的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[38]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝與分析

由表2可知，CK 的堿基數(shù)量介于6.83 G～7.36 G之間，LT 的堿基數(shù)量介于6.59 G～7.35 G 之間。各樣品的Q20 堿基百分比均大于98%，Q30 堿基百分比均大于94%，說(shuō)明所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。在堿基成分方面，GC 介于45%～46%之間。組裝共得到39 521條Unigene，N50 值為1 991(5.04%)，平均長(zhǎng)度為1 145.47 bp，其中長(zhǎng)度介于300～500 bp 的Unigene 數(shù)量為16 019，占比最大，達(dá)40.53%(表3)。由圖1所示的6 個(gè)樣品主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果可知，CK 與LT 分別聚為一類，即生物學(xué)重復(fù)樣品間重復(fù)性好。由此可見(jiàn)，百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組的組裝結(jié)果的完整性較高，可用于后續(xù)分析。

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表Table 2 Data evaluation statistics of transcriptome

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistics of transcriptome assembly results

2.2 Unigene 注釋

低溫脅迫下，百香果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的Unigene注釋結(jié)果如圖2所示。最終獲得28 889 個(gè)有注釋信息的Unigene，占所有Unigene 的73.10%。其中長(zhǎng)度大于等于300 bp 且小于1 000 bp 的Unigene 數(shù)量為15 756(54.54%)，大于等于1 000 bp 的數(shù)量為13 133(45.46%)。在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中，COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量最少，為9 585，占比僅為33.18%；GO 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為17 530，占比60.68%；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為11 811，占比40.88%；KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為16 528，占比57.21%；Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為19 865，占比68.76%；Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為20 728，占比71.75%；eggNOG 4.5 數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene 數(shù)量為27 410，占比94.89%；注釋NR 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene數(shù)量最多，為28 755，占比高達(dá)99.54%。

2.3 差異表達(dá)基因鑒定

基于DEGs 分析結(jié)果，不同處理和生物重復(fù)間百香果轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性分析結(jié)果如圖3-A 所示，CK 的3 個(gè)生物重復(fù)樣品與LT 的3 個(gè)生物重復(fù)樣品均分別聚為一類，不同處理間轉(zhuǎn)錄組的相似系數(shù)介于0.573～0.761，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組差異基因篩選結(jié)果較為可靠。進(jìn)一步篩選，低溫脅迫處理后獲得百香果5 311 個(gè)DEGs(圖3-B)，其中LT 相對(duì)于CK 上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為2 533(47.69%)，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為2 778(52.31%)。

2.4 差異表達(dá)基因GO 分類

被GO 注釋的17 530 個(gè)Unigene 中DEGs 為2 601個(gè)(14.84%)。轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因GO 分類結(jié)果如圖4所示，被注釋的Unigene 分為細(xì)胞組件、分子功能及生物過(guò)程三大類。其中，細(xì)胞組分大類可進(jìn)一步分為16 個(gè)小類；分子功能大類分為15 個(gè)小類；生物過(guò)程大類分為21 個(gè)小類。

根據(jù)GO 分類結(jié)果，DEGs 數(shù)量最多的亞類為生物過(guò)程大類的代謝過(guò)程，數(shù)量為1 414，占該類型Unigene總數(shù)15.08%，包括甾醇生物合成、類黃酮糖脂化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長(zhǎng)鏈脂肪-?；o酶A 代謝等。DEGs占該類型Unigene 總數(shù)比例最大的小類為分子功能大類中的金屬伴侶蛋白活性亞類，僅包含2 個(gè)Unigene，其中一個(gè)為差異基因即細(xì)胞色素C 氧化酶基因，另一個(gè)是銅/鋅超氧化物歧化酶基因。此外，生物過(guò)程大類中信號(hào)小類注釋的差異基因數(shù)量為118，占該類型Unigene 比例為14.82%，包括3 個(gè)親離子谷氨酸受體信號(hào)通路的谷氨酸受體基因，即c50649.graph＿c0(GLR3.7)、c53352.graph＿c0(GLR3.2)和c54428.graph＿c0(GLR2.7)。

2.5 KEGG 富集分析

KEGG 富集結(jié)果中，DEGs 數(shù)量排名前十和具有顯著性差異的KEGG 代謝途徑如表4和表5所示。從所獲得的DEGs 數(shù)量上看，百香果低溫脅迫下富集的主要代謝通路包括核糖體、淀粉與蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳代謝、氨基酸生物合成、植物與病原體互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、苯丙素生物合成、嘌呤代謝和內(nèi)吞作用等10 種。以P值作為參考，KEGG 富集的顯著性代謝通路有核糖體、淀粉與蔗糖代謝、氰胺酸代謝、植物與病原體互作、DNA 復(fù)制、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、核糖體在真核生物中的生物發(fā)生、卟啉和葉綠素代謝、單萜類生物合成、牛磺酸和次?；撬岽x。其中，核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及植物與病原體互作途徑中DEGs 數(shù)量較多，且差異存在顯著性，可能是參與百香果低溫脅迫響應(yīng)的重要代謝途徑。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在多種植物抗寒或低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中均發(fā)揮了重要生物學(xué)功能。為進(jìn)一步研究百香果激素信號(hào)途徑響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)低溫脅迫下該途徑的DEGs 進(jìn)行了分析。

表4 差異基因數(shù)量前十的KEGG 代謝途徑Table 4 Top 10 KEGG pathways of DEGs number

表5 顯著性差異的KEGG 代謝途徑Table 5 Significant difference KEGG pathways

百香果低溫脅迫過(guò)程中，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的DEGs 如表6所示，其中，上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?2 個(gè)，下調(diào)表達(dá)29 個(gè)，總體上看激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝被激活了。這些差異表達(dá)基因中，生長(zhǎng)素、JA、ABA 等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因，例如MYC2、生長(zhǎng)素相應(yīng)因子基因(auxin response factor，ARF)、吲哚乙酸氨基化合成酶基因(indole-3-acetic acid-amido synthetase gene，GH3)、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因(auxin-responsive protein gene，SAUR)、蛋白磷酸酶2C 基因(protein phosphatase 2C gene，PP2C)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2 基因(serine/threonine-protein kinase SRK2 gene，SRK2)等同時(shí)存在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)類型，說(shuō)明這些基因的不同成員可能在低溫脅迫過(guò)程中存在功能多樣性；油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BSK基因(serine/threonine-protein kinase BSK gene，BSK)與植物轉(zhuǎn)錄因子基因(plant transcription factor BZR，BZR)上調(diào)表達(dá)，而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BRI1 基因(serine/threonine-protein kinase BRI1 gene，BRI1)下調(diào)表達(dá)；乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)乙烯受體蛋白基因(ethylene receptor gene，ETR)、受體互作蛋白持續(xù)三重反應(yīng)基因1(constitutive triple response gene1，CTR1)、乙烯不敏感基因3(ethylene insensitive gene 3，EIN3)、乙烯不敏感基因3 F-box 結(jié)合蛋白基因(EIN3-binding F-box protein gene，EBF)與乙烯受體轉(zhuǎn)錄因子1 基因(ethylene-responsive transcription factor 1，ERF1)均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)生長(zhǎng)素蛋白基因(auxin protein gene，AUX)、吲哚乙酸蛋白基因(indoleacetic acids protein gene，IAA)與轉(zhuǎn)運(yùn)抑制響應(yīng)蛋白基因1(transport inhibitor response protein gene 1，TIR1)均下調(diào)表達(dá)；細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因細(xì)胞分裂素結(jié)合受體組氨酸激酶基因(arabidopsis histidine kinase gene 2/3/4，AHK2/3/4)與磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(arabidopsis histidinephosphotransfer protein gene，AHP)均下調(diào)表達(dá)；赤霉素抑制基因DELLA下調(diào)表達(dá)；水楊酸代謝途徑關(guān)鍵基因TGA轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor TGA)和病程相關(guān)蛋白基因1(pathogenesis-related protein gene 1，PR-1)也呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)?？梢?jiàn)，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、ABA、乙烯、油菜素內(nèi)酯、JA、水楊酸等植物激素均參與了百香果低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程。值得注意的是，茉莉酸途徑相關(guān)的JAR1 與JAZ均上調(diào)表達(dá)而COI1 下調(diào)表達(dá)，而與ABA 途徑的連接橋梁PYL基因上調(diào)表達(dá)，而MYC2 家族不同成員同時(shí)存在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象，說(shuō)明該代謝途徑在百香果低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中存在重要的調(diào)控功能。

表6 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中差異基因統(tǒng)計(jì)表Table 6 Statistics of DEGs in plant hormone signal transduction pathway

2.6 JA 代謝相關(guān)基因挖掘

低溫脅迫下，百香果茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及相關(guān)基因的變化如圖5，其中JAR1 和JAZ為上調(diào)表達(dá)基因，COI1 為下調(diào)表達(dá)基因，MYC2 基因同時(shí)存在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。此外，AOC、AOS與PYL也是植物茉莉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。這些基因在不同處理組中的FPKM(fragments per kilobase million)值的變化趨勢(shì)及qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果如表7所示，F(xiàn)PKM 值與qRTPCR 驗(yàn)證結(jié)果的變化趨勢(shì)基本一致但變化的幅度略有差異。與CK 相比，LT 中c27852.graph＿c0(AOC)、c48197.graph＿c0(JAR1)、c52002.graph＿c0(JAZ)、c52048.graph＿c0(JAZ)、c49063.graph＿c0(MYC2)、c54914.graph＿c0(MYC2)與c36787.graph＿c1(PYL)均顯著上調(diào)表達(dá)，而c55075.graph＿c0(COI1)顯著下調(diào)。然而，與CK 相比，LT 中c54609.graph＿c0(AOS)、c42174.graph＿c0(JAZ)、c36235.graph＿c0(MYC2)及c54944.graph＿c0(PYL)的FPKM 值無(wú)顯著差異，但qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，分別達(dá)到CK 的3.35、2.49、1.62 及2.68 倍?？梢?jiàn)，低溫處理能夠促進(jìn)百香果茉莉酸生物合成相關(guān)的AOC與AOS轉(zhuǎn)錄，且受JA 直接正調(diào)控的JAR1、調(diào)控抗寒相關(guān)功能基因表達(dá)的MYC2 以及茉莉酸途徑與ABA 途徑關(guān)聯(lián)基因PYL的表達(dá)水平也顯著提高，與JA 在模式植物低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制基本一致。然而，低溫處理后，百香果中COI1 表達(dá)水平下降進(jìn)而負(fù)調(diào)控JAZ表達(dá)水平上升，這一結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

表7 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因FPKM 值與qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)Table 7 The FPKM value and relative expression by qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

3 討論

高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是植物差異表達(dá)基因挖掘、代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物學(xué)機(jī)理研究的重要手段。本研究中，百香果轉(zhuǎn)錄組各樣品的Q20 的堿基百分比均大于98%，且Q30 的堿基百分比均大于94%[39]，GC 含量介于45%～46%之間[5，40]，Unigene 的N50 值大于長(zhǎng)度平均值，此外qRT-PCR 驗(yàn)證的基因表達(dá)趨勢(shì)基本與轉(zhuǎn)錄組FPKM 值預(yù)測(cè)基本一致。因此，所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果較好，能夠滿足后續(xù)分析要求。

由百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組GO 分類的結(jié)果可知，生物過(guò)程大類中的代謝過(guò)程是DEGs 數(shù)量最多的類型，其注釋的DEGs 涉及甾醇生物合成、類黃酮葡萄苷酸化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長(zhǎng)鏈脂肪-?；o酶A 代謝等生物過(guò)程。這些代謝途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程在其他植物中的生物調(diào)控功能也已有相關(guān)報(bào)道。其中，甾醇生物合成過(guò)程與長(zhǎng)鏈脂肪-?；o酶A 代謝過(guò)程與植物細(xì)胞的質(zhì)膜穩(wěn)定性有關(guān)[41-42]，類黃酮葡萄苷酸化能夠促進(jìn)植物體內(nèi)類黃酮葡萄苷酸化進(jìn)而提高其解毒能力[43]，酪氨酸代謝與L-苯丙氨酸生物合成可能促進(jìn)植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的合成[44]，芥子油苷代謝能夠調(diào)控芥子油苷合成與分解且與茉莉酸途徑相關(guān)[45]，而軟木脂生物合成會(huì)促進(jìn)細(xì)胞壁成分之一的軟木脂合成[46]。此外，GO 分類的信號(hào)亞類注釋的DEGs 中包括3 個(gè)谷氨酸受體基因，即GLR3.7、GLR3.2 和GLR2.7，與前人的研究報(bào)道一致[47]，而這3 個(gè)GLR基因家族成員編碼冷受體的功能上的區(qū)別與聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。

基于KEGG 富集分析結(jié)果，低溫處理后百香果通過(guò)核糖體、淀粉與糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物與病原菌互作等多個(gè)途徑綜合作用提高自身對(duì)低溫的抵抗能力。其中，作為調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境脅迫重要的過(guò)程，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同樣在百香果低溫脅迫過(guò)程中存在顯著變化。低溫處理后，百香果中抗性相關(guān)的JA、ABA 與赤霉素等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均被激活[9，11，48-49]，而與植物生長(zhǎng)相關(guān)的生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素等代謝途徑總體上被抑制導(dǎo)致百香果體內(nèi)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素含量下降，進(jìn)而影響JA 與ABA 等代謝途徑[50-51]。

低溫脅迫后，百香果茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，AOC[21]與AOS[20，52]通過(guò)提高自身表達(dá)量從而促進(jìn)茉莉酸類物質(zhì)的生物合成，經(jīng)過(guò)JAR1[25]等基因的信號(hào)傳遞從而提高M(jìn)YC2[53]的表達(dá)，進(jìn)而提高相關(guān)抗寒功能基因的表達(dá)。同時(shí)，以PYL作為橋梁，茉莉酸信號(hào)亦被傳遞到ABA 途徑，共同提高百香果的抗低溫能力[34，54]。此外，本試驗(yàn)中，JAR1 對(duì)COI1 的調(diào)控可能隨著低溫處理的進(jìn)程或因COI1 不同成員之間的區(qū)別而變化，同樣，JAZ不同成員對(duì)MYC2 的調(diào)控也存在類似現(xiàn)象，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因則有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究[32-33]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)所獲得的百香果測(cè)序結(jié)果較為可靠準(zhǔn)確，其中核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及植物與病原體互作途徑是百香果響應(yīng)低溫脅迫的重要代謝途徑。此外，茉莉酸代謝途徑的關(guān)鍵基因AOC、AOS、JAR1 與PYL對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制與模式植物基本一致，但COI1 和MYC2 等基因的調(diào)控方式較為特殊。本研究結(jié)果為揭示百香果抗寒機(jī)制提供了科學(xué)參考。