韋曉霞 王小安 陳 瑾 賴瑞聯(lián) 吳如健

(福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，福建福州 350013)

百香果(Passiflora eduliaSims)也稱雞蛋果、紫果西番蓮、黃果西番蓮，廣泛種植于我國熱帶與亞熱帶地區(qū)，其果實多汁、香氣濃郁，且富含類黃酮、生物堿等生物活性成分，是一種廣受歡迎的水果[1]。此外，百香果花大而獨特，多樣性豐富，具備較好的觀賞價值。因此，百香果是一種兼具食用、藥用與觀賞價值的藤本果類，具有較高的研究開發(fā)價值。百香果種植于高緯度或高海拔地區(qū)易遭受低溫凍害，即使在現(xiàn)有主產(chǎn)區(qū)，也常受到異常極端低溫天氣的危害。低溫凍害已成為百香果產(chǎn)業(yè)面臨的重要限制因子，影響其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和輻射推廣。然而，目前百香果的研究主要集中在引種、栽培、果實品質(zhì)以及采后加工等方面[1-3]，在抗寒和低溫脅迫方面的研究較少[4-6]。在已有報道中，陳穎等[7]研究了百香果在低溫脅迫下生理生化及顯微結(jié)構(gòu)變化，認為低溫預冷是提高其抗凍性的有效措施之一；董萬鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi)隨著處理溫度的下降，百香果枝條中相對電導率、可溶性糖及脯氨酸含量呈上升的趨勢，抗寒性較好的葉片柵/海比例較高、組織結(jié)構(gòu)較為緊密以及具有更大的葉脈突起且葉脈厚而葉片薄的結(jié)構(gòu)特點。然而，關(guān)于百香果低溫脅迫響應或抗寒機理方面的研究較少，一定程度上影響了生物技術(shù)手段在百香果育種和產(chǎn)業(yè)中的應用。

低溫寒害是熱帶亞熱帶作物產(chǎn)業(yè)中普遍存在的自然限制因子。研究表明，植物受到冷脅迫后，能夠誘導一系列的信號轉(zhuǎn)導，啟動或抑制相關(guān)基因的表達，從而改變細胞膜特性、調(diào)節(jié)氣孔開閉以及調(diào)控脯氨酸等物質(zhì)的合成與降解等，進而提高植物的抗寒能力[8-10]。水稻細胞膜上的低溫感受器能夠在感知低溫刺激后觸發(fā)鈣信號產(chǎn)生，進而對鈣/鈣調(diào)素調(diào)控類受體激酶(calcium/calmodulin-regulated receptor-like kinase，CRLKs)、鈣依賴性蛋白激酶(Ca2＋-dependent protein kinases，CPKs)、鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白(calcineurin Blike protein，CBLs)、鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白激酶(CBLinteracting protein kinase，CIPKs)的表達水平產(chǎn)生影響，然后通過ICE1(inducer of CBF expression1) 或CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)等轉(zhuǎn)錄因子影響相關(guān)基因表達[11]；植物中SnRK2s(sucrose non-fermenting-related protein kinase 2s)在收到低溫信號后可通過直接調(diào)控ICE1 或間接調(diào)控HOS1(high expression of osmotically responsive genes 1)轉(zhuǎn)錄[12]，ICE1 再通過CBFs(C-repeat-binding factors)調(diào)控下游COR(cold-regulated gene)的表達水平，從而響應低溫脅迫[13]。此外，MYBs(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog transcription factors)、WRKYs(WRKYtype transcription factors) 及ZATs(zinc finger protein transcription factors)等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗寒或低溫脅迫響應過程中也發(fā)揮了重要作用[14]。

茉莉酸(jasmonic acid，JA)是植物體內(nèi)非常重要的一類激素。在香蕉(Musa nanaLour.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、菠菜(Spinacia oleraceaL.)[17]及甜瓜(Cucumis meloL.)[18]等植物上的研究表明，茉莉酸類物質(zhì)可以提高植物對冷脅迫的抗性，且能夠與脫落酸(abscisic acid，ABA)代謝途徑相互影響[19]。植物茉莉酸代謝過程較為明確，其中丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase，AOS)與丙二烯氧化物環(huán)化酶(allene oxide cyclase，AOC)調(diào)控茉莉酸類物質(zhì)生物合成[20-24]，茉莉酸氨基合酶(jasmonate resistant 1，JAR1)參與茉莉酸代謝的信號傳遞[25]，茉莉酸信號受體蛋白(coronatine-insensitive protein 1，COI1)參與茉莉酸介導的防御響應[26]，JAZ 蛋白(jasmonate ZIM-domain)參與茉莉酸信號傳遞且與MYB、AOC 及MYC2 存在互作關(guān)系[27-32]，MYC2 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor MYC2)是茉莉酸信號傳遞的核心轉(zhuǎn)錄因子，且可與COI1 及JAZ形成復合體作為茉莉酸信號的核心模塊[33]，同時MYC2在ABA 信號轉(zhuǎn)導途徑中可能通過ABA 受體類蛋白PYL (pyrabactin resistance like )/PYR (pyrabactin resistance)建立聯(lián)系[34]。目前，百香果低溫脅迫下JA代謝途徑在其中的響應方式鮮見報道。因此，本研究以紫果百香果為材料，開展百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組研究，并從中挖掘JA 代謝途徑相關(guān)的差異表達基因，以期為進一步研究百香果抗寒機制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用同一株生長正常的百香果植株剪取枝條進行扦插，同一水平下進行管理，選擇生長相對一致、苗高約為60 cm 的扦插苗為試驗材料，分別進行低溫脅迫處理(LT，0℃處理24 h)和常溫處理(CK，25℃處理24 h)。每個處理進行3 次生物學重復。處理后采集頂端向下第3 和第4 片葉片液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(離心柱型)，北京全式金生物技術(shù)有限公司；mRNA 富集用的磁珠mRNA Capture BeadsRNA，南京諾唯贊生物科技有限公司；文庫構(gòu)建試劑盒NEBNext? UltraTMRNA Library Prep Kit，美國New England Biolabs 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel)，北京全式金生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 試劑盒TransStart? Top Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設備

Eppendorf 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；2720 PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Vortex-Genie 2 漩渦震蕩器，北京中西遠大科技有限公司；BE-1100 四維旋轉(zhuǎn)儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Illumina HiSeq X-Ten 高通量測序儀，美國Illumina 公司；Eppendorf Realplex4熒光定量PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建和數(shù)據(jù)組裝 提取樣品總RNA，去除核糖體RNA 后分離純化mRNA 樣品檢測合格后，基于Illumina HiSeq X Ten 測序平臺，構(gòu)建百香果轉(zhuǎn)錄組文庫。使用Illumina Hiseq 高通量測序平臺對cDNA 文庫進行測序。對獲得的數(shù)據(jù)進行質(zhì)量檢測，截除Reads 中的測序接頭以及引物序列并過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，最終獲得高質(zhì)量Reads。

1.3.2 基因表豐度檢測與差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 采用Bowtie 將測序得到的Reads 與Unigene 庫進行比對，根據(jù)比對結(jié)果，結(jié)合RSEM 進行表達量水平估計。利用FPKM(fragments per kilobase per million reads)值表示對應Unigene 的表達豐度。隨后，采用DESeq2 進行樣品組間的差異表達分析，采用Benjamini-Hochberg 方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值進行校正，并最終采用校正后的P值，即FDR(false discovery rate)作為差異表達基因篩選的關(guān)鍵指標。在篩選過程中，將FDR 小于0.01且差異倍數(shù)FC(fold change)大于等于2 作為篩選標準。其中，F(xiàn)C 表示兩樣品(組)間表達量的比值。

1.3.3 DEGs 功能注釋與代謝途徑富集分析 使用BLAST 軟件將Unigene 序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG 數(shù)據(jù)庫比對，使用KOBAS 得到Unigene 在KEGG 中的KEGG Orthology結(jié)果[35]，預測完Unigene 的氨基酸序列之后使用HMMER 軟件與Pfam 數(shù)據(jù)庫比對獲得Unigene 的注釋信息[36]。此外，對差異表達基因進行GO 分類[37]。

1.3.4 JA 代謝途徑相關(guān)基因篩選與驗證 通過分析DEGs 的功能注釋，篩選百香果茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因。參照試劑盒說明書獲得逆轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)篩選出的基因的Unigene 序列設計并合成引物進行qRTPCR。檢測引物的特異性和擴增效率后，根據(jù)qRTPCR 試劑盒說明書配置反應液，20 μL 反應體系中包含反應液10 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL、熒光染料Ⅰ(50×) 0.4 μL、cDNA 模板2.0 μL、ddH2O 6.8 μL。引物序列見表1。qRT-PCR 擴增程序:94℃預變性30 s；94℃變性10 s，退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40 次；之后溫度回升至94℃保持15 s，隨后降至60℃保持15 s，再以0.11℃·s-1的速度升溫至94℃保持15 s，繪制溶解曲線。所采集的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[38]計算基因的相對表達量。

表1 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)組裝與分析

由表2可知，CK 的堿基數(shù)量介于6.83 G～7.36 G之間，LT 的堿基數(shù)量介于6.59 G～7.35 G 之間。各樣品的Q20 堿基百分比均大于98%，Q30 堿基百分比均大于94%，說明所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。在堿基成分方面，GC 介于45%～46%之間。組裝共得到39 521條Unigene，N50 值為1 991(5.04%)，平均長度為1 145.47 bp，其中長度介于300～500 bp 的Unigene 數(shù)量為16 019，占比最大，達40.53%(表3)。由圖1所示的6 個樣品主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果可知，CK 與LT 分別聚為一類，即生物學重復樣品間重復性好。由此可見，百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組的組裝結(jié)果的完整性較高，可用于后續(xù)分析。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計表Table 2 Data evaluation statistics of transcriptome

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計表Table 3 Statistics of transcriptome assembly results

2.2 Unigene 注釋

低溫脅迫下，百香果轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene注釋結(jié)果如圖2所示。最終獲得28 889 個有注釋信息的Unigene，占所有Unigene 的73.10%。其中長度大于等于300 bp 且小于1 000 bp 的Unigene 數(shù)量為15 756(54.54%)，大于等于1 000 bp 的數(shù)量為13 133(45.46%)。在這些數(shù)據(jù)庫中，COG 數(shù)據(jù)庫注釋Unigene 數(shù)量最少，為9 585，占比僅為33.18%；GO 數(shù)據(jù)庫注釋Unigene 數(shù)量為17 530，占比60.68%；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋Unigene 數(shù)量為11 811，占比40.88%；KOG 數(shù)據(jù)庫注釋Unigene 數(shù)量為16 528，占比57.21%；Pfam 數(shù)據(jù)庫注釋Unigene 數(shù)量為19 865，占比68.76%；Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫注釋Unigene 數(shù)量為20 728，占比71.75%；eggNOG 4.5 數(shù)據(jù)庫Unigene 數(shù)量為27 410，占比94.89%；注釋NR 數(shù)據(jù)庫注釋Unigene數(shù)量最多，為28 755，占比高達99.54%。

2.3 差異表達基因鑒定

基于DEGs 分析結(jié)果，不同處理和生物重復間百香果轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性分析結(jié)果如圖3-A 所示，CK 的3 個生物重復樣品與LT 的3 個生物重復樣品均分別聚為一類，不同處理間轉(zhuǎn)錄組的相似系數(shù)介于0.573～0.761，說明轉(zhuǎn)錄組差異基因篩選結(jié)果較為可靠。進一步篩選，低溫脅迫處理后獲得百香果5 311 個DEGs(圖3-B)，其中LT 相對于CK 上調(diào)表達基因數(shù)量為2 533(47.69%)，下調(diào)表達基因數(shù)量為2 778(52.31%)。

2.4 差異表達基因GO 分類

被GO 注釋的17 530 個Unigene 中DEGs 為2 601個(14.84%)。轉(zhuǎn)錄組差異表達基因GO 分類結(jié)果如圖4所示，被注釋的Unigene 分為細胞組件、分子功能及生物過程三大類。其中，細胞組分大類可進一步分為16 個小類；分子功能大類分為15 個小類；生物過程大類分為21 個小類。

根據(jù)GO 分類結(jié)果，DEGs 數(shù)量最多的亞類為生物過程大類的代謝過程，數(shù)量為1 414，占該類型Unigene總數(shù)15.08%，包括甾醇生物合成、類黃酮糖脂化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長鏈脂肪-?；o酶A 代謝等。DEGs占該類型Unigene 總數(shù)比例最大的小類為分子功能大類中的金屬伴侶蛋白活性亞類，僅包含2 個Unigene，其中一個為差異基因即細胞色素C 氧化酶基因，另一個是銅/鋅超氧化物歧化酶基因。此外，生物過程大類中信號小類注釋的差異基因數(shù)量為118，占該類型Unigene 比例為14.82%，包括3 個親離子谷氨酸受體信號通路的谷氨酸受體基因，即c50649.graph＿c0(GLR3.7)、c53352.graph＿c0(GLR3.2)和c54428.graph＿c0(GLR2.7)。

2.5 KEGG 富集分析

KEGG 富集結(jié)果中，DEGs 數(shù)量排名前十和具有顯著性差異的KEGG 代謝途徑如表4和表5所示。從所獲得的DEGs 數(shù)量上看，百香果低溫脅迫下富集的主要代謝通路包括核糖體、淀粉與蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導、碳代謝、氨基酸生物合成、植物與病原體互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、苯丙素生物合成、嘌呤代謝和內(nèi)吞作用等10 種。以P值作為參考，KEGG 富集的顯著性代謝通路有核糖體、淀粉與蔗糖代謝、氰胺酸代謝、植物與病原體互作、DNA 復制、植物信號轉(zhuǎn)導途徑、核糖體在真核生物中的生物發(fā)生、卟啉和葉綠素代謝、單萜類生物合成、?；撬岷痛闻；撬岽x。其中，核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑及植物與病原體互作途徑中DEGs 數(shù)量較多，且差異存在顯著性，可能是參與百香果低溫脅迫響應的重要代謝途徑。植物激素信號轉(zhuǎn)導在多種植物抗寒或低溫脅迫響應過程中均發(fā)揮了重要生物學功能。為進一步研究百香果激素信號途徑響應低溫脅迫的機制，本試驗對低溫脅迫下該途徑的DEGs 進行了分析。

表4 差異基因數(shù)量前十的KEGG 代謝途徑Table 4 Top 10 KEGG pathways of DEGs number

表5 顯著性差異的KEGG 代謝途徑Table 5 Significant difference KEGG pathways

百香果低溫脅迫過程中，激素信號轉(zhuǎn)導途徑的DEGs 如表6所示，其中，上調(diào)表達基因為42 個，下調(diào)表達29 個，總體上看激素信號轉(zhuǎn)導代謝被激活了。這些差異表達基因中，生長素、JA、ABA 等激素信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵基因，例如MYC2、生長素相應因子基因(auxin response factor，ARF)、吲哚乙酸氨基化合成酶基因(indole-3-acetic acid-amido synthetase gene，GH3)、生長素響應蛋白基因(auxin-responsive protein gene，SAUR)、蛋白磷酸酶2C 基因(protein phosphatase 2C gene，PP2C)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2 基因(serine/threonine-protein kinase SRK2 gene，SRK2)等同時存在上調(diào)和下調(diào)表達類型，說明這些基因的不同成員可能在低溫脅迫過程中存在功能多樣性；油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BSK基因(serine/threonine-protein kinase BSK gene，BSK)與植物轉(zhuǎn)錄因子基因(plant transcription factor BZR，BZR)上調(diào)表達，而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BRI1 基因(serine/threonine-protein kinase BRI1 gene，BRI1)下調(diào)表達；乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)乙烯受體蛋白基因(ethylene receptor gene，ETR)、受體互作蛋白持續(xù)三重反應基因1(constitutive triple response gene1，CTR1)、乙烯不敏感基因3(ethylene insensitive gene 3，EIN3)、乙烯不敏感基因3 F-box 結(jié)合蛋白基因(EIN3-binding F-box protein gene，EBF)與乙烯受體轉(zhuǎn)錄因子1 基因(ethylene-responsive transcription factor 1，ERF1)均呈上調(diào)表達趨勢；生長素信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)生長素蛋白基因(auxin protein gene，AUX)、吲哚乙酸蛋白基因(indoleacetic acids protein gene，IAA)與轉(zhuǎn)運抑制響應蛋白基因1(transport inhibitor response protein gene 1，TIR1)均下調(diào)表達；細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵基因細胞分裂素結(jié)合受體組氨酸激酶基因(arabidopsis histidine kinase gene 2/3/4，AHK2/3/4)與磷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因(arabidopsis histidinephosphotransfer protein gene，AHP)均下調(diào)表達；赤霉素抑制基因DELLA下調(diào)表達；水楊酸代謝途徑關(guān)鍵基因TGA轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor TGA)和病程相關(guān)蛋白基因1(pathogenesis-related protein gene 1，PR-1)也呈下調(diào)表達趨勢?？梢?，生長素、細胞分裂素、ABA、乙烯、油菜素內(nèi)酯、JA、水楊酸等植物激素均參與了百香果低溫脅迫響應過程。值得注意的是，茉莉酸途徑相關(guān)的JAR1 與JAZ均上調(diào)表達而COI1 下調(diào)表達，而與ABA 途徑的連接橋梁PYL基因上調(diào)表達，而MYC2 家族不同成員同時存在上調(diào)和下調(diào)表達的現(xiàn)象，說明該代謝途徑在百香果低溫脅迫響應過程中存在重要的調(diào)控功能。

表6 植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑中差異基因統(tǒng)計表Table 6 Statistics of DEGs in plant hormone signal transduction pathway

2.6 JA 代謝相關(guān)基因挖掘

低溫脅迫下，百香果茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑及相關(guān)基因的變化如圖5，其中JAR1 和JAZ為上調(diào)表達基因，COI1 為下調(diào)表達基因，MYC2 基因同時存在上調(diào)和下調(diào)表達。此外，AOC、AOS與PYL也是植物茉莉酸代謝過程中的關(guān)鍵節(jié)點基因。這些基因在不同處理組中的FPKM(fragments per kilobase million)值的變化趨勢及qRT-PCR 驗證結(jié)果如表7所示，F(xiàn)PKM 值與qRTPCR 驗證結(jié)果的變化趨勢基本一致但變化的幅度略有差異。與CK 相比，LT 中c27852.graph＿c0(AOC)、c48197.graph＿c0(JAR1)、c52002.graph＿c0(JAZ)、c52048.graph＿c0(JAZ)、c49063.graph＿c0(MYC2)、c54914.graph＿c0(MYC2)與c36787.graph＿c1(PYL)均顯著上調(diào)表達，而c55075.graph＿c0(COI1)顯著下調(diào)。然而，與CK 相比，LT 中c54609.graph＿c0(AOS)、c42174.graph＿c0(JAZ)、c36235.graph＿c0(MYC2)及c54944.graph＿c0(PYL)的FPKM 值無顯著差異，但qRT-PCR 相對表達量明顯上調(diào)，分別達到CK 的3.35、2.49、1.62 及2.68 倍?？梢?，低溫處理能夠促進百香果茉莉酸生物合成相關(guān)的AOC與AOS轉(zhuǎn)錄，且受JA 直接正調(diào)控的JAR1、調(diào)控抗寒相關(guān)功能基因表達的MYC2 以及茉莉酸途徑與ABA 途徑關(guān)聯(lián)基因PYL的表達水平也顯著提高，與JA 在模式植物低溫脅迫下的響應機制基本一致。然而，低溫處理后，百香果中COI1 表達水平下降進而負調(diào)控JAZ表達水平上升，這一結(jié)果有待進一步研究。

表7 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因FPKM 值與qRT-PCR 相對表達Table 7 The FPKM value and relative expression by qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

3 討論

高通量轉(zhuǎn)錄組測序是植物差異表達基因挖掘、代謝調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建和生物學機理研究的重要手段。本研究中，百香果轉(zhuǎn)錄組各樣品的Q20 的堿基百分比均大于98%，且Q30 的堿基百分比均大于94%[39]，GC 含量介于45%～46%之間[5，40]，Unigene 的N50 值大于長度平均值，此外qRT-PCR 驗證的基因表達趨勢基本與轉(zhuǎn)錄組FPKM 值預測基本一致。因此，所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果較好，能夠滿足后續(xù)分析要求。

由百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組GO 分類的結(jié)果可知，生物過程大類中的代謝過程是DEGs 數(shù)量最多的類型，其注釋的DEGs 涉及甾醇生物合成、類黃酮葡萄苷酸化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長鏈脂肪-?；o酶A 代謝等生物過程。這些代謝途徑或信號轉(zhuǎn)導過程在其他植物中的生物調(diào)控功能也已有相關(guān)報道。其中，甾醇生物合成過程與長鏈脂肪-?；o酶A 代謝過程與植物細胞的質(zhì)膜穩(wěn)定性有關(guān)[41-42]，類黃酮葡萄苷酸化能夠促進植物體內(nèi)類黃酮葡萄苷酸化進而提高其解毒能力[43]，酪氨酸代謝與L-苯丙氨酸生物合成可能促進植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的合成[44]，芥子油苷代謝能夠調(diào)控芥子油苷合成與分解且與茉莉酸途徑相關(guān)[45]，而軟木脂生物合成會促進細胞壁成分之一的軟木脂合成[46]。此外，GO 分類的信號亞類注釋的DEGs 中包括3 個谷氨酸受體基因，即GLR3.7、GLR3.2 和GLR2.7，與前人的研究報道一致[47]，而這3 個GLR基因家族成員編碼冷受體的功能上的區(qū)別與聯(lián)系還需進一步研究。

基于KEGG 富集分析結(jié)果，低溫處理后百香果通過核糖體、淀粉與糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導及植物與病原菌互作等多個途徑綜合作用提高自身對低溫的抵抗能力。其中，作為調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆境脅迫重要的過程，植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑同樣在百香果低溫脅迫過程中存在顯著變化。低溫處理后，百香果中抗性相關(guān)的JA、ABA 與赤霉素等激素信號轉(zhuǎn)導途徑均被激活[9，11，48-49]，而與植物生長相關(guān)的生長素與細胞分裂素等代謝途徑總體上被抑制導致百香果體內(nèi)生長素與細胞分裂素含量下降，進而影響JA 與ABA 等代謝途徑[50-51]。

低溫脅迫后，百香果茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑中，AOC[21]與AOS[20，52]通過提高自身表達量從而促進茉莉酸類物質(zhì)的生物合成，經(jīng)過JAR1[25]等基因的信號傳遞從而提高MYC2[53]的表達，進而提高相關(guān)抗寒功能基因的表達。同時，以PYL作為橋梁，茉莉酸信號亦被傳遞到ABA 途徑，共同提高百香果的抗低溫能力[34，54]。此外，本試驗中，JAR1 對COI1 的調(diào)控可能隨著低溫處理的進程或因COI1 不同成員之間的區(qū)別而變化，同樣，JAZ不同成員對MYC2 的調(diào)控也存在類似現(xiàn)象，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因則有待進一步驗證和研究[32-33]。

4 結(jié)論

本試驗所獲得的百香果測序結(jié)果較為可靠準確，其中核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑及植物與病原體互作途徑是百香果響應低溫脅迫的重要代謝途徑。此外，茉莉酸代謝途徑的關(guān)鍵基因AOC、AOS、JAR1 與PYL對低溫脅迫的響應機制與模式植物基本一致，但COI1 和MYC2 等基因的調(diào)控方式較為特殊。本研究結(jié)果為揭示百香果抗寒機制提供了科學參考。