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        百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組及茉莉酸代謝基因分析

        2021-04-15 02:36:58韋曉霞王小安賴瑞聯(lián)吳如健
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2021年4期
        關(guān)鍵詞:百香果信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)茉莉

        韋曉霞 王小安 陳 瑾 賴瑞聯(lián) 吳如健

        (福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所,福建福州 350013)

        百香果(Passiflora eduliaSims)也稱雞蛋果、紫果西番蓮、黃果西番蓮,廣泛種植于我國(guó)熱帶與亞熱帶地區(qū),其果實(shí)多汁、香氣濃郁,且富含類黃酮、生物堿等生物活性成分,是一種廣受歡迎的水果[1]。此外,百香果花大而獨(dú)特,多樣性豐富,具備較好的觀賞價(jià)值。因此,百香果是一種兼具食用、藥用與觀賞價(jià)值的藤本果類,具有較高的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。百香果種植于高緯度或高海拔地區(qū)易遭受低溫凍害,即使在現(xiàn)有主產(chǎn)區(qū),也常受到異常極端低溫天氣的危害。低溫凍害已成為百香果產(chǎn)業(yè)面臨的重要限制因子,影響其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和輻射推廣。然而,目前百香果的研究主要集中在引種、栽培、果實(shí)品質(zhì)以及采后加工等方面[1-3],在抗寒和低溫脅迫方面的研究較少[4-6]。在已有報(bào)道中,陳穎等[7]研究了百香果在低溫脅迫下生理生化及顯微結(jié)構(gòu)變化,認(rèn)為低溫預(yù)冷是提高其抗凍性的有效措施之一;董萬(wàn)鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi)隨著處理溫度的下降,百香果枝條中相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖及脯氨酸含量呈上升的趨勢(shì),抗寒性較好的葉片柵/海比例較高、組織結(jié)構(gòu)較為緊密以及具有更大的葉脈突起且葉脈厚而葉片薄的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。然而,關(guān)于百香果低溫脅迫響應(yīng)或抗寒機(jī)理方面的研究較少,一定程度上影響了生物技術(shù)手段在百香果育種和產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。

        低溫寒害是熱帶亞熱帶作物產(chǎn)業(yè)中普遍存在的自然限制因子。研究表明,植物受到冷脅迫后,能夠誘導(dǎo)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),啟動(dòng)或抑制相關(guān)基因的表達(dá),從而改變細(xì)胞膜特性、調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉以及調(diào)控脯氨酸等物質(zhì)的合成與降解等,進(jìn)而提高植物的抗寒能力[8-10]。水稻細(xì)胞膜上的低溫感受器能夠在感知低溫刺激后觸發(fā)鈣信號(hào)產(chǎn)生,進(jìn)而對(duì)鈣/鈣調(diào)素調(diào)控類受體激酶(calcium/calmodulin-regulated receptor-like kinase,CRLKs)、鈣依賴性蛋白激酶(Ca2+-dependent protein kinases,CPKs)、鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白(calcineurin Blike protein,CBLs)、鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白激酶(CBLinteracting protein kinase,CIPKs)的表達(dá)水平產(chǎn)生影響,然后通過(guò)ICE1(inducer of CBF expression1) 或CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)等轉(zhuǎn)錄因子影響相關(guān)基因表達(dá)[11];植物中SnRK2s(sucrose non-fermenting-related protein kinase 2s)在收到低溫信號(hào)后可通過(guò)直接調(diào)控ICE1 或間接調(diào)控HOS1(high expression of osmotically responsive genes 1)轉(zhuǎn)錄[12],ICE1 再通過(guò)CBFs(C-repeat-binding factors)調(diào)控下游COR(cold-regulated gene)的表達(dá)水平,從而響應(yīng)低溫脅迫[13]。此外,MYBs(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog transcription factors)、WRKYs(WRKYtype transcription factors) 及ZATs(zinc finger protein transcription factors)等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗寒或低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[14]。

        茉莉酸(jasmonic acid,JA)是植物體內(nèi)非常重要的一類激素。在香蕉(Musa nanaLour.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、菠菜(Spinacia oleraceaL.)[17]及甜瓜(Cucumis meloL.)[18]等植物上的研究表明,茉莉酸類物質(zhì)可以提高植物對(duì)冷脅迫的抗性,且能夠與脫落酸(abscisic acid,ABA)代謝途徑相互影響[19]。植物茉莉酸代謝過(guò)程較為明確,其中丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS)與丙二烯氧化物環(huán)化酶(allene oxide cyclase,AOC)調(diào)控茉莉酸類物質(zhì)生物合成[20-24],茉莉酸氨基合酶(jasmonate resistant 1,JAR1)參與茉莉酸代謝的信號(hào)傳遞[25],茉莉酸信號(hào)受體蛋白(coronatine-insensitive protein 1,COI1)參與茉莉酸介導(dǎo)的防御響應(yīng)[26],JAZ 蛋白(jasmonate ZIM-domain)參與茉莉酸信號(hào)傳遞且與MYB、AOC 及MYC2 存在互作關(guān)系[27-32],MYC2 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor MYC2)是茉莉酸信號(hào)傳遞的核心轉(zhuǎn)錄因子,且可與COI1 及JAZ形成復(fù)合體作為茉莉酸信號(hào)的核心模塊[33],同時(shí)MYC2在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中可能通過(guò)ABA 受體類蛋白PYL (pyrabactin resistance like )/PYR (pyrabactin resistance)建立聯(lián)系[34]。目前,百香果低溫脅迫下JA代謝途徑在其中的響應(yīng)方式鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究以紫果百香果為材料,開(kāi)展百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組研究,并從中挖掘JA 代謝途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因,以期為進(jìn)一步研究百香果抗寒機(jī)制提供科學(xué)參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        選用同一株生長(zhǎng)正常的百香果植株剪取枝條進(jìn)行扦插,同一水平下進(jìn)行管理,選擇生長(zhǎng)相對(duì)一致、苗高約為60 cm 的扦插苗為試驗(yàn)材料,分別進(jìn)行低溫脅迫處理(LT,0℃處理24 h)和常溫處理(CK,25℃處理24 h)。每個(gè)處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。處理后采集頂端向下第3 和第4 片葉片液氮速凍,置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(離心柱型),北京全式金生物技術(shù)有限公司;mRNA 富集用的磁珠mRNA Capture BeadsRNA,南京諾唯贊生物科技有限公司;文庫(kù)構(gòu)建試劑盒NEBNext? UltraTMRNA Library Prep Kit,美國(guó)New England Biolabs 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel),北京全式金生物技術(shù)有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 試劑盒TransStart? Top Green qPCR SuperMix,北京全式金生物技術(shù)有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Eppendorf 高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf 公司;2720 PCR 儀,美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;Vortex-Genie 2 漩渦震蕩器,北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;BE-1100 四維旋轉(zhuǎn)儀,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Illumina HiSeq X-Ten 高通量測(cè)序儀,美國(guó)Illumina 公司;Eppendorf Realplex4熒光定量PCR 儀,德國(guó)Eppendorf 公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和數(shù)據(jù)組裝 提取樣品總RNA,去除核糖體RNA 后分離純化mRNA 樣品檢測(cè)合格后,基于Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序平臺(tái),構(gòu)建百香果轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。使用Illumina Hiseq 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),截除Reads 中的測(cè)序接頭以及引物序列并過(guò)濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù),最終獲得高質(zhì)量Reads。

        1.3.2 基因表豐度檢測(cè)與差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)篩選 采用Bowtie 將測(cè)序得到的Reads 與Unigene 庫(kù)進(jìn)行比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果,結(jié)合RSEM 進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM(fragments per kilobase per million reads)值表示對(duì)應(yīng)Unigene 的表達(dá)豐度。隨后,采用DESeq2 進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析,采用Benjamini-Hochberg 方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值進(jìn)行校正,并最終采用校正后的P值,即FDR(false discovery rate)作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。在篩選過(guò)程中,將FDR 小于0.01且差異倍數(shù)FC(fold change)大于等于2 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中,F(xiàn)C 表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值。

        1.3.3 DEGs 功能注釋與代謝途徑富集分析 使用BLAST 軟件將Unigene 序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),使用KOBAS 得到Unigene 在KEGG 中的KEGG Orthology結(jié)果[35],預(yù)測(cè)完Unigene 的氨基酸序列之后使用HMMER 軟件與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得Unigene 的注釋信息[36]。此外,對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分類[37]。

        1.3.4 JA 代謝途徑相關(guān)基因篩選與驗(yàn)證 通過(guò)分析DEGs 的功能注釋,篩選百香果茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)獲得逆轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)篩選出的基因的Unigene 序列設(shè)計(jì)并合成引物進(jìn)行qRTPCR。檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率后,根據(jù)qRTPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)液,20 μL 反應(yīng)體系中包含反應(yīng)液10 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL、熒光染料Ⅰ(50×) 0.4 μL、cDNA 模板2.0 μL、ddH2O 6.8 μL。引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性10 s,退火15 s,72℃延伸10 s,循環(huán)40 次;之后溫度回升至94℃保持15 s,隨后降至60℃保持15 s,再以0.11℃·s-1的速度升溫至94℃保持15 s,繪制溶解曲線。所采集的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[38]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

        表1 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

        2 結(jié)果與分析

        2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝與分析

        由表2可知,CK 的堿基數(shù)量介于6.83 G~7.36 G之間,LT 的堿基數(shù)量介于6.59 G~7.35 G 之間。各樣品的Q20 堿基百分比均大于98%,Q30 堿基百分比均大于94%,說(shuō)明所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。在堿基成分方面,GC 介于45%~46%之間。組裝共得到39 521條Unigene,N50 值為1 991(5.04%),平均長(zhǎng)度為1 145.47 bp,其中長(zhǎng)度介于300~500 bp 的Unigene 數(shù)量為16 019,占比最大,達(dá)40.53%(表3)。由圖1所示的6 個(gè)樣品主成分分析(principal component analysis,PCA)結(jié)果可知,CK 與LT 分別聚為一類,即生物學(xué)重復(fù)樣品間重復(fù)性好。由此可見(jiàn),百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組的組裝結(jié)果的完整性較高,可用于后續(xù)分析。

        表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表Table 2 Data evaluation statistics of transcriptome

        表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistics of transcriptome assembly results

        2.2 Unigene 注釋

        低溫脅迫下,百香果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的Unigene注釋結(jié)果如圖2所示。最終獲得28 889 個(gè)有注釋信息的Unigene,占所有Unigene 的73.10%。其中長(zhǎng)度大于等于300 bp 且小于1 000 bp 的Unigene 數(shù)量為15 756(54.54%),大于等于1 000 bp 的數(shù)量為13 133(45.46%)。在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中,COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量最少,為9 585,占比僅為33.18%;GO 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為17 530,占比60.68%;KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為11 811,占比40.88%;KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為16 528,占比57.21%;Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為19 865,占比68.76%;Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene 數(shù)量為20 728,占比71.75%;eggNOG 4.5 數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene 數(shù)量為27 410,占比94.89%;注釋NR 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Unigene數(shù)量最多,為28 755,占比高達(dá)99.54%。

        2.3 差異表達(dá)基因鑒定

        基于DEGs 分析結(jié)果,不同處理和生物重復(fù)間百香果轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性分析結(jié)果如圖3-A 所示,CK 的3 個(gè)生物重復(fù)樣品與LT 的3 個(gè)生物重復(fù)樣品均分別聚為一類,不同處理間轉(zhuǎn)錄組的相似系數(shù)介于0.573~0.761,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組差異基因篩選結(jié)果較為可靠。進(jìn)一步篩選,低溫脅迫處理后獲得百香果5 311 個(gè)DEGs(圖3-B),其中LT 相對(duì)于CK 上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為2 533(47.69%),下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為2 778(52.31%)。

        2.4 差異表達(dá)基因GO 分類

        被GO 注釋的17 530 個(gè)Unigene 中DEGs 為2 601個(gè)(14.84%)。轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因GO 分類結(jié)果如圖4所示,被注釋的Unigene 分為細(xì)胞組件、分子功能及生物過(guò)程三大類。其中,細(xì)胞組分大類可進(jìn)一步分為16 個(gè)小類;分子功能大類分為15 個(gè)小類;生物過(guò)程大類分為21 個(gè)小類。

        根據(jù)GO 分類結(jié)果,DEGs 數(shù)量最多的亞類為生物過(guò)程大類的代謝過(guò)程,數(shù)量為1 414,占該類型Unigene總數(shù)15.08%,包括甾醇生物合成、類黃酮糖脂化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長(zhǎng)鏈脂肪-?;o酶A 代謝等。DEGs占該類型Unigene 總數(shù)比例最大的小類為分子功能大類中的金屬伴侶蛋白活性亞類,僅包含2 個(gè)Unigene,其中一個(gè)為差異基因即細(xì)胞色素C 氧化酶基因,另一個(gè)是銅/鋅超氧化物歧化酶基因。此外,生物過(guò)程大類中信號(hào)小類注釋的差異基因數(shù)量為118,占該類型Unigene 比例為14.82%,包括3 個(gè)親離子谷氨酸受體信號(hào)通路的谷氨酸受體基因,即c50649.graph_c0(GLR3.7)、c53352.graph_c0(GLR3.2)和c54428.graph_c0(GLR2.7)。

        2.5 KEGG 富集分析

        KEGG 富集結(jié)果中,DEGs 數(shù)量排名前十和具有顯著性差異的KEGG 代謝途徑如表4和表5所示。從所獲得的DEGs 數(shù)量上看,百香果低溫脅迫下富集的主要代謝通路包括核糖體、淀粉與蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳代謝、氨基酸生物合成、植物與病原體互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、苯丙素生物合成、嘌呤代謝和內(nèi)吞作用等10 種。以P值作為參考,KEGG 富集的顯著性代謝通路有核糖體、淀粉與蔗糖代謝、氰胺酸代謝、植物與病原體互作、DNA 復(fù)制、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、核糖體在真核生物中的生物發(fā)生、卟啉和葉綠素代謝、單萜類生物合成、牛磺酸和次?;撬岽x。其中,核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及植物與病原體互作途徑中DEGs 數(shù)量較多,且差異存在顯著性,可能是參與百香果低溫脅迫響應(yīng)的重要代謝途徑。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在多種植物抗寒或低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中均發(fā)揮了重要生物學(xué)功能。為進(jìn)一步研究百香果激素信號(hào)途徑響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)制,本試驗(yàn)對(duì)低溫脅迫下該途徑的DEGs 進(jìn)行了分析。

        表4 差異基因數(shù)量前十的KEGG 代謝途徑Table 4 Top 10 KEGG pathways of DEGs number

        表5 顯著性差異的KEGG 代謝途徑Table 5 Significant difference KEGG pathways

        百香果低溫脅迫過(guò)程中,激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的DEGs 如表6所示,其中,上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?2 個(gè),下調(diào)表達(dá)29 個(gè),總體上看激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝被激活了。這些差異表達(dá)基因中,生長(zhǎng)素、JA、ABA 等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因,例如MYC2、生長(zhǎng)素相應(yīng)因子基因(auxin response factor,ARF)、吲哚乙酸氨基化合成酶基因(indole-3-acetic acid-amido synthetase gene,GH3)、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因(auxin-responsive protein gene,SAUR)、蛋白磷酸酶2C 基因(protein phosphatase 2C gene,PP2C)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SRK2 基因(serine/threonine-protein kinase SRK2 gene,SRK2)等同時(shí)存在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)類型,說(shuō)明這些基因的不同成員可能在低溫脅迫過(guò)程中存在功能多樣性;油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BSK基因(serine/threonine-protein kinase BSK gene,BSK)與植物轉(zhuǎn)錄因子基因(plant transcription factor BZR,BZR)上調(diào)表達(dá),而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BRI1 基因(serine/threonine-protein kinase BRI1 gene,BRI1)下調(diào)表達(dá);乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)乙烯受體蛋白基因(ethylene receptor gene,ETR)、受體互作蛋白持續(xù)三重反應(yīng)基因1(constitutive triple response gene1,CTR1)、乙烯不敏感基因3(ethylene insensitive gene 3,EIN3)、乙烯不敏感基因3 F-box 結(jié)合蛋白基因(EIN3-binding F-box protein gene,EBF)與乙烯受體轉(zhuǎn)錄因子1 基因(ethylene-responsive transcription factor 1,ERF1)均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì);生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)生長(zhǎng)素蛋白基因(auxin protein gene,AUX)、吲哚乙酸蛋白基因(indoleacetic acids protein gene,IAA)與轉(zhuǎn)運(yùn)抑制響應(yīng)蛋白基因1(transport inhibitor response protein gene 1,TIR1)均下調(diào)表達(dá);細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因細(xì)胞分裂素結(jié)合受體組氨酸激酶基因(arabidopsis histidine kinase gene 2/3/4,AHK2/3/4)與磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(arabidopsis histidinephosphotransfer protein gene,AHP)均下調(diào)表達(dá);赤霉素抑制基因DELLA下調(diào)表達(dá);水楊酸代謝途徑關(guān)鍵基因TGA轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor TGA)和病程相關(guān)蛋白基因1(pathogenesis-related protein gene 1,PR-1)也呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)??梢?jiàn),生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、ABA、乙烯、油菜素內(nèi)酯、JA、水楊酸等植物激素均參與了百香果低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程。值得注意的是,茉莉酸途徑相關(guān)的JAR1 與JAZ均上調(diào)表達(dá)而COI1 下調(diào)表達(dá),而與ABA 途徑的連接橋梁PYL基因上調(diào)表達(dá),而MYC2 家族不同成員同時(shí)存在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象,說(shuō)明該代謝途徑在百香果低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中存在重要的調(diào)控功能。

        表6 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中差異基因統(tǒng)計(jì)表Table 6 Statistics of DEGs in plant hormone signal transduction pathway

        2.6 JA 代謝相關(guān)基因挖掘

        低溫脅迫下,百香果茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及相關(guān)基因的變化如圖5,其中JAR1 和JAZ為上調(diào)表達(dá)基因,COI1 為下調(diào)表達(dá)基因,MYC2 基因同時(shí)存在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。此外,AOC、AOS與PYL也是植物茉莉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。這些基因在不同處理組中的FPKM(fragments per kilobase million)值的變化趨勢(shì)及qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果如表7所示,F(xiàn)PKM 值與qRTPCR 驗(yàn)證結(jié)果的變化趨勢(shì)基本一致但變化的幅度略有差異。與CK 相比,LT 中c27852.graph_c0(AOC)、c48197.graph_c0(JAR1)、c52002.graph_c0(JAZ)、c52048.graph_c0(JAZ)、c49063.graph_c0(MYC2)、c54914.graph_c0(MYC2)與c36787.graph_c1(PYL)均顯著上調(diào)表達(dá),而c55075.graph_c0(COI1)顯著下調(diào)。然而,與CK 相比,LT 中c54609.graph_c0(AOS)、c42174.graph_c0(JAZ)、c36235.graph_c0(MYC2)及c54944.graph_c0(PYL)的FPKM 值無(wú)顯著差異,但qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào),分別達(dá)到CK 的3.35、2.49、1.62 及2.68 倍??梢?jiàn),低溫處理能夠促進(jìn)百香果茉莉酸生物合成相關(guān)的AOC與AOS轉(zhuǎn)錄,且受JA 直接正調(diào)控的JAR1、調(diào)控抗寒相關(guān)功能基因表達(dá)的MYC2 以及茉莉酸途徑與ABA 途徑關(guān)聯(lián)基因PYL的表達(dá)水平也顯著提高,與JA 在模式植物低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制基本一致。然而,低溫處理后,百香果中COI1 表達(dá)水平下降進(jìn)而負(fù)調(diào)控JAZ表達(dá)水平上升,這一結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

        表7 百香果低溫脅迫下茉莉酸代謝途徑相關(guān)基因FPKM 值與qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)Table 7 The FPKM value and relative expression by qRT-PCR of genes related to JA metabolism pathway of P.edulia under low temperature stress

        3 討論

        高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是植物差異表達(dá)基因挖掘、代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物學(xué)機(jī)理研究的重要手段。本研究中,百香果轉(zhuǎn)錄組各樣品的Q20 的堿基百分比均大于98%,且Q30 的堿基百分比均大于94%[39],GC 含量介于45%~46%之間[5,40],Unigene 的N50 值大于長(zhǎng)度平均值,此外qRT-PCR 驗(yàn)證的基因表達(dá)趨勢(shì)基本與轉(zhuǎn)錄組FPKM 值預(yù)測(cè)基本一致。因此,所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果較好,能夠滿足后續(xù)分析要求。

        由百香果低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組GO 分類的結(jié)果可知,生物過(guò)程大類中的代謝過(guò)程是DEGs 數(shù)量最多的類型,其注釋的DEGs 涉及甾醇生物合成、類黃酮葡萄苷酸化、酪氨酸代謝、L-苯丙氨酸生物合成、軟木脂生物合成、芥子油苷代謝及長(zhǎng)鏈脂肪-?;o酶A 代謝等生物過(guò)程。這些代謝途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程在其他植物中的生物調(diào)控功能也已有相關(guān)報(bào)道。其中,甾醇生物合成過(guò)程與長(zhǎng)鏈脂肪-?;o酶A 代謝過(guò)程與植物細(xì)胞的質(zhì)膜穩(wěn)定性有關(guān)[41-42],類黃酮葡萄苷酸化能夠促進(jìn)植物體內(nèi)類黃酮葡萄苷酸化進(jìn)而提高其解毒能力[43],酪氨酸代謝與L-苯丙氨酸生物合成可能促進(jìn)植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的合成[44],芥子油苷代謝能夠調(diào)控芥子油苷合成與分解且與茉莉酸途徑相關(guān)[45],而軟木脂生物合成會(huì)促進(jìn)細(xì)胞壁成分之一的軟木脂合成[46]。此外,GO 分類的信號(hào)亞類注釋的DEGs 中包括3 個(gè)谷氨酸受體基因,即GLR3.7、GLR3.2 和GLR2.7,與前人的研究報(bào)道一致[47],而這3 個(gè)GLR基因家族成員編碼冷受體的功能上的區(qū)別與聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。

        基于KEGG 富集分析結(jié)果,低溫處理后百香果通過(guò)核糖體、淀粉與糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物與病原菌互作等多個(gè)途徑綜合作用提高自身對(duì)低溫的抵抗能力。其中,作為調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境脅迫重要的過(guò)程,植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同樣在百香果低溫脅迫過(guò)程中存在顯著變化。低溫處理后,百香果中抗性相關(guān)的JA、ABA 與赤霉素等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均被激活[9,11,48-49],而與植物生長(zhǎng)相關(guān)的生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素等代謝途徑總體上被抑制導(dǎo)致百香果體內(nèi)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素含量下降,進(jìn)而影響JA 與ABA 等代謝途徑[50-51]。

        低溫脅迫后,百香果茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,AOC[21]與AOS[20,52]通過(guò)提高自身表達(dá)量從而促進(jìn)茉莉酸類物質(zhì)的生物合成,經(jīng)過(guò)JAR1[25]等基因的信號(hào)傳遞從而提高M(jìn)YC2[53]的表達(dá),進(jìn)而提高相關(guān)抗寒功能基因的表達(dá)。同時(shí),以PYL作為橋梁,茉莉酸信號(hào)亦被傳遞到ABA 途徑,共同提高百香果的抗低溫能力[34,54]。此外,本試驗(yàn)中,JAR1 對(duì)COI1 的調(diào)控可能隨著低溫處理的進(jìn)程或因COI1 不同成員之間的區(qū)別而變化,同樣,JAZ不同成員對(duì)MYC2 的調(diào)控也存在類似現(xiàn)象,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因則有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究[32-33]。

        4 結(jié)論

        本試驗(yàn)所獲得的百香果測(cè)序結(jié)果較為可靠準(zhǔn)確,其中核糖體途徑、淀粉與蔗糖代謝途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及植物與病原體互作途徑是百香果響應(yīng)低溫脅迫的重要代謝途徑。此外,茉莉酸代謝途徑的關(guān)鍵基因AOC、AOS、JAR1 與PYL對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制與模式植物基本一致,但COI1 和MYC2 等基因的調(diào)控方式較為特殊。本研究結(jié)果為揭示百香果抗寒機(jī)制提供了科學(xué)參考。

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