閔子揚(yáng) 韓小霞 李勇奇 胡新軍 汪端華 孫小武

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

中國(guó)南瓜(Cucurbita moschataD.)是南瓜屬4 個(gè)栽培種之一，是葫蘆科(Cucurbitaceae)重要的蔬菜作物，具有廣泛的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。我國(guó)關(guān)于南瓜的研究以品種選育為主，基礎(chǔ)研究較弱，許多農(nóng)藝性狀的遺傳規(guī)律還不明晰，嚴(yán)重制約常規(guī)育種發(fā)展[2]?；蚪M學(xué)的迅速發(fā)展可打破常規(guī)育種局限，對(duì)目標(biāo)性狀基因的發(fā)掘和功能研究已成為基因組學(xué)研究的重點(diǎn)[3-4]。正向和反向遺傳學(xué)方法對(duì)基因組進(jìn)行分析是功能基因組學(xué)研究的兩種有效途徑[5]，而基因變異是基因組分析研究的基礎(chǔ)。構(gòu)建突變體庫(kù)作為獲得基因變異的重要途徑，逐漸受到重視。

構(gòu)建突變體庫(kù)的方法主要包括物理、化學(xué)和生物誘變，其中理化誘變能夠高效迅速地獲得更多有價(jià)值的突變材料[6]。甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)是目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)誘變劑之一，它可直接誘發(fā)點(diǎn)突變，具有操作簡(jiǎn)便、高效、突變范圍廣、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是目前構(gòu)建突變體庫(kù)的首選方法[7]。利用EMS 誘變技術(shù)已在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)[8]、水稻(Oryza sativaL.)[9]中構(gòu)建了飽和突變體庫(kù)，并進(jìn)行了相關(guān)基因的功能分析，明確了花期[10]、抗逆性[11-12]及矮化[13]等基因的功能，同時(shí)獲得了一批有價(jià)值的種質(zhì)資源。在蔬菜作物方面，目前已在黃瓜(Cucumis sativusL.)[14]、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)matsum et Nakai][15]、甜瓜(Cucumis meloL.)[16]、辣椒(Capsicum annuumL.)[17]、大白菜[Brassica pekinensis(lour).Rupr.][18]等作物上構(gòu)建了EMS 突變體庫(kù)，為相關(guān)作物的基礎(chǔ)研究和新品種選育做出了重大貢獻(xiàn)。

2017年南瓜全基因組測(cè)序順利完成[19]，使南瓜遺傳育種的相關(guān)研究步入后基因組時(shí)代，構(gòu)建南瓜突變體，深入系統(tǒng)研究南瓜相關(guān)功能基因勢(shì)在必行。然而，目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)南瓜突變體庫(kù)構(gòu)建及相關(guān)研究的報(bào)道。本研究利用EMS 對(duì)中國(guó)南瓜高代自交系N87種子進(jìn)行誘變處理以構(gòu)建突變體庫(kù)，對(duì)突變?nèi)后w的表型變異情況進(jìn)行篩選與分析，獲得了與株型、花色、葉片、節(jié)間長(zhǎng)、強(qiáng)雄等性狀相關(guān)的突變材料，并進(jìn)一步明確花色和短蔓突變?yōu)閱位螂[性突變，以期，為中國(guó)南瓜功能基因組研究和新品種選育奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

以中國(guó)南瓜高代自交系N87 種子為材料，由湖南省蔬菜研究所南瓜研究室提供。EMS 誘變劑購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，為無(wú)色溶液，用0.1 mol·L-1pH 值7.0的磷酸緩沖液稀釋成不同濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EMS 最佳誘變條件的篩選 將N87 種子在28℃溫水中浸種4 h，28℃催芽12 h，然后在通風(fēng)櫥中將其浸入50 mL 不同濃度(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%)的EMS 溶液中，以磷酸緩沖液(EMS 濃度為0)浸種為對(duì)照；期間，在28℃搖床上分別震蕩10、12、14 h，處理結(jié)束后，在通風(fēng)櫥中將EMS 廢液倒入廢液桶，處理完成的種子在流水下沖洗8 h 后，將種子平鋪于內(nèi)覆濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，并在28℃培養(yǎng)箱中催芽36 h，催芽結(jié)束后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)，然后將種子播種于穴盤(pán)，7 d 后統(tǒng)計(jì)各處理的成苗率及植株苗期生長(zhǎng)情況，綜合評(píng)估以確定中國(guó)南瓜種子EMS 誘變的最佳處理?xiàng)l件。以上每處理100 粒種子，重復(fù)3 次。

1.2.2 中國(guó)南瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建 2018年春季，將10 000 粒飽滿、大小均一的中國(guó)南瓜N87 的種子采用篩選的最佳誘變條件進(jìn)行誘變處理，將處理后發(fā)芽的種子播種至穴盤(pán)內(nèi)進(jìn)行育苗。4月中旬定植于湖南省蔬菜研究所高橋科研基地，共成活3 960 個(gè)單株，構(gòu)成中國(guó)南瓜突變體庫(kù)M1群體；正常田間管理，嚴(yán)格自交授粉，共收獲725 份單株自交瓜種子，每份種子記為1個(gè)M2株系。2018年秋季，從M2中隨機(jī)選取98 個(gè)株系在海南三亞南濱農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行種植，每株系定植16 株(不足16 株按實(shí)際株數(shù)種植)，共計(jì)1 432 個(gè)單株，構(gòu)成中國(guó)南瓜突變體庫(kù)M2群體，正常田間管理。

參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(guó)南瓜DUS(特異性、一致性和穩(wěn)定性)測(cè)試指南[20]，以野生型中國(guó)南瓜N87 為對(duì)照，分別觀察M1、M2變異群體的形態(tài)特征，記錄變異群體的葉色、葉形、葉片大小、株形、花色、瓜形、性別等性狀。M2中發(fā)現(xiàn)的變異材料自交留種的同時(shí)與野生型雜交以構(gòu)建分離群體，對(duì)相關(guān)變異性狀進(jìn)行遺傳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)南瓜種子EMS 最佳誘變條件的篩選

由表1可知，EMS 濃度為0.8%時(shí)，種子的發(fā)芽率與對(duì)照相比有所提高，推測(cè)低濃度的EMS 能促進(jìn)中國(guó)南瓜種子的發(fā)芽。在EMS 濃度大于0.8%時(shí)，隨著誘變時(shí)間和EMS 濃度的增加，種子的發(fā)芽率和成苗率均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明EMS 誘變能夠?qū)е轮袊?guó)南瓜種子的死亡。在1.6% EMS 濃度下處理12 h 時(shí)，種子的發(fā)芽率為59%，芽勢(shì)較弱，成苗率為65%，幼苗生長(zhǎng)緩慢、真葉皺縮，綜合成苗率為38.40%(圖1-A、B、C、D)，在發(fā)芽率接近半致死的同時(shí)還可保證一定的成苗率；磷酸緩沖液處理12 h 后表現(xiàn)為發(fā)芽率93%，芽勢(shì)強(qiáng)，成苗率93%，苗期生長(zhǎng)旺盛、真葉平展(圖1-a、b、c、d)。綜上確定1.6% EMS 處理12 h 是中國(guó)南瓜種子最佳的誘變處理?xiàng)l件。

表1 不同濃度EMS 和處理時(shí)間對(duì)中國(guó)南瓜種子發(fā)芽率和成苗率的影響Table 1 Effects of concentration of EMS and treatment time on germination and survival rate of pumpkin seeds

2.2 中國(guó)南瓜突變體庫(kù)M1 群體的表型變異分析

2018年春季，將1.6% EMS 處理12 h 后發(fā)芽的種子播種至穴盤(pán)內(nèi)進(jìn)行育苗，最終田間成活3 960 個(gè)單株，構(gòu)成中國(guó)南瓜突變體庫(kù)M1群體。M1群體中出現(xiàn)了很多表型變異，但這些變異很多是化學(xué)藥害造成的，屬不可遺傳的變異，因此本研究對(duì)M1群體只進(jìn)行觀測(cè)而未進(jìn)行篩選。M1群體正常田間管理，嚴(yán)格自交授粉，由于EMS 處理后的很多植株表現(xiàn)出葉片黃化、白化、葉片皺縮、植株簇生、雌花畸形、花粉敗育、花期不遇等情況，自交授粉率低，M1群體只收獲725 個(gè)單株自交瓜種子，記為M2。

2.3 M2 群體田間性狀調(diào)查及部分突變性狀分析

2018年秋季在三亞南濱農(nóng)場(chǎng)種植M2的98 個(gè)家系，每個(gè)家系種植16 株，部分單株不足16 株，共計(jì)1 432 個(gè)單株，自交留種，同時(shí)把突變體與野生型進(jìn)行雜交。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，M2突變材料中總體表型突變頻率為11.20%，主要包括葉色、葉形、葉片大小、花色、花期、雌花節(jié)位、單性結(jié)實(shí)、株型、蔓長(zhǎng)、果形等變異(表2)。

2.3.1 M2群體真葉突變表型變異分析 野生型中國(guó)南瓜材料N87 的真葉近掌狀，邊緣缺裂中等，上覆白斑，葉色深綠(圖2-A)。M2群體中的真葉變異主要表現(xiàn)在葉形和葉色兩方面，其中葉形有葉片小而尖、葉色淡綠(圖2-B)；葉片近圓形(圖2-C)；葉緣細(xì)鋸齒狀且內(nèi)卷(圖2-D)；葉片小而皺縮、缺刻極深、葉色濃綠(圖2-E)等突變材料出現(xiàn)；葉色方面，出現(xiàn)了葉色淡綠(圖2-F)；全白色(圖2-G)；淺黃色上覆白斑(圖2-H)；深黃色(圖2-Ⅰ)；淺黃色與綠色不規(guī)則嵌合(圖2-J)；淺黃色與綠色規(guī)則嵌合(圖2-K)；生長(zhǎng)點(diǎn)黃化后逐漸又轉(zhuǎn)為綠色等突變材料(圖2-L)。葉片變異是在M2群體中突變頻率較高的一種類型，其突變頻率為4.55%，占總突變頻率的40.63%。

2.3.2 M2群體株型突變表型變異分析 野生型南瓜N87 屬中國(guó)南瓜類型，主蔓長(zhǎng)約3.5 m，葉片長(zhǎng)約28 cm、寬約26 cm，上被白斑、葉色深綠，主生長(zhǎng)點(diǎn)明顯，主蔓節(jié)間長(zhǎng)約23 cm(圖3-A)。M2群體中株型突變主要表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)瘦弱、葉片變小(圖3-B)；植株葉片生長(zhǎng)緊湊、葉柄與主蔓夾角變小(圖3-C)；植株葉片淺綠、主蔓無(wú)法正常伸長(zhǎng)(圖3-D)；葉片皺縮無(wú)法正常展開(kāi)、植株呈雞爪狀(圖3-E)；植株簇生無(wú)生長(zhǎng)點(diǎn)(圖3-F)；花打頂(圖3-G)；植株節(jié)間長(zhǎng)變短、呈半蔓生狀(圖3-H)。株型變異頻率僅次于葉片變異頻率，其突變頻率為2.31%，占總突變頻率的20.63%。

表2 中國(guó)南瓜突變體庫(kù)M2 群體表型變異情況Table 2 Statistic of mutant type of M2 generation in pumpkin mutation library

2.3.3 M2群體生殖器官突變表型變異分析 野生型南瓜花冠顏色為橙黃色(圖4-A)，雄花柱頭細(xì)長(zhǎng)、上被花粉，雌花花冠能夠正常打開(kāi)、子房大小正常。M2生殖器官變異主要表現(xiàn)為花冠顏色變淺、呈白色(圖4-B)；雄花柱頭短縮、無(wú)花粉(圖4-C)；雌花花冠不能正常打開(kāi)、子房變態(tài)膨大、可單性結(jié)實(shí)等現(xiàn)象(圖4-D)。生殖器官變異在M2群體中突變頻率為2.10%，占總突變頻率的18.80%。

2.3.4 M2群體果實(shí)突變表型變異分析 野生型中國(guó)南瓜N87 為高代自交系，其果實(shí)長(zhǎng)紡錘形、果長(zhǎng)約24 cm、寬約20 cm、無(wú)明顯果柄、淺棱、成熟果深黃色、上覆蠟粉、一致性好(圖5-A)。M2群體中出現(xiàn)了很多果型變異的情況，主要表現(xiàn)為果長(zhǎng)變短呈扁圓形(圖5-B)；高圓形(圖5-C)；正圓形(圖5-D)；果長(zhǎng)與野生型基本一致、但果實(shí)變粗呈近高圓形(圖5-E)；果柄和底部收窄變尖(圖5-F)；果長(zhǎng)變長(zhǎng)呈長(zhǎng)圓筒形(圖5-G)；有瓜把和種腔膨大(圖5-H)。果型變異在M2群體中突變頻率為2.24%，占總突變頻率的20%。

2.4 花色與短蔓突變性狀的觀測(cè)與遺傳分析

M2群體中很多具有突變性狀的植株，無(wú)法收獲自交種子，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行突變性狀的M3驗(yàn)證。目前已通過(guò)M3和F2分離群體驗(yàn)證，明確為穩(wěn)定可遺傳變異的有白花突變(圖6-B)和短蔓突變(圖6-D)，卡方測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明(表3)，這2 個(gè)性狀F2的分離比均符合3∶1，為單基因隱性突變。

表3 2 個(gè)突變性狀的卡方值計(jì)算表Table 3 Two mutants χ2 worksheet

3 討論

3.1 誘變條件與建立高效突變體庫(kù)

EMS 誘變技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物突變體庫(kù)的構(gòu)建，目前已在水稻[20]、大豆[21]、玉米[22]、番茄[23]、甘藍(lán)[24]、黃瓜[25]等作物上成功構(gòu)建突變體庫(kù)，并在功能基因組學(xué)研究上發(fā)揮了巨大作用。作物EMS 誘變過(guò)程中，尋找半致死劑量(LD50)是關(guān)鍵的步驟[26]，對(duì)突變體庫(kù)的高效構(gòu)建至關(guān)重要，但由于作物種類、品種甚至是誘變部位的不同，EMS 誘變的最佳處理濃度和時(shí)間差別較大。黃萍等[27]以馬鈴薯愈傷組織為材料，確定0.8% EMS 處理4 h 可達(dá)到較好的半致死效果。盧銀等[18]以大白菜種子為材料，確定0.4% EMS 誘變處理16 h 為大白菜種子EMS 誘變的半致死劑量。張兵[28]用LD50為指標(biāo)確定山農(nóng)5 號(hào)黃瓜的EMS 最佳誘變條件為1% EMS 處理22 h。本試驗(yàn)以中國(guó)南瓜高代自交系種子為材料，以半致死率為最佳誘變條件的篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)中國(guó)南瓜種子用1.6% EMS 處理12 h時(shí)，其發(fā)芽率為59%，成苗率為65%，M2總體表型突變頻率達(dá)11.20%，利用此方法進(jìn)行中國(guó)南瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建，既可產(chǎn)生較高的突變頻率，又可保障突變體庫(kù)具有一定的規(guī)模。

3.2 中國(guó)南瓜突變體庫(kù)M2 表型變異調(diào)查與固定

本研究利用1.6% EMS 處理10 000 粒中國(guó)南瓜種子12 h 時(shí)，獲得了由3 960 個(gè)單株組成的M1群體，對(duì)M1群體進(jìn)行全生育期觀察發(fā)現(xiàn)，該群體在苗期存在發(fā)芽緩慢、真葉皺縮，葉片黃化、白化、葉色嵌合，葉片細(xì)小或無(wú)法正常展開(kāi)、植株矮小，生殖器官退化等變異現(xiàn)象，這與前人的研究結(jié)論一致[28-29]。由于M1中很多變異是化學(xué)藥害造成的假突變，因此無(wú)需對(duì)M1進(jìn)行選擇，但有必要進(jìn)行觀測(cè)，一方面可以通過(guò)M1的變異情況評(píng)估誘變效果，另一方面為M2突變材料的篩選提供必要指導(dǎo)。M1代全部自交留種，共收獲725個(gè)單株自交瓜種子，記為M2。

每份M2種子記為一個(gè)家系，每家系種植16 株進(jìn)行表型變異的觀察，由于南瓜種植所需面積大且需單株自交授粉，目前本試驗(yàn)只對(duì)98 個(gè)家系進(jìn)行了觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)M2總突變頻率達(dá)11.20%，在株形、葉片大小、果形、花色等方面獲得了一批穩(wěn)定遺傳的突變材料。本試驗(yàn)仍剩余627 個(gè)家系未進(jìn)行篩選，基于已篩選家系的突變頻率推測(cè)，預(yù)期將獲得很多突變材料，可為下一步進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究及新品種選育提供材料研究基礎(chǔ)。

3.3 突變性狀的遺傳分析是突變體進(jìn)一步研究利用的基礎(chǔ)

EMS 誘變是非定向的，產(chǎn)生的突變材料在育種上是否有應(yīng)用價(jià)值需要在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)一步檢驗(yàn)，但這些突變材料在相關(guān)基礎(chǔ)研究中意義重大，對(duì)突變性狀進(jìn)行遺傳分析是進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究的前提。M1中出現(xiàn)了很多葉色嵌合、葉片形態(tài)變化、生殖器官退化等表型，但是這些表型在其M2株系中大部分恢復(fù)正常，這與前人的研究結(jié)論一致[30]。一般情況下，EMS 導(dǎo)致的點(diǎn)突變往往導(dǎo)致基因的失活，假如突變位點(diǎn)為表型相關(guān)基因，則在M2株系中會(huì)出現(xiàn)突變的隱性表型[31]。本試驗(yàn)在M2中發(fā)現(xiàn)很多表型突變材料，經(jīng)M3驗(yàn)證能夠穩(wěn)定遺傳的有以下幾種:花色突變材料，該材料可作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于南瓜的雜交制種過(guò)程、開(kāi)發(fā)新型制種模式；短蔓突變材料節(jié)間長(zhǎng)變短、半蔓生，株形緊湊，是培育短蔓品種的理想材料；強(qiáng)雄與單性結(jié)實(shí)突變材料，強(qiáng)雄材料45 節(jié)內(nèi)無(wú)雌花、單性結(jié)實(shí)突變材料雌花花冠無(wú)法正常打開(kāi)但可正常坐果，這兩個(gè)材料對(duì)研究南瓜性別意義重大。本研究后續(xù)將從這些性狀的基因定位等方面開(kāi)展工作，進(jìn)而提高中國(guó)南瓜的基礎(chǔ)研究水平。

本研究突變體庫(kù)數(shù)量較大且南瓜突變體篩選相對(duì)困難，在突變性狀的鑒定中，本試驗(yàn)只對(duì)表型變異進(jìn)行了鑒定，而其他一些與育種關(guān)系密切的性狀，如果實(shí)淀粉含量、纖維素含量、抗逆性等未進(jìn)行篩選，下一步將加強(qiáng)這些方面的篩選工作，同時(shí)做好已獲得突變材料的基礎(chǔ)研究爭(zhēng)取獲得更多能夠應(yīng)用于育種實(shí)踐的突變材料。

4 結(jié)論

本研究確定了中國(guó)南瓜高代自交系N87 種子EMS 誘變的最佳條件為1.6% EMS 處理12 h，該處理下種子發(fā)芽率為59%。構(gòu)建了由725 個(gè)M2家系組成的中國(guó)南瓜突變體庫(kù)，M2總體表型突變頻率達(dá)11.20%。通過(guò)該突變體庫(kù)篩選到了一些能夠穩(wěn)定遺傳的突變材料，其中花色突變材料、短蔓突變材料、單性結(jié)實(shí)突變材料、強(qiáng)雄突變材料有望在南瓜輕簡(jiǎn)化栽培上發(fā)揮重要作用。另外，本研究確定了花色突變和短蔓突變?yōu)閱位螂[性突變所致，相關(guān)基因的定位工作正穩(wěn)步推進(jìn)。