張 敏，彭 嬌，劉 潔，毛倩倩，陳麗明，林明和*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003）

銀屑病是一種臨床常見的皮膚病，以皮膚出現(xiàn)形狀不一、大小不等的紅斑和肥厚的白色鱗屑為主要特征，以淋巴細(xì)胞浸潤、角質(zhì)細(xì)胞異常增生、細(xì)胞因子分泌異常為主要病理表現(xiàn)［1-2］。該病病程長，易反復(fù)發(fā)作，可不同程度影響患者生活質(zhì)量［3-4］。西醫(yī)治療銀屑病多采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及維甲酸類等藥物治療，可在短期內(nèi)改善臨床癥狀，但緩解期過短，停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)極高，且長期應(yīng)用可出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)［5］。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是廣泛存在于植物中的一類活性成分，具有抗腫瘤、抗突變、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用［6］。相關(guān)研究表明，RES具有抑制HaCaT細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用［7］，其作用機(jī)制可能與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路有關(guān)，STAT3通路高度參與銀屑病角質(zhì)細(xì)胞的異常增殖、活化及凋亡全過程［8］。本研究以體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，研究RES抑制HaCaT細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的作用及其對(duì)STAT3信號(hào)通路的調(diào)控作用，為中藥治療銀屑病的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞及藥物來源 人永生化表皮細(xì)胞HaCaT（貨號(hào)：KG300）購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心液氮中保存；RES用DMSO配制成濃度為50 mmol／L的溶液，超聲10 min助溶，于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM、FBS、胰酶（美國Life Technologies公司）；青霉素-鏈霉素混合液（Penicillin-Streptomycin）、細(xì)胞裂解液（Pierce RIPA Buffer）、BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo公司）；MTT粉末（北京索萊寶科技有限公司）；DMSO（廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司）；細(xì)胞周期即時(shí)檢測試劑盒、AnnexinⅤ-FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；磷酸酶抑制劑（Phos-STOP EASYpack，美國Roche公司）；蛋白酶抑制 劑（CALBLOCHEM公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（康為世紀(jì)公司）；STAT3、p-STAT3、Pim-1原癌基因絲氨酸／蘇氨酸激酶（Pim-1 proto-oncogene，serine／threonine kinase，PIM1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl2-Associated X的 蛋白質(zhì)（Bcl2-associated X，Bax）抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司］；Cyclin D1、β-actin抗體及二抗（羊抗兔IgG）（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（徠卡儀器公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Countstar公司）；Elx800酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；流式細(xì)胞儀（FCM）（美國BD公司）；7500 realtime PCR儀（美 國ABI公 司）；APC 300電 泳 儀、ChemiDocXRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，并于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長，待長至80%～90%匯合度時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e稀釋成不同細(xì)胞密度用于細(xì)胞傳代和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度（25、50、100μmol／L）的RES組，共4組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞以2.5×105個(gè)／孔濃度接種于6孔板，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入等體積不同濃度的RES（25、50、100μmol／L）干預(yù)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期的Ha-CaT細(xì)胞，用含EDTA-0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL，種于96孔培養(yǎng)板，100μL／孔，置37℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁生長覆蓋率達(dá)50%時(shí)，加入不同濃度的RES（0、25、50、100μmol／L）刺激，分別干預(yù)24 h和48 h后吸取各孔溶液，每孔加入100μL的0.5 mg／mL MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)液體。往每孔內(nèi)加入100μL DMSO，振蕩后，在570 nm處測A值。

2.4 AnnexinⅤ／PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長的HaCaT細(xì)胞以2.5×105個(gè)／孔濃度接種于6孔板后，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，經(jīng)不同濃度RES干預(yù)24 h，收集細(xì)胞，離心，重懸和計(jì)數(shù)后，收集5×105細(xì)胞，依次加入500μL Binding Buffer、5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL碘 化 丙 啶（propidium iodide，PI）后，混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀用488 nm激發(fā)光、530 nm發(fā)射光分析細(xì)胞凋亡情況。

2.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取不同濃度的RES干預(yù)HaCaT細(xì)胞24 h，提取蛋白后定量；SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜；5%牛奶封閉2 h后，置于PIM1、Bax、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、Bcl-2及β-actin一抗中4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL發(fā)光，曝光后掃描，采用BIO-RAD Chemi Doc XRS＋成像，以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)其他指標(biāo)進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料服從正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；不服從正態(tài)分布者以中位數(shù)，四分位數(shù)間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 RES對(duì)HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同濃度的RES干預(yù)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，圖中顯示隨著RES藥物濃度的增加，HaCaT細(xì)胞密度逐漸減少，漂浮細(xì)胞增多，說明RES對(duì)HaCaT細(xì)胞生長有顯著的抑制作用，并隨濃度的增加而增強(qiáng)，見圖1。3.2 RES對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響 低濃度RES對(duì)HaCaT細(xì)胞活力無明顯影響，而高濃度RES隨濃度增加細(xì)胞活力明顯降低，同時(shí)呈現(xiàn)一定的劑量依賴和時(shí)間依賴（P＜0.05），表明RES干預(yù)能夠抑制HaCaT細(xì)胞生長。見圖2。

圖1 不同濃度RES干預(yù)HaCaT細(xì)胞形態(tài)圖（×200）

圖2 RES對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

3.3 RES對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞所占的比例逐漸上升，提示RES可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的凋亡，見圖3。

3.4 RES對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果表明，不同濃度的RES可不同程度地增加Bax／Bcl-2的表達(dá)（P＜0.01），同時(shí)隨著藥物濃度的增 加，p-STAT3／STAT3、PIM1、Cyclin D1的 表 達(dá) 量逐漸降低（P＜0.01）。提示RES可抑制STAT3通路活化，抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。見圖4和圖5。

圖3 RES對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

圖4 RES對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 RES對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討 論

銀屑病是一種與自身免疫相關(guān)的復(fù)發(fā)性慢性炎癥性皮膚病，主要病理表現(xiàn)為界限清楚、大小不一的紅色斑塊，上面附有銀白色的肥厚鱗屑，其發(fā)病機(jī)制與角質(zhì)細(xì)胞異常增殖、分化及凋亡有關(guān)。一旦發(fā)生凋亡，磷脂酰絲氨酸（PS）會(huì)立刻從細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)外翻到細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)聚集濃縮、DNA片斷化、線粒體膜電位喪失及細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象，是反應(yīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志性現(xiàn)象，可作為細(xì)胞凋亡檢測的重要指標(biāo)。其中，磷脂結(jié)合蛋白AnnexinⅤ與PS具有高度的親和力，被廣泛作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一，因此，本研究采用AnnexinⅤ／PI雙染 法檢 測RES對(duì)HaCaT細(xì) 胞凋亡的影響。前期已有研究證實(shí)Bcl-2的過度表達(dá)是導(dǎo)致皮膚病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)主要原因，其作用機(jī)理是細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性依賴于Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡成員之間的相互拮抗作用［9-10］；該家族中促凋亡成員Bad可通過蛋白間相互作用抑制Bcl-2的抗凋亡功能。PIM1激酶是PIM家族的一員，高度參與細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖、凋亡，能直接磷酸化Bad，使之失去與Bcl-2的結(jié)合能力，從而解除Bad對(duì)Bcl-2的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期動(dòng)態(tài) 平 衡 失 調(diào)［11-12］。

STAT3信號(hào)通路在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［13］。有研究表明，STAT3信號(hào)通路參與皮損表皮基層角質(zhì)細(xì)胞的異常分化、血管異常增生、過度角化等多種病理過程，STAT3磷酸化的高度激活會(huì)導(dǎo)致異常的細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化，與銀屑病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14］。因此STAT3信號(hào)通路在銀屑病的免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)及細(xì)胞信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用［15-17］。而Cyclin D1是細(xì)胞周期G1／S期轉(zhuǎn)換的正向調(diào)節(jié)因子，是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，Cyclin D1過度表達(dá)使細(xì)胞周期G1／S期轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，增加細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換速度，導(dǎo)致細(xì)胞增殖［12］。Cyclin D1可以作為p-STAT3的靶基因參與細(xì)胞異常增殖進(jìn)程［18］。RES是從中藥虎杖提取的主要活性成分，廣泛存在于多種植物中。據(jù)報(bào)道，RES的藥理學(xué)及生物學(xué)效應(yīng)極其廣泛，具有抗炎抗氧化、抑瘤促凋亡、抗凝、抗突變及免疫調(diào)節(jié)等多種作用［19-21］。研究顯示，RES能夠具有抑制HaCaT細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，在治療銀屑病方面前景廣闊，然而其具體機(jī)制還有待闡明。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RES實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞增殖、凋亡方面比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RES可提高凋亡相關(guān)基因Bax／Bcl-2的表達(dá)（P＜0.01）；同時(shí)RES可降低STAT3通路其他相關(guān)基因，如Cyclin D1、PIM1、p-STAT3／STAT3的表達(dá)，表明可通過抑制STAT3信號(hào)通路的活化來抑制HaCaT細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。結(jié)果表明STAT3信號(hào)通路參與了銀屑病的發(fā)生發(fā)展，且與HaCaT細(xì)胞的增殖和活化有關(guān)，經(jīng)RES治療后，能夠抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡，提示RES是治療銀屑病的有效藥物。

綜上，本研究推測RES可能是通過調(diào)控STAT3信號(hào)通路，發(fā)揮抑制角質(zhì)細(xì)胞增生、促進(jìn)凋亡的作用，從而緩解皮膚過度角化，達(dá)到治療銀屑病的目的。本研究為臨床應(yīng)用RES治療銀屑病提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但目前對(duì)于RES對(duì)銀屑病的作用靶點(diǎn)尚不十分清楚，還有待于進(jìn)一步研究。