程奇珍，鐘振華，王鵬，曾令峰

江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

基因毒性雜質(zhì)是指化合物本身能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向，其特點(diǎn)是在較低水平時也與DNA發(fā)生作用，導(dǎo)致DNA 突變或者致癌［1-2］。多個細(xì)胞和動物水平的實(shí)驗(yàn)證明，N-亞硝胺類化合物具有強(qiáng)致癌作用和明顯的肝毒性，不但長期小劑量接觸可以致癌，而且1 次較大劑量的沖擊也可以引發(fā)癌癥，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中也常使用N-亞硝胺類化合物對動物進(jìn)行疾病造模［3-4］。

二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）是由鹽酸二甲雙胍250 mg 與格列本脲2.5 mg 組成的復(fù)方制劑。鹽酸二甲雙胍可減少肝糖原的產(chǎn)生，降低腸對糖的吸收，并且可通過增加外周糖的攝取和利用而提高胰島素的敏感性；格列本脲為磺酰脲類降糖藥，主要通過刺激胰島β 細(xì)胞分泌胰島素產(chǎn)生降血糖作用。兩種藥物聯(lián)用,作用互補(bǔ)、較單用療效好,特別是控制2 型糖尿病患者血糖水平的效果顯著,且兩者不存在配伍禁忌［5-7］。自2018 年7 月在纈沙坦原料藥中檢出N-亞硝基二甲胺（NDMA）以來，陸續(xù)在其他沙坦類原料藥中檢出了各類亞硝胺雜質(zhì)，如NDMA、N-亞硝基二乙胺（NDEA）等。非沙坦類的藥物中（如雷尼替丁），亦有亞硝胺類雜質(zhì)的檢出。2019 年12 月4 日美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的一份聲明中表示，正在檢測在美國出售的二甲雙胍制劑中NDMA 的污染情況，引起了全球?qū)Χ纂p胍及其相關(guān)制劑中NDMA 檢測與控制的重視。NDMA 是亞硝胺類物質(zhì)中極具代表性的一種，具有致癌、致畸和致突變毒性，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為2A 類的遺傳毒性物質(zhì)［8-10］。

與傳統(tǒng)的檢測方法相比，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式基于已知或假定的反應(yīng)離子信息，有針對性地選擇數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜信號采集，對符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號記錄，去除不符合規(guī)則離子信號的干擾，通過對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析從而獲取質(zhì)譜定量信息的質(zhì)譜技術(shù)，具有靈敏、準(zhǔn)確和特異等優(yōu)點(diǎn)［11-14］。為了保證二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）的安全和質(zhì)量可控，實(shí)現(xiàn)有效的風(fēng)險(xiǎn)控制，本研究建立了二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）測定方法，采用選擇性更強(qiáng)的三重四極桿質(zhì)譜儀能夠提供更好的專屬性，避免假陽性的結(jié)果，同時進(jìn)行完整的方法學(xué)驗(yàn)證，保證NDMA 能夠準(zhǔn)確有效的檢出。旨在為鹽酸二甲雙胍復(fù)方制劑中N-亞硝胺類化合物的檢測研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器、對照品及試劑

Agilent 7890B-7000C 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；ThermoFisherSorvall ST 16R 高速離心機(jī)；

國華SHA-C 恒溫震蕩器；二氯甲烷，來源：美國ACS 恩科化學(xué)，批號：DC-1132-4000；N-亞硝基二甲胺（NDMA）對照品，來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：510166-201902，含量：97.8%。

1.2 樣品信息

本次研究共收集到A 企業(yè)生產(chǎn)的7 批次二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）樣品（批號分別為：191104、191109、200602、200603、200604、200701、200903），規(guī)格均為每粒含鹽酸二甲雙胍250 mg 與格列本脲2.5 mg。

1.3 儀器條件

色譜柱：VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管柱。測定條件：柱溫：起始溫度40 ℃，保持0.5 min，以10 ℃/min 升溫至200 ℃，再以60℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；恒流流速：1.0 mL/min；脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力12.3 psi，保持0.5 min。進(jìn)樣體積：2 μL。EI 源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；溶劑延遲時間：9 min。

方法學(xué)所用樣品：A 企業(yè)批次樣品（批號：200701）。測定NDMA 結(jié)果低于檢出限（0.005 μg/g），以未檢出計(jì)。離子對選擇及碰撞能信息見表1。

表1 NDMA離子對選擇及碰撞能

1.4 樣品溶液的制備

取本品10 粒內(nèi)容物細(xì)粉，精密稱定，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg），置50 mL 離心管中，加1 mol/L 鹽酸溶液10 mL，渦旋1 min，以350 次/ min 的頻率振搖10 min，精密加入二氯甲烷10 mL，渦旋1 min，以350 次/ min 的頻率振搖10 min，離心分離（4 000 r/ min，10 min），取下層二氯甲烷層，以0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液。

1.5 對照品溶液的制備

精密稱取NDMA 對照品99.54 mg，置100 mL預(yù)裝有二氯甲烷的量瓶中，振搖使溶解，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用二氯甲烷定量稀釋制成含NDMA 約500 ng/mL 的溶液，作為NDMA 對照品貯備液。精密量取NDMA 對照品貯備液適量，用二氯甲烷定量稀釋制成每1 mL 中分別含0.243、0.487、0.974、2.434、4.868、9.735、19.470、48.675 ng 的溶液，作為NDMA 對照品線性系列溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢出限、定量限試驗(yàn)

取“1.5”中濃度為0.243 ng/mL 的對照品溶液作為檢出限溶液，精密量取2 μL，注入氣相質(zhì)譜儀，其定量離子對74 →44.1 主峰的信噪比約為4.7，定性離子對74 →42.1 主峰的信噪比約為3.6；取“1.5”中濃度為0.487 ng/mL 的對照品溶液作為定量限溶液，精密量取2 μL，注入氣相質(zhì)譜儀，其定量離子對74 →44.1 主峰的信噪比約為11.1，定性離子對74 →42.1 主峰的信噪比約為10.6。結(jié)合樣品溶液的配制比例計(jì)算得二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 的檢出限和定量限以鹽酸二甲雙胍量計(jì)算分別為0.005 μg/g 及0.01 μg/g。

2.2 線性關(guān)系

按照“1.5”配制的8 個不同濃度的對照品線性系列溶液，按照“1.3”項(xiàng)中的儀器條件進(jìn)行測定。以NDMA 的濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，以質(zhì)譜響應(yīng)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果：線性方程Y=100 212.420 747X-36 006.551 454，R2=0.999 7，見圖1。結(jié)果表明，NDMA 在0.243～48.626 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 NDMA線性關(guān)系圖

2.3 精密度試驗(yàn)

取“1.5”中濃度為約0.487 ng/mL 的對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，所得NDMA 的峰面積分別為40 748、43 493、44 395、39 791、42 203、40 973，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%，結(jié)果表明，NDMA 在定量限濃度的精密度良好。取“1.5”中濃度為約2.434 ng/mL 的對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，所得NDMA 的峰面積分別為218 803、224 987、209 882、219 309、230 927、220 683，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%，結(jié)果表明，NDMA在限度濃度的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取5 號回收率試驗(yàn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，分別于0、2、4、8、12、18、24 小時，注入氣相質(zhì)譜儀，測定峰面積，計(jì)算濃度，結(jié)果見表2。室溫條件下，樣品溶液中NDMA 檢測量RSD 為1.5%，說明樣品溶液在24 小時內(nèi)較穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5 回收試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號：200701）內(nèi)容物細(xì)粉適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg），精密稱定9 份，分別置50 mL 離心管中，精密加入“1.5”中濃度為48.675 ng/mL 的對照品溶液0.25、0.25、0.25、0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0 mL，加1N 鹽酸溶液10 mL，渦旋1 min，以350 次/min 的頻率振搖10 min，精密加入二氯甲烷9.75、9.75、9.75、9.5、9.5、9.5、9.0、9.0、9.0 mL，渦旋混勻1 min，再以350 次/min 的頻率振搖10 min，然后以4 000 rmp 的速率離心10 min，取下層二氯甲烷層，以0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液。即得1～9 號回收率試驗(yàn)溶液。精密量取回收率試驗(yàn)樣品溶液2 μL，分別注入氣相-質(zhì)譜儀，記錄離子譜圖，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：平均回收率為96.13%，RSD 為2.4%，回收率較好。

2.6 重復(fù)性

精密稱取樣品（批號：200701）內(nèi)容物細(xì)粉適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg），精密稱定6份，分別置50 mL 離心管中，精密加入“1.5”中濃度為48.675 ng/mL 的對照品溶液0.5 mL，加1N 鹽酸溶液10 mL，渦旋1 min，以350 次/分的頻率振搖10 min，精密加入二氯甲烷9.5 mL，渦旋混勻1 min，再以350 次/分的頻率振搖10 min，然后以4 000 rmp 的速率離心10 min，取下層二氯甲烷層，以0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液。即得1～6 號穩(wěn)定性試驗(yàn)溶液。精密量取穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品溶液2 μL，分別注入氣相-質(zhì)譜儀，記錄離子譜圖，結(jié)果顯示：6 份加標(biāo)濃度為2.433 8 ng/mL 樣品溶液測得的NDMA 平均含量為2.362 2 ng/mL，RSD 為3.0%，說明方法重復(fù)性良好。

2.7 樣品測定結(jié)果

A 企業(yè)生產(chǎn)的7 批次二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）樣品經(jīng)過“1.4”處理制得樣品溶液，按照“1.3”項(xiàng)中的儀器條件進(jìn)行測定。測定結(jié)果以鹽酸二甲雙胍量計(jì)算。結(jié)果顯示：7 批次樣品溶液中NDMA 含量均低于檢出限，以未檢出計(jì)。

3 討論

根據(jù)工藝分析，二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中的NDMA 主要為二甲雙胍原料藥合成工藝中帶入。FDA根據(jù)The Carcinogenic Potency Database（CPDB數(shù)據(jù)庫）中的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，通過換算，列出了可供參考的N-亞硝基二甲胺人體攝入限值為0.096 μg/d。按照二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）說明書中描述，日最大劑量不超過8 粒（鹽酸二甲雙胍2 g，格列本脲20 mg），以鹽酸二甲雙胍日最大計(jì)量計(jì)量2 g 計(jì)算，N-亞硝基二甲胺在二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中的含量不得過0.048 μg/g（以鹽酸二甲雙胍計(jì)）。結(jié)合本研究“1.4”樣品溶液鹽酸二甲雙胍濃度50 mg/mL 計(jì)算，NDMA 的限度濃度為2.4 ng/mL，該濃度為本方法設(shè)計(jì)的“2.2”對照品系列線性溶液的中間濃度點(diǎn)。從測定結(jié)果可以看出，A 企業(yè)生產(chǎn)的7 批次二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）樣品均未檢出NDMA，表明該企業(yè)對于產(chǎn)品中NDMA 的控制較好。

表3 回收率試驗(yàn)

圖2 對照品溶液（A）、空白溶液（B）及樣品溶液（C）總離子流典型圖譜

通過方法學(xué)驗(yàn)證可知，方法線性范圍寬，線性相關(guān)性好；方法檢出限為0.005 μg/g，定量限為0.01 μg/g，說明方法靈敏度較高；回收試驗(yàn)結(jié)果顯示平均回收率為92.41%～101.02%（n=9），RSD（%）為2.4，表明該方法準(zhǔn)確度較高，能夠很好實(shí)現(xiàn)二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 基因毒性雜質(zhì)殘留量的準(zhǔn)確測定；重復(fù)性及精密度試驗(yàn)表現(xiàn)良好。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)建立GC-MS/MS 測定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 的方法具有噪音低，專屬性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，可以很好的應(yīng)用于生產(chǎn)企業(yè)對二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 基因毒性雜質(zhì)的日常檢測。