陳婉嫻，王思?jí)?，陳張瑜 ，王潘集，鄭淳文 ，李恩民，*，許麗艷

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，廣東汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

食管癌是常見的上消化道惡性腫瘤，是全球十大惡性腫瘤之一。全世界每年約有40 余萬人死于食管癌，我國是食管癌高發(fā)國，每年約一半的食管癌新發(fā)病例在我國。食管癌患者的預(yù)后差，5 年生存率僅15%左右，主要原因是缺少抗食管癌的特異性分子靶向藥物。細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，CDC42)是小G 蛋白R(shí)ho 家族的核心成員，在與GTP 結(jié)合/活化狀態(tài)和與GDP 結(jié)合/失活狀態(tài)之間循環(huán)切換，發(fā)揮“ON/OFF”開關(guān)作用。有研究報(bào)道，CDC42與細(xì)胞分裂、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞偽足形成和細(xì)胞極性等密切相關(guān)，在細(xì)胞惡性演進(jìn)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這提示從分子水平上深入研究CDC42在腫瘤細(xì)胞惡變中所扮演的角色，將有助于明確CDC42抑制劑在腫瘤治療中的作用。已知CASIN是一個(gè)靶向CDC42的小分子抑制劑，通過抑制CDC42上的鳥嘌呤核苷酸交換而發(fā)揮作用。近年來，有報(bào)道將CASIN 用于臨床過敏性氣道炎癥和哮喘的治療。隨著對(duì)CDC42在惡性腫瘤中作用機(jī)制研究的不斷深入，CASIN 用于惡性腫瘤治療的前景已被充分展現(xiàn)。故本實(shí)驗(yàn)擬探討CDC42抑制劑CASIN對(duì)食管癌細(xì)胞活力與遷移的抑制作用，為將來CASIN作為新型分子靶向藥物應(yīng)用于臨床抗食管癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

CDC42鼠抗(Cytoskeleton公司)，Beta Actin單克隆抗體和HRP偶聯(lián)的二抗(Proteintech公司)，F(xiàn)astPfu DNA聚合酶(北京全式金公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(Biomiga 公司)，F(xiàn)lag-CDC42 質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，攜有氨芐霉素抗性基因，F(xiàn)lag 標(biāo)簽，

CDC42

基因編碼序列全長(zhǎng))，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Scientific 公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，CASIN(Med ChemExpress 公司，溶解于100%DMSO 保存)，胰酶、RMPI 1640 培養(yǎng)基和 DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，細(xì)胞增殖試劑盒(Promega 公司)，OD600蛋白含量測(cè)定試劑盒(Pierce公司)，凋亡抗體試劑盒(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 篩選食管癌細(xì)胞模型

使用SDS 裂解液分別提取9 種食管癌細(xì)胞系TE1、TE3、KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450、KYSE510 和Colo680N 中總蛋白。100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每泳道15 μL 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，將其置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加CDC42 鼠抗(1∶250)、β-actin 單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜后，HRP 偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ECL 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，然后選用CDC42內(nèi)源性高表達(dá)和低表達(dá)食管癌細(xì)胞系各2 種，在37 ℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建GFP-CDC42重組表達(dá)載體

根據(jù)NCBI 檢索的

CDC42

基因序列和pEGFP 的多克隆酶切位點(diǎn)，利用Snap Gene 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物(上游 引 物 F： 5′-CTCAGATCTCGAGCTATGCAGACAATT AAGTGTGTTGTTGT-3′；下游引物 R：5′-TCGACTG CAGAATTCTCATAGCAGCACACACCTGC-3′)。引物由天一輝遠(yuǎn)公司合成，以Flag-CDC42 重組質(zhì)粒為模板，使用FastPfu DNA聚合酶反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、20 s，58 ℃、20 s，72 ℃、40 s，共循環(huán) 30 次，72 ℃延伸 5 min)，PCR產(chǎn)物經(jīng)加入Goodview染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠電泳(40 V，15 min)，在紫外觀測(cè)儀上觀察電泳結(jié)果。按照試劑盒說明書對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。然后，先用內(nèi)切酶

Eco

R I，

Xho

I處理pEGFP-C1質(zhì)粒，再用外切酶

EXo

Ⅲ處理PCR產(chǎn)物及pEGFP-C1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入

Trans5

α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在培養(yǎng)基上；挑取白色菌落，使用帶染料的2×Taq PCR StarMix 反應(yīng)體系進(jìn)行菌落PCR 鑒定(擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、40 s，共循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min)，使用瓊脂糖電泳鑒定，方法同上；之后，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，挑選影印板上的陽性克隆菌落，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶(

Eco

R I和

Xho

I)酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，方法同上；最后送華大基因公司對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序，確定表達(dá)載體構(gòu)建是否成功。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

使用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作方法按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染Flag-CDC42質(zhì)粒的細(xì)胞命名為Flag-CDC42 組，轉(zhuǎn)染Flag 空載體對(duì)照的細(xì)胞命名為Flag 組；轉(zhuǎn)染GFP-CDC42 質(zhì)粒的細(xì)胞命名為GFPCDC42 組，轉(zhuǎn)染GFP 空載體對(duì)照的細(xì)胞命名為GFP組。

1.5 細(xì)胞活力分析

在內(nèi)源性CDC42高/低表達(dá)組中，分別將4種食管癌細(xì)胞系(KYSE30、KYSE510、KYSE150 和 TE1)接種到96孔板中，1×10個(gè)/孔，待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，分別加入完全培養(yǎng)基和不同濃度的CASIN，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和CASIN 1.875、3.75、7.5、15、30、60 μmol/L 實(shí)驗(yàn)組，處理細(xì)胞24 h。每組3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

在外源性CDC42 高/低表達(dá)組中，將轉(zhuǎn)染Flag 或Flag-CDC42 的 2 種食管癌細(xì)胞系(KYSE510 和 TE1)接種到96 孔板中，1×10個(gè)/孔，待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，分別加入完全培養(yǎng)基和0、20 μmol/L的CASIN，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和20 μmol/L 的CASIN組，處理細(xì)胞24 h。每組3 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。之后根據(jù)說明書，每個(gè)孔加入20 μL 的MTT 溶液(5 mg/mL)，使用Biotek EL×800 酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490 nm處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=[

D

(490)-

D

(490)]/[

D

(490)-

D

(490)]×100%

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

在內(nèi)源性CDC42高/低表達(dá)組中，將上述4種食管癌細(xì)胞系接種至12 孔板中，3.5×10個(gè)/孔，貼壁后饑餓12 h，用200 μL 槍頭尖端進(jìn)行劃痕，分別加入0、15和30 μmol/L的CASIN，處理細(xì)胞24 h后，拍照。

在外源性CDC42 高/低表達(dá)組中，將轉(zhuǎn)染Flag 或Flag-CDC42 的2 種食管癌細(xì)胞系接種接種至12 孔板中，3.5×10個(gè)/孔，貼壁后饑餓12 h，用200 μL槍頭尖端進(jìn)行劃痕，分別加入0和20 μmol/L的CASIN，處理細(xì)胞24 h后，拍照。

在指定區(qū)域顯微成像，用ImageJ 軟件分析創(chuàng)面愈合情況。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。計(jì)算愈合率。

愈合率=(劃痕初始面積-培養(yǎng)后的劃痕面積)/劃痕初始面積×100%

1.7 Western blot 檢測(cè) Caspase-3 和 PARP 蛋白表達(dá)情況

在內(nèi)源性CDC42 高/低表達(dá)組中，細(xì)胞用CASIN抑制劑處理24 h后，經(jīng)SDS裂解液裂解，提取細(xì)胞蛋白，并使用OD600 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白含量。Western blot 操作方法按說明書進(jìn)行。蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，將其置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加PARP 抗體(1∶2 000)、Caspase-3 抗體(1：1 000)、Beta-Actin 單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，HRP偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ECL顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.8 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞偽足的形成

在外源性CDC42 高/低表達(dá)組中，將轉(zhuǎn)染pEGFP或pEGFP-CDC42 的2 種食管癌細(xì)胞系(KYSE30 和KYSE150)接種至 12 孔板中，3.5×10個(gè)/孔，待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，加入CASIN(KYSE30 細(xì)胞系采用0 和15 μmol/L的CASIN；KYSE150細(xì)胞系采用0和20 μmol/L的CASIN)，處理細(xì)胞24 h。取出培養(yǎng)板后，用PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100通透30 s，再用25 μg/mL熒光素標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Actinstain555 Fluorescent Phalloidin)染色 40 min，PBS 洗3次，封片，蔡司800共聚焦顯微鏡下拍照成像。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)源性CDC42 蛋白高、低表達(dá)食管癌細(xì)胞模型的篩選結(jié)果

Western blot 檢測(cè)結(jié)果見圖1，CDC42 蛋白在不同食管癌細(xì)胞系中表達(dá)存在明顯的差異。基于此，從中選擇KYSE30和KYSE510(CDC42內(nèi)源性高表達(dá))，以及KYSE150和TE1(CDC42內(nèi)源性低表達(dá))共4種細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 Western blot檢測(cè)CDC42蛋白在9種不同食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 CASIN影響內(nèi)源性高/低表達(dá)CDC42食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力

CASIN 對(duì)上述4 種食管癌細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響見圖 2A～D。與對(duì)照組(即 CASIN 濃度為 0 μmol/L)比較，當(dāng)CASIN為低濃度(0～7.5 μmol/L)時(shí)，細(xì)胞的活力 不 降 反 升 (

P

＜0.05)； 而 當(dāng) CASIN 為 高 濃 度 (15～60 μmol/L)時(shí)，細(xì)胞的活力顯著降低(

P

＜0.05)?；诒疚牡难芯磕繕?biāo)，將CASIN 的濃度設(shè)置在較高的15～30 μmol/L，以此開展后續(xù)的研究。隨后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)(圖2E～H)發(fā)現(xiàn)，處理24 h 后，與對(duì)照組相比，15 μmol/L CASIN，可明顯抑制KYSE150、KYSE510和TE1 這3 種食管癌細(xì)胞的遷移能力(

P

＜0.05)；對(duì)于KYSE30食管癌細(xì)胞，15 μmol/L的CASIN雖然也抑制其遷移能力，但差異不顯著，說明不同的食管癌細(xì)胞對(duì)于CASIN 的抑制作用不同。30 μmol/L 的CASIN，對(duì)于 KYSE150、KYSE510、TE1 和 KYSE30 這 4 種食管癌細(xì)胞，抑制效果較15 mol/L 時(shí)均明顯增強(qiáng)(

P

＜0.01)。

圖2 細(xì)胞活力分析和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3，)

2.3 CASIN誘導(dǎo)內(nèi)源性高/低表達(dá)CDC42的食管癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡

圖3 CASIN 誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞Caspase-3 高表達(dá)及促進(jìn)PARP 蛋白裂解的Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot 檢測(cè)結(jié)果見圖3?？梢?，與對(duì)照組(0 μmol/L的CASIN)比較，15和30 μmol/L的CASIN均可以明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞(KYSE150和KYSE30)凋亡酶Caspase-3 高表達(dá)，同時(shí)顯著促進(jìn)了Caspase-3 底物蛋白PARP 的裂解。由此，推測(cè)CASIN 可能通過激活凋亡酶Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)其底物蛋白PARP裂解的細(xì)胞信號(hào)通路，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力。

2.4 GFP-CDC42重組表達(dá)載體成功構(gòu)建

擴(kuò)增的CDC42 片段經(jīng)回收后，與pEGFP 載體連接，獲得的重組質(zhì)粒pEGFP-CDC42經(jīng)

Eco

R I和

Xho

I雙酶切鑒定，結(jié)果提示(圖4A)，重組表達(dá)載體中外源片段的長(zhǎng)度(576 bp)同理論CDC42編碼區(qū)的長(zhǎng)度一致，表明已成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pEGFP-CDC42。測(cè)序結(jié)果(圖4B)亦顯示擴(kuò)增序列與GenBank中的完全一致。

圖4 GFP-CDC42重組表達(dá)載體成功構(gòu)建

2.5 CASIN抑制外源性CDC42高表達(dá)食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力

從圖5 可見，與對(duì)照組(0 μmol/L 的CASIN)相比，20 μmol/L的CASIN作用后，2種食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力均被顯著抑制(

P

＜0.05)。此外，從圖5A、5B和5F可見，當(dāng)CASIN濃度為0時(shí)，與轉(zhuǎn)染Flag質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染Flag-CDC42質(zhì)粒組細(xì)胞的活力和遷移能力可以明顯增加(

P

＜0.05)；而用20 μmol/L的CASIN處理24 h后，可以削弱CDC42對(duì)細(xì)胞活力和遷移能力的增強(qiáng)作用(

P

＜0.05)。

圖5 CASIN抑制外源性CDC42高表達(dá)食管癌細(xì)胞活力和遷移能力的檢測(cè)結(jié)果(n=3，)

2.6 CASIN影響外源性CDC42高表達(dá)食管癌細(xì)胞偽足的形成

本研究成功構(gòu)建pEGFP-CDC42 綠色熒光標(biāo)簽表達(dá)載體后，將其轉(zhuǎn)染至KYSE150 和KYSE30 食管癌細(xì)胞中，利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察(圖6)發(fā)現(xiàn)，與GFP對(duì)照組相比，GFP-CDC42 組細(xì)胞的偽足數(shù)量增多，偽 足的長(zhǎng)度變長(zhǎng)；與此同時(shí)，用15 或20 μmol/L 的CASIN處理24 h，可使CDC42高表達(dá)食管癌細(xì)胞偽足變多變長(zhǎng)的效果被明顯抵消。

圖6 CASIN影響外源性CDC42高表達(dá)食管癌細(xì)胞偽足形成的免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果(×40)

3 討 論

迄今為止，同步放化療依然是局部晚期不可手術(shù)切除食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。但是，放化療的非選擇性與毒副作用嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后。相比較而言，分子靶向藥物可以選擇性地作用于與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的靶點(diǎn)分子，相應(yīng)地減少毒性反應(yīng)，因此，可以明顯提高療效。基于此，本研究以我國發(fā)病率高且缺少分子靶向藥物的食管癌為研究對(duì)象，以CDC42為分子靶點(diǎn)，采用CDC42抑制劑CASIN，探究其對(duì)食管癌細(xì)胞的抑制作用，為將CASIN最終開發(fā)成抗食管癌的分子靶向藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

首先，本研究采用細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，給予一定濃度(15～30 μmol/L)的CASIN，能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力。其次，為了明確CDC42表達(dá)能夠增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力，進(jìn)一步構(gòu)建了外源性CDC42高表達(dá)的食管癌細(xì)胞模型；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDC42高表達(dá)的確可以顯著增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的活力和遷移能力。此外，CDC42外源性高表達(dá)的食管癌細(xì)胞，其受到CASIN 抑制作用的程度，明顯強(qiáng)于CDC42低表達(dá)的對(duì)照組食管癌細(xì)胞。由此可見，CDC42在食管癌細(xì)胞的惡性演進(jìn)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而CDC42抑制劑CASIN被開發(fā)成用于治療食管癌的分子靶向藥物有現(xiàn)實(shí)的研究?jī)r(jià)值。

已知CDC42是重要的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)開關(guān)，研究確定CASIN抑制食管癌細(xì)胞活力和遷移能力的分子作用機(jī)制，可在理論上解釋CASIN 可抑制食管癌的增殖。近年有關(guān)肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤的研究報(bào)道提示，CDC42 的作用與抗腫瘤細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系?；诖耍Y(jié)合本文所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，給予一定濃度的CASIN處理食管癌細(xì)胞，阻斷細(xì)胞的CDC42激活信號(hào)，抑制CDC42 的激活，最終可引起Caspase-3 表達(dá)增加，裂解PARP，可能誘導(dǎo)了食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。與此同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，CDC42高表達(dá)能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的偽足明顯變多變長(zhǎng)，表明CDC42有促進(jìn)食管癌細(xì)胞偽足形成的作用，而CASIN 可使CDC42 高表達(dá)的食管癌細(xì)胞偽足形成的作用被明顯削弱。

綜上，一定濃度(15～30 μmol/L)的CASIN 可阻斷食管癌細(xì)胞CDC42信號(hào)激活，使細(xì)胞的活力和遷移能力明顯下降，抑制細(xì)胞偽足的形成，并最終可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。CDC42是一種有潛力的食管癌分子靶點(diǎn)，其抑制劑CASIN有望被研究開發(fā)成一種新型的抗食管癌的分子靶向藥物。