張 娜，范志露，楊荔艷，常 晨，蔡 巖，郝佳潔，王明榮

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京 100021)

食管鱗癌是我國乃至世界上最常見的癌癥死亡原因之一。由于對該疾病的認識尚不充分，食管鱗癌(尤其是中晚期食管鱗癌)的治療效果欠佳，患者總體生存期相對較短。因此，探索食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制至關(guān)重要。

絲氨酸肽酶抑制劑分支B 成員5(serpin peptidase inhibitor clade B member 5，SERPINB5)，也稱為乳腺癌絲氨酸蛋白酶抑制子Maspin，但其實際并無絲氨酸蛋白酶抑制活性，其在不同的細胞中可能發(fā)揮不同的作用。SERPINB5已被報道與腫瘤相關(guān)，但其在不同腫瘤中的變化也不一致。例如在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、膠質(zhì)瘤和口腔癌中，SERPINB5表達下調(diào)。相反，在甲狀腺癌、膽囊癌、結(jié)直腸癌以及胰腺癌中，SERPINB5 表達上調(diào)。有研究表明，食管鱗癌組織中SERPINB5 mRNA表達水平下調(diào)，但是尚不清楚其在該病中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中SERPINB5 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平均較正常食管組織降低。過表達SERPINB5 可抑制AKT/mTOR 通路，進而降低食管鱗癌細胞的增殖、集落形成以及裸鼠成瘤能力。本研究進一步鑒定了與高表達SERPINB5 協(xié)同抑制食管鱗癌細胞生長的小分子抑制劑，探討了SERPINB5 對食管癌治療可能的意義。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫分析

從基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)下載81 例食管鱗癌組織的SERPINB5 mRNA 表達數(shù)據(jù)和臨床病理參數(shù)信息，并從中提取SERPINB5 mRNA 每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase per million，F(xiàn)PKM)值與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、疾病分期和生存時間信息并進行相關(guān)性分析。從基因表達庫(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫下載GSE20347微陣列數(shù)據(jù)集，比較SERPINB5 mRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達情況。

1.2 食管癌臨床樣本

16例食管鱗癌組織及配對的手術(shù)切緣正常組織均來自中國林州食管癌醫(yī)院?；颊呤中g(shù)前未接受過任何治療，所有標本均為病理診斷后的剩余標本。本研究已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(No.16-084/1163)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

食管鱗癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510 細胞為日本東京大學(xué)Shimada 教授惠贈，TE1 和TE10 購自美國組織細胞培養(yǎng)庫(American Tissue Culture Collection，ATCC)公司，均使用含10%胎牛血清(澳大利亞 Ausgene X 公司)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基(中國細工生物公司)，置于37 ℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人胚腎細胞293FT(美國Invitrogen 公司)使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基(中國細工生物公司)，添加1%非必需氨基酸、1% L 型谷氨酰胺以及1% Geneticin(美國Gibco 公司，10131-035)，置于37 ℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 過表達載體構(gòu)建

從KYSE150 細胞中提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為世紀公司)獲得cDNA，以該cDNA 為模板進行PCR 獲得SERPINB5 的編碼區(qū)全長。分別使用真核表達載體pcDNA3.1(+)/Myc-His C和慢病毒表達載體pLVX-IRES-Neo構(gòu)建用于瞬時過表達和穩(wěn)定過表達SERPINB5 的載體。用于構(gòu)建瞬時過表達載體的引物序列：上游，5′-CCCAAGCTTATG GATGCCCTGCAACTA-3′；下游，5′-CCGGAATTCC AGGAGAACAGAATTTGCCAA-3′；用于構(gòu)建穩(wěn)定過表達載體的引物序列：上游，5′-CCGGAATTCATGGAT GCCCTGCAACTAG-3′；下游，5′-GCTCTAGAAGGA GAACAGAATTTGCCAAAGA-3′。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染實驗

取對數(shù)生長期的細胞以30%～50%的密度接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h后進行轉(zhuǎn)染，設(shè)置親本組、pcDNA3.1 空載組和SERPINB5 過表達組。首先將原培養(yǎng)液棄掉，PBS 清洗兩遍后加入1 mL 無血清培養(yǎng)基備用。然后分別配制A 液[5 μL lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher Scientific公司)+250 μL Opti-MEM(美國 Gibco 公司)]和 B 液[2.5 μg 質(zhì)粒DNA+250 μL Opti-MEM]，室溫孵育5 min，將二者混勻并室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)皿中。37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.4 慢病毒包裝和細胞感染

慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2 和pMD2G 均為本實驗室保存質(zhì)粒載體。取對數(shù)生長期的293FT細胞以80%的密度接種于6 cm平皿中，37 ℃培養(yǎng)12 h 后進行轉(zhuǎn)染。首先將原培養(yǎng)液棄掉，PBS清洗兩遍后加入2 mL無血清培養(yǎng)基備用。然后分別配制 A 液(18 μL lipofectamine 2000+500 μL Opti-MEM)和 B 液(6 μg 質(zhì)粒 DNA+3 μg psPAX2+3 μg pMD2G+500 μL Opti-MEM)，室溫孵育5 min，將二者混勻并室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)皿中，6 h 后更換為2.5 mL 含30%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h和48 h后各收集一次病毒上清，用0.45 μm濾膜過濾，保存于-80 ℃冰箱。感染靶細胞時，設(shè)置親本組(不加病毒上清)和pLVX空載組(加pLVX空載病毒上清) 為 對 照 組 ， SERPINB5 過 表 達 組 ( 加 pLVXSERPINB5病毒上清)為實驗組，將0.5 mL病毒上清和1.5 mL 完全培養(yǎng)基加入6 孔板中密度為50%左右的靶細胞中，加入濃度為8 μg/mL的Polybrene(上海翊圣生物科技有限公司)，感染12 h 后更換為完全培養(yǎng)基，利用 500 μg/mL 的 Geneticin 篩選 7 d 后，更換為 250 μg/mL的Geneticin培養(yǎng)。

1.3.5 蛋白提取和Western blot實驗

培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期時收獲(對于轉(zhuǎn)染后的細胞，則于轉(zhuǎn)染48 h后收獲)，用預(yù)冷PBS 洗2 次，加入適量PBS，用細胞刮刮取細胞于收集管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清獲得細胞沉淀。加入適量蛋白裂解液(碧云天公司，P0013B)，冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清移至新的離心管中。臨床標本蛋白采用組織蛋白提取試劑盒提取(美國Invent Biotechnologies 公司)。使用BCA 蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific 公司)進行蛋白定量。取一定體積的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，98 ℃金屬浴中變性10 min，瞬時離心。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，使用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗后4 ℃孵育過夜。一抗包括：購自美國Cell Signaling Technology 公司的p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR 抗體 ， 購 自 美 國 Proteintech 公 司 的 SERPIN B5、GAPDH、His 標簽(66005-1-Ig)抗體，購自美國Immunoway 公司的Aurora A 抗體，以及購自美國Abcam 公司的 p-Aurora A 抗體。使用 TBST 清洗 4 次，每次6 min，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST 清洗4 次，每次6 min，使用LAS4010 或Amersham Imager 800 成像儀進行曝光。使用ImageJ 軟件分析灰度值并計算蛋白相對表達量。

1.3.6 細胞增殖和克隆形成實驗

收集細胞并進行計數(shù)，取1 000 個細胞接種于96 孔板中，每組(親本組、空載組和SERPINB5 過表達組)設(shè)置4 個平行孔和空白對照孔，于37 ℃、CO體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后開始，每天同一時間取出一塊96 孔板進行檢測。每孔加入100 μL CCK-8稀釋液(購自日本同仁化學(xué)，使用RPMI 1640 按1∶10 比例稀釋)，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。使用酶標儀(美國BioTek 公司)在450 nm處測量吸光度值，計算相對生長速率，繪制細胞生長曲線。

將對數(shù)生長期的細胞用胰酶(美國Gibco公司)消化計數(shù)，6 孔板每孔接種1 000 個細胞，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d。待集落肉眼可見時，甲醇固定30 min，棄去固定液，稍干燥后加入0.5%結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水洗去殘余染液，拍照獲得集落形成圖。

1.3.7 裸鼠移植瘤實驗

SPF級4周齡雌性BALB/cA-nu 裸鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)，實驗前稱體質(zhì)量，按照體質(zhì)量分組，設(shè)置pLVX 空載組和SERPINB5 過表達組，使不同體質(zhì)量的裸鼠在各組間平均分布。將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞消化，PBS清洗兩遍，重懸于PBS中，計數(shù)。將濃度為1×10個/mL 的細胞接種于裸鼠上肢腋下部位。待瘤體長出后每周測量2 次皮下瘤體積。計算公式為：體積=長徑×短徑×短徑×0.5。3 周后處死裸鼠，解剖并稱取瘤體質(zhì)量。

1.3.8 靶向抑制實驗

在96 孔板中以5 000 個細胞/孔的密度接入穩(wěn)定過表達SERPINB5 和空載體的KYSE150細胞，12 h后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10 μL 已配制成10 μmol/L 的小分子抑制劑庫(美國Selleck 公司，終濃度為1 μmol/L，含0.1% DMSO)，對照組加10 μL 生理鹽水(含0.1%DMSO)，于37 ℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每孔加入100 μL CCK-8稀釋液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，測量450 nm處的吸光度值。將每孔吸光度值減去本底吸光度值用于后續(xù)計算，公式如下：

用以下公式計算過表達SERPINB5 與小分子藥物聯(lián)合的協(xié)同效率：

其中，

E

a為過表達SERPINB5的抑制率，

E

b為小分子抑制劑藥物的抑制率，

E

ab為過表達SERPINB5和小分子抑制劑藥物的聯(lián)合抑制率，當偏差值≥1.15時，表示過表達SERPINB5 與小分子藥物作用具有協(xié)同抑制效應(yīng)。平板抑制實驗每孔接種2×10個細胞，12 h后以1 μmol/L濃度的藥物(與SERPINB5過表達具有協(xié)同效應(yīng)且抑制率在前20 名的小分子抑制劑)處理5 d，對照組用1 μmol/L濃度的DMSO處理5 d，棄去藥物，甲醇固定30 min，棄去固定液，稍干燥后加入0.5%結(jié)晶紫染色10 min，用蒸餾水洗去殘余染液，拍照獲得圖像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS statistics 23.0和GraphPad Prism 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析和可視化，

t

檢驗和非參數(shù)檢驗比較組間的差異。

P

＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管鱗癌中SERPINB5 表達變化及其與臨床病理指標之間的相關(guān)性

食管鱗癌TCGA RNA 測序數(shù)據(jù)顯示，SERPINB5 mRNA表達水平與組織學(xué)分級(

P

=0.004)和疾病分期(

P

=0.037)顯著相關(guān)，且SERPINB5水平較高的患者生存期較長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)。GEO 數(shù)據(jù)集分析結(jié)果表明，與正常組織相比，SERPINB5 mRNA 在腫瘤組織中的表達明顯降低(

n

=17，

P

=0.001；圖1B)。本研究進一步利用16例配對的正常上皮組織及食管鱗癌組織進行了Western blot 檢測，結(jié)果顯示13 例食管癌組織中的SERPINB5蛋白水平顯著降低(

P

=0.000 4，圖1C)。

2.2 過表達SERPINB5 抑制食管鱗癌細胞的增殖和裸鼠成瘤

本研究首先檢測了SERPINB5 在食管鱗癌細胞系中的表達情況。結(jié)果表明，SERPINB5 在KYSE30、KYSE140、KYSE180、KYSE450和TE10中高表達，在KYSE70、KYSE150、KYSE510和TE1中表達水平較低(圖2A)。選取KYSE150 和TE1 細胞系瞬時過表達SERPINB5。結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達組His-SERPINB5 水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖2B)，且過表達SERPINB5顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖和克隆形成(圖2C 和2D)，與pcDNA3.1空載組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)。本研究還構(gòu)建了穩(wěn)定過表達SERPINB5 的KYSE150 和TE1 細胞，集落形成實驗獲得了與瞬時過表達一致的結(jié)論(圖2E和2F)。裸鼠移植瘤實驗表明，過表達SERPINB5顯著抑制了KYSE150 細胞的成瘤能力(圖2G)，與pLVX空載組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)。

2.3 SERPINB5 通過失活A(yù)KT/mTOR 通路抑制食管鱗癌細胞增殖

為了進一步探究SERPINB5 在食管鱗癌細胞中的作用機制，本研究檢測了常見的與增殖相關(guān)的分子變化。結(jié)果顯示，與親本和pcDNA3.1 空載組相比，過表達SERPINB5 后，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化水平顯著降低，表明SERPINB5 可能通過抑制AKT/mTOR 通路抑制食管鱗癌細胞的增殖(圖3)。

2.4 過表達SERPINB5 顯著增強食管鱗癌細胞對Aurora A和mTOR抑制劑的敏感性

聯(lián)合用藥是一種能夠增強藥物對腫瘤細胞殺傷能力、提高藥物療效、克服耐藥的有效策略。前面的實驗結(jié)果表明，SERPINB5 作為抑癌基因起作用，因此在提高SERPINB5 表達水平的同時進行靶向藥物處理，可能獲得更加有效的聯(lián)合抑制效果。本研究利用小分子抑制劑處理穩(wěn)定過表達SERPINB5 的KYSE150細胞，獲得了與SERPINB5 過表達具有協(xié)同抑制效應(yīng)的小分子抑制劑(圖4A)。細胞生長和克隆形成抑制實驗表明，提高SERPINB5 表達可增強KYSE150 細胞對Everolimus(mTOR 抑制劑)和 Alisertib(Aurora A)抑制劑的敏感性(圖4B 和4C)。與 SERPINB5 單獨過表達組和單獨藥物處理組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)。本研究進一步檢測了上述藥物的靶點在SERPINB5 過表達細胞中的變化，結(jié)果顯示過表達SERPINB5 后，p-mTOR 表達下調(diào)，而 p-Aurora A 表達上調(diào)(圖4D和4E)。

3 討 論

圖1 SERPINB5在食管鱗癌臨床樣本中的表達情況

SERPINB5 屬于絲氨酸蛋白酶抑制子家族成員之一，其由375 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為4.2×10，可定位于細胞質(zhì)、細胞核、囊泡、細胞表面，以及細胞外基質(zhì)中。研究表明，SERPINB5具有抑制腫瘤生長、侵襲和遷移的生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)SERPINB5 mRNA 和蛋白表達水平在食管鱗癌中均發(fā)生下調(diào)，且SERPINB5 表達與組織學(xué)分級和疾病分期顯著相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，SERPINB5 表達較高的腫瘤患者可能具有更長的總生存期，但此結(jié)論需通過更大樣本的檢測進一步驗證。

目前，SERPINB5 相關(guān)的研究大多只是表達水平的檢測及與臨床病理指標相關(guān)性的分析，對其作用及其機制研究較少。總體上，SERPINB5 在乳腺癌中的研究相對較多，有報道SERPINB5 通過促進癌細胞凋亡、抑制侵襲和血管形成而抑制乳腺腫瘤的進展。研究發(fā)現(xiàn)SERPINB5 表達降低可加速細胞周期進程，與彌漫型胃癌易感性增加相關(guān)。在直腸癌中，SERPINB5 高表達與淋巴管浸潤、同步放化療不敏感和患者預(yù)后不良相關(guān)。另外，SERPINB5可抑制雄激素受體的活性，從而增強恩雜魯胺(enzalutamide)的抗腫瘤作用。在肺癌中，有文獻報道SERPINB5通過低甲基化發(fā)揮癌蛋白作用；但另有研究表明，肺癌中SERPINB5 的高表達與放射敏感性和化療敏感性相關(guān)，其表達降低可能通過維持AKT磷酸化促進化療耐藥。本研究首次發(fā)現(xiàn)，SERPINB5過表達可通過抑制AKT和mTOR的活化，從而抑制食管鱗癌細胞的增殖和裸鼠皮下成瘤，在食管鱗癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用。

圖2 過表達SERPINB5抑制食管鱗癌細胞增殖和裸鼠成瘤

圖3 過表達SERPINB5后Western blot檢測AKT/mTOR通路蛋白的表達情況

圖4 過表達SERPINB5顯著增強食管鱗癌細胞對Aurora A和mTOR抑制劑的敏感性

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段的發(fā)展過程，其中有大量癌基因的激活和抑癌基因的失活。因此，單一藥物只能針對個別靶點或通路發(fā)揮作用，很難有效抑制腫瘤的生長與進展，且容易產(chǎn)生耐藥性。目前，聯(lián)合用藥已被廣泛地應(yīng)用于腫瘤的治療，用于取得協(xié)同療效，降低藥物劑量和毒性，并盡量減少或延遲繼發(fā)耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)一些與SERPINB5 過表達具有協(xié)同抑制效果的小分子抑制劑，其中Alisertib(Aurora A 抑制劑)和 Everolimus(mTOR 抑制劑)較為有效。另外，本研究發(fā)現(xiàn)上述兩種抑制劑對被測細胞的有效性取決于不同的分子基礎(chǔ)。Everolimus 在mTOR磷酸化水平較高的食管鱗癌細胞中有效，其與SERPINB5 通過靶向相同的mTOR 信號通路協(xié)同作用，從而抑制食管鱗癌細胞的增殖和存活。本研究的結(jié)果還提示，SERPINB5 低表達的腫瘤細胞可能具有更高的mTOR 磷酸化水平，并且可能對Everolimus 更加 敏 感 。 與 Everolimus 不 同 的 是 ， Alisertib 與SERPINB5 過表達的聯(lián)合抑制效果與Aurora A 的激活有關(guān)，這表明SERPINB5過表達可以通過激活A(yù)lisertib靶蛋白而增強低表達SERPINB5 的食管鱗癌細胞對Alisertib的敏感性。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SERPINB5 通過抑制AKT 和mTOR的活性而發(fā)揮抑癌作用；SERPINB5蛋白在食管鱗癌中表達顯著下調(diào)，可能作為食管鱗癌輔助診斷的重要指標；提高SERPINB5 的表達水平，尤其是與Aurora A 或mTOR 抑制劑的聯(lián)合使用，可望為食管鱗癌提供有效的治療策略。