張 碟，劉祥賀，霍苗苗，劉 梅，徐寧志，朱紅霞

(國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

食管癌是世界高發(fā)惡性腫瘤之一，食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌最主要的組織學(xué)類型，在發(fā)展中國(guó)家更為常見，東亞是高發(fā)地區(qū)，主要分布在中國(guó)。手術(shù)切除是食管鱗癌患者的首要治療方法，并提供了治愈的最佳機(jī)會(huì)，但由于大多數(shù)食管鱗癌患者確診時(shí)已屬晚期，伴有遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此食管癌患者的總體預(yù)后不理想，5 年生存率僅為17%左右。對(duì)于不能手術(shù)切除的食管癌患者，放射治療可以顯著提高患者生存，已經(jīng)成為一種重要的治療手段。然而食管鱗癌對(duì)放射治療的敏感性并不理想，而且對(duì)于放射的抵抗會(huì)導(dǎo)致治療失敗，因此在臨床應(yīng)用方面迫切需要提高放射敏感性的方法，了解食管癌放射抵抗的相關(guān)機(jī)制。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與其靶基因mRNA 的 3′端非翻譯區(qū)(the 3′ untranslated region，3′UTR)結(jié)合，抑制靶基因mRNA的翻譯或穩(wěn)定性，參與基因表達(dá)調(diào)控。最近的研究表明，miRNA在輻射誘導(dǎo)的基因表達(dá)、細(xì)胞信號(hào)事件和損傷反應(yīng)通路的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，miRNA已被證明可以調(diào)節(jié)輻射敏感性，可能作為評(píng)估和監(jiān)測(cè)腫瘤放射敏感性以及調(diào)節(jié)放療反應(yīng)的候選分子。近年來，許多研究報(bào)道了不同類型細(xì)胞的miRNA在放療時(shí)表達(dá)的變化，以及各種miRNA 在細(xì)胞輻射敏感性中的具體作用。MiR-195是miR-15/107家族成員，在不同類型的腫瘤中發(fā)揮促癌或者抑癌作用。MiR-195 在食管癌患者腫瘤組織中的表達(dá)顯著降低，提示miR-195可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用。然而關(guān)于miR-195-5p與食管癌關(guān)系的研究仍較少。本研究旨在探討miR-195-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑

食管鱗癌細(xì)胞系KYSE510、KYSE150 由日本Shimada Y 博士惠贈(zèng)。RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自北京細(xì)工公司，胎牛血清購(gòu)自ExCell Bio 公司，RIPA buffer、抗survivin抗體購(gòu)自CST公司，抗GAPDH抗體購(gòu)自 Proteintech 公司，BCA Protein Assay Kit 購(gòu)自Thermo Scientific 公司，Trizol 試劑及 Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen 公司，PrimeScriptRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，riboSCRIPT Reverse Transcription Kit 購(gòu)自銳博(廣州)生物技術(shù)有限公司，Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒購(gòu)自 Applied Biosystems 公司，Enlight顯色劑購(gòu)自Engreen Biosystem 公司。內(nèi)參GAPDH 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。MiR-195-5p 和 U6 的 Bulge-LoopTM RT 引物，miR-195-5p 的類似物，拮抗物及各自的陰性對(duì)照片段均由銳博(廣州)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。Cell Counting Kit-8 及Annexin V，F(xiàn)ITC 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。BeyoClickEdU-594 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Dualluciferase reporter assay system(E1960)試劑盒購(gòu)自Promega 公司。BIRC5 3′ UTR 報(bào)告基因質(zhì)粒及 pGL3陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及放射線照射

用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng) KYSE510 和KYSE150 細(xì)胞，并置于37 °C、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔1～2 d 換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為80%左右時(shí)，使用0.05%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，制成適宜濃度的單細(xì)胞懸液后接種于孔板中，待細(xì)胞貼壁后，采用X 射線(MultiRad)以源皮距SSD=100 cm，按3 Gy/min 的劑量率對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同劑量(4 或8 Gy)的照射，以未照射細(xì)胞為對(duì)照。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將KYSE510和KYSE150細(xì)胞按3×10個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 更換不含抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，采用Invitrogen 公司的Lipofectamine3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書進(jìn)行。分別將4 μL 20 μmol/L 的miR-195-5p類似物、miR-195-5p拮抗物或陰性對(duì)照片段加入120 μL Opti-MEM中稀釋混勻，室溫靜置5 min，同時(shí)用120 μL 的Opti-MEM稀釋4 μL轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000，然后分別將稀釋后的miR-195-5p 類似物、拮抗物或陰性對(duì)照片段加入到稀釋后的Lipofectamine3000 試劑中輕輕吹打混勻，室溫靜置15 min，最后逐滴均勻加入到孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組

研究RNA 表達(dá)水平時(shí)，對(duì)KYSE510 和KYSE150細(xì)胞進(jìn)行8 Gy 的X 射線照射，另以未照射細(xì)胞為對(duì)照，于照射后24 h 檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-195-5p 的表達(dá)水平；將轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物、拮抗物或相應(yīng)陰性對(duì)照片段的KYSE510 細(xì)胞用8 Gy 的X 射線照射，于照射后24 h 檢測(cè)各組細(xì)胞中survivin mRNA 的表達(dá)水平。

研究蛋白表達(dá)水平時(shí)，對(duì)KYSE510和KYSE150細(xì)胞進(jìn)行8 Gy 的X 射線照射，另以未照射細(xì)胞為對(duì)照，于照射后不同時(shí)間(1、6、12、24 和72 h)檢測(cè)兩組細(xì)胞中survivin 蛋白的表達(dá)變化；將轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物、拮抗物或相應(yīng)陰性對(duì)照片段的KYSE510 和KYSE150 細(xì)胞用8 Gy 的X 射線照射，于照射后24 h檢測(cè)各組細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)水平。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況

將KYSE510 或KYSE150 細(xì)胞分別接種于96 孔板中，每孔1 000個(gè)，置于37 ℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，分別用4 Gy 或8 Gy 的X 射線照射細(xì)胞，以未照射細(xì)胞為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吸去培養(yǎng)液，加入CCK-8 溶液，用酶標(biāo)儀分別在照射后1～4 d每天檢測(cè)1次在450 nm處的吸光度值

D

(450)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞miR-195-5p 和survivin mRNA表達(dá)水平

用Trizol 裂解法提取各組細(xì)胞總RNA，對(duì)于mRNA使用PrimeScriptRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，對(duì)于miRNA 使用riboSCRIPT Reverse Transcription Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。定量PCR 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix 按照 20 μL 體系(10 μL Mix、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、1 μL cDNA 和 7 μL HO)加樣。以 GAPDH 作為 mRNA的內(nèi)參基因，以U6作為miRNA的內(nèi)參基因。qPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。用 2法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。mRNA 引物由生工公司合成，其序列如下：survivin，正向引物5′-AGGACCA CCGCATCTCTACAT-3′，反向引物 5′-AAGTCTGGCT CGTTCTCAGTG-3′；GAPDH，正向引物5′-GTGAAG GTCGGAGTCAACGG-3′，反向引物 5′-CTCCTGGAA GATGGTGATGGG-3′。

1.7 Western blot檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)水平

用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量，電泳分離后運(yùn)用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC 膜上。用抗survivin 抗體(1∶1 000 稀釋)4 ℃孵育過夜，顯色后使用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。

1.8 Incucyte實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞監(jiān)測(cè)

將轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物、拮抗物或陰性對(duì)照片段24 h 后的KYSE510 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔4 000個(gè)，24 h后用8 Gy的X射線照射細(xì)胞，另設(shè)未照射細(xì)胞為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用Incucyte S3監(jiān)測(cè)細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)，每3 h 記錄一次細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。用細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度衡量細(xì)胞數(shù)量，匯合度低表示細(xì)胞數(shù)量少，而匯合度高則代表細(xì)胞數(shù)量多。

1.9 EdU摻入實(shí)驗(yàn)

將KYSE510 細(xì)胞按 3×10個(gè)/孔接種于 6 孔板中培養(yǎng)24 h，分別轉(zhuǎn)染miR-195-5p 的類似物和陰性對(duì)照片段，24 h 后將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以每孔2 000 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中培養(yǎng)24 h 后，用8 Gy 的X 射線照射細(xì)胞，另設(shè)未照射細(xì)胞為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞5 d后，使用BeyoClickEdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒染色。用高內(nèi)涵篩選儀器(Operetta)進(jìn)行熒光檢測(cè)。EdU陽(yáng)性細(xì)胞/Hoechst 陽(yáng)性細(xì)胞比例代表細(xì)胞的增殖能力，比值大代表增殖能力強(qiáng)，比值小代表增殖能力弱。

1.10 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物、拮抗物或相應(yīng)對(duì)照片段24 h 后的KYSE510 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔500個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用4 Gy X射線照射，另設(shè)未照射細(xì)胞為對(duì)照，孵育14 d后，固定染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

對(duì)轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物或陰性對(duì)照片段24 h后的KYSE510 細(xì)胞用8 Gy 的X 射線照射，另設(shè)未照射細(xì)胞為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)7 d 后用凋亡檢測(cè)試劑盒標(biāo)記Annexin V-FITC 和碘化丙錠(PI)，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，將Annexin V-FITCPI和Annexin V-FITCPI兩個(gè)象限的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例相加，即為細(xì)胞凋亡率。

1.12 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將KYSE150 細(xì)胞接種于24 孔板中，每孔80 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用Lipofectamine3000瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染20 pmol miR-195-5p 類似物或陰性對(duì)照片段，以及 200 ng BIRC5 3′ UTR 報(bào)告基因質(zhì)?；?pGL3 陰性對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用8 Gy的X射線照射，另設(shè)未照射細(xì)胞為對(duì)照，48 h 后裂解細(xì)胞，根據(jù)說明書，采用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)測(cè)定熒光素酶活性。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 7 軟件，照射組、未照射組；miR-195-5p 類似物組、拮抗物組及陰性對(duì)照組細(xì)胞間各種指標(biāo)差異的比較，采用

t

檢驗(yàn)(Student's

t

test)，以

P

＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 X 射線照射后食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及miR-195-5p和survivin蛋白的表達(dá)

食管鱗癌細(xì)胞KYSE510 和KYSE150 經(jīng)4 和8 Gy的X射線照射后，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖1，兩株細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到明顯抑制。

圖1 CCK-8法檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞接受X射線照射后的生長(zhǎng)情況

KYSE510 和 KYSE150 細(xì)胞經(jīng)過 8 Gy X 射線照射后24 h，qPCR檢測(cè)miR-196-5p的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2，與未照射組細(xì)胞相比，兩株照射組細(xì)胞中miR-195-5p的表達(dá)水平顯著均下降(

P

＜0.05或0.01)。

圖2 qPCR檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞接受8 Gy X射線照射后miR-195-5p的表達(dá)水平

KYSE510 和 KYSE150 細(xì)胞經(jīng)過 8 Gy X 射線照射后 1、6、12、24、72 h，Western blot 檢測(cè) survivin 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見圖3，顯示KYSE510 細(xì)胞在照射后12、24、72 h，KYSE150 細(xì)胞在照射后24 h，survivin 蛋白的表達(dá)水平均高于未照射組細(xì)胞(均為

P

＜0.01)。

2.2 MiR-195-5p影響食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性

Incucyte實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞監(jiān)測(cè)結(jié)果見圖4，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物組的KYSE510細(xì)胞增殖速度減慢；經(jīng)8 Gy X 射線照射后，轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組細(xì)胞增殖速度顯著降低。計(jì)算同一時(shí)間點(diǎn)相同處理的照射組細(xì)胞匯合度與未照射組細(xì)胞匯合度的比值，可表示細(xì)胞經(jīng)X射線照射后的相對(duì)存活率(圖4B)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物組KYSE510細(xì)胞的相對(duì)存活率較陰性對(duì)照組顯著降低。

EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，顯示經(jīng)8 Gy X射線照射后轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物組KYSE510 細(xì)胞EdU 陽(yáng)性率低于類似物對(duì)照組(

P

＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-195-5p拮抗物組KYSE510細(xì)胞EdU陽(yáng)性率顯著高于拮抗物對(duì)照組(

P

＜0.01)。

圖3 Western blot檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞接受8 Gy X射線照射后survivin蛋白的表達(dá)情況

圖4 轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組KYSE510細(xì)胞經(jīng)X射線照射后的增殖和存活情況

圖5 經(jīng)X射線照射后轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組、拮抗物組KYSE510細(xì)胞的增殖情況

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，顯示轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組KYSE510 細(xì)胞經(jīng)4 Gy X 射線照射后的克隆形成率顯著低于類似物對(duì)照組(

P

＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-195-5p拮抗物組KYSE510細(xì)胞經(jīng)X射線照射后的克隆存活率則高于拮抗物對(duì)照組(

P

＜0.01)。

圖6 經(jīng)X射線照射后轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組、拮抗物組細(xì)胞的克隆形成能力

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖7，顯示經(jīng)8 Gy X射線照射后轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物組KYSE510 細(xì)胞的凋亡率較陰性對(duì)照組顯著升高(

P

＜0.01)。

圖7 經(jīng)X射線照射后轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組細(xì)胞的凋亡情況

2.3 MiR-195-5p靶向調(diào)控survivin蛋白的表達(dá)

通過TargetScan Human 網(wǎng)站預(yù)測(cè)人BIRC5 3′UTR 的 95～101 nt 為 miR-195-5p 的假定結(jié)合位點(diǎn)(圖8A)， 在 TCGA 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 ， miR-195-5p 與 survivin mRNA 的表達(dá)水平在食管癌中呈負(fù)相關(guān)(

P

＜0.01，圖8B)。qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示X 射線照射后24 h，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-195-5p 類似物組KYSE510 細(xì)胞中survivin mRNA 表達(dá)水平顯著下降(

P

＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-195-5p 拮抗物組的KYSE510 細(xì)胞中survivin mRNA 水平顯著升高(

P

＜0.05，圖 8C)。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與相應(yīng)的對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組KYSE510 和KYSE150 細(xì)胞在接受8 Gy X 射線照射后24 h，survivin 的表達(dá)受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-195-5p 拮抗物組細(xì)胞經(jīng)照射后則會(huì)促進(jìn)survivin的表達(dá)(圖8D)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在KYSE150 細(xì)胞中過表達(dá)miR-195-5p 能夠抑制BIRC5 3′ UTR的熒光素酶活性(

P

＜0.01，圖8E)。以上結(jié)果表明，在食管鱗癌細(xì)胞中，miR-195-5p能夠靶向抑制survivin的表達(dá)。

3 討 論

放射抵抗被認(rèn)為是放療后局部失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因，有證據(jù)表明，miRNAs 調(diào)節(jié)介導(dǎo)輻射反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)通路，有可能作為新的治療策略的開發(fā)目標(biāo)來克服腫瘤的輻射抗性。越來越多的證據(jù)表明miRNAs 可以影響細(xì)胞對(duì)輻射的反應(yīng)。Lv 等研究證明輻射可通過上調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，誘導(dǎo)己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)高表達(dá)及糖酵解增強(qiáng)，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的放射抵抗。Chen 等研究表明miR-18a-5p 可通過下調(diào)ATM 和HIF-1α的表達(dá)，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞和CD133干細(xì)胞的放射敏感性。然而miRNA關(guān)于食管癌放射敏感性的研究還比較少。

圖8 食管鱗癌細(xì)胞中miR-195-5p靶向調(diào)控survivin的表達(dá)

MicroRNA 可以作為癌基因或抑癌基因，通過靶向腫瘤相關(guān)基因在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-195 在多種惡性腫瘤中的表達(dá)均下調(diào)，包括乳腺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌和腎上腺皮質(zhì)癌等。MiR-195在肺癌中表達(dá)明顯下調(diào)，miR-195的異位表達(dá)能顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并且在裸鼠異種移植模型中miR-195也可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。很多研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管組織相比，miR-195 在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，并且過表達(dá)miR-195-5p 可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞接受放射線照射后miR-195的表達(dá)水平明顯降低，過表達(dá)miR-195可通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡來增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的放射敏感性。本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞接受放射線照射后miR-195-5p 的表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)染miR-195-5p類似物組的細(xì)胞存活率較陰性對(duì)照組顯著降低(

P

＜0.01)，凋亡率較陰性對(duì)照組顯著升高(

P

＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-195-5p 拮抗物組的細(xì)胞存活率較陰性對(duì)照組升高(

P

＜0.01)，表明過表達(dá)miR-195-5p 能通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡來增強(qiáng)食管鱗癌的放射敏感性。本研究結(jié)果證明miR-195-5p 也可通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，miRNAs 調(diào)控著人類基因組中大約30%基因的表達(dá)。miRNA 與多種生物學(xué)功能和病理過程密切相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自我更新。為探討放射線照射抑制miR-195-5p導(dǎo)致放射拮抗的分子機(jī)制，需要進(jìn)一步尋找miR-195-5p所調(diào)控的基因。Itesako等的研究首次證明survivin可能受膀胱癌細(xì)胞中miR-195/497 簇的調(diào)控，Yu 等的研究證明miR-195可直接靶向survivin誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的凋亡和衰老。本研究的分析提示TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-195-5p 與BIRC5 mRNA 表達(dá)水平在食管癌中呈負(fù)相關(guān)，并且在BIRC5 3′ UTR中有miR-195-5p的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞接受放射線照射后，miR-195-5p 表達(dá)下降，而survivin 的蛋白表達(dá)水平顯著升高。過表達(dá)miR-195-5p 可以抑制survivin 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，抑制miR-195-5p則survivin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高。在基因轉(zhuǎn)錄水平過表達(dá)miR-195-5p能夠抑制BIRC5 3′ UTR的熒光素酶活性(

P

＜0.05)，而在細(xì)胞經(jīng)受X射線照射后這一抑制作用會(huì)顯著增強(qiáng)(

P

＜0.01)。這些結(jié)果證明放射線照射抑制miR-195-5p 表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致survivin 的表達(dá)升高。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，在包括鱗癌在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤中均過表達(dá)，這與不良預(yù)后、侵襲性腫瘤行為、耐藥和高腫瘤復(fù)發(fā)率相關(guān)。Survivin能拮抗凋亡，促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管生成，并對(duì)各種抗癌療法起到抵抗因子的作用，是腫瘤發(fā)病和復(fù)發(fā)的診斷生物標(biāo)記物，也是癌癥藥物的有效靶點(diǎn)。因此，miR-195-5p 表達(dá)降低導(dǎo)致的survivin 表達(dá)升高可能是食管鱗癌放射抵抗的原因之一。

本研究在細(xì)胞水平證實(shí)了在食管鱗癌細(xì)胞中放射線照射可以通過抑制miR-195-5p 增強(qiáng)survivin 的表達(dá)，過表達(dá)miR-195-5p 可以通過靶向抑制survivin，降低細(xì)胞存活率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性，這首次證明了miR-195-5p 在食管鱗癌放射治療中的作用，并為miRNAs 在放射抵抗中的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究miR-195-5p 在食管鱗癌放射敏感性中的作用奠定了基礎(chǔ)。在接下來的工作中可以繼續(xù)深入研究miR-195-5p 與食管鱗癌放射治療的相互作用及機(jī)制，通過局部注射給藥方式，使用miRNA 激動(dòng)劑(agomir)在動(dòng)物體內(nèi)模擬高表達(dá)miRNA，進(jìn)一步探索miR-195-5p作為預(yù)測(cè)食管鱗癌患者放療應(yīng)答和預(yù)后的潛在標(biāo)志的可能，通過靶向干預(yù)miR-195-5p 的表達(dá)降低食管鱗癌患者的輻射抵抗，為食管鱗癌患者的靶向治療提供新的思路。