劉亞楠 劉潔 魏上 李亞琳 李明 肖俊 邱高峰 陸穎

摘要：【目的】探究克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體內(nèi)和群體間的遺傳多樣性，為引種和群體間雜交以改善養(yǎng)殖群體種質(zhì)提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳院?、江西、安徽、浙江和江蘇5省克氏原螯蝦主產(chǎn)地14個(gè)養(yǎng)殖群體的120個(gè)個(gè)體為研究對(duì)象，采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)——特定區(qū)點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序技術(shù)（SLAF-seq）進(jìn)行基因組測(cè)序，獲得基因組SNP基因型數(shù)據(jù)，構(gòu)建群體系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)、主成分和遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】共鑒定出741147個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，群體系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，14個(gè)群體的種源主要來(lái)自浙江金華和江蘇宿遷，然后再向各地引種遷徙。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相吻合。主成分分析結(jié)果揭示了安徽長(zhǎng)豐和滁州群體、湖北荊州龍口及和平2個(gè)群體，以及浙江東陽(yáng)群體等5個(gè)群體與其他群體間存在相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，是雜交引種的潛在種源。群體遺傳多樣性分析顯示，14個(gè)群體的Ho介于0.2171～0.2801，平均值為 0.2476，He介于0.3424～0.3598，平均值為0.3534，PIC介于0.2750～0.2878，群體間相差不大，接近0.25，各群體均接近遺傳多樣性中等水平的下限?！窘Y(jié)論】14個(gè)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體內(nèi)的遺傳多樣性較低，群體間的親緣關(guān)系較接近，品種單一、長(zhǎng)期內(nèi)交跡象明顯。通過(guò)群體的基因組重測(cè)序，能以較低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的定期監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞： 克氏原螯蝦;SLAF-seq;SNP;遺傳多樣性;群體遺傳學(xué)

中圖分類號(hào)： S932? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3265-09

Analysis of genetic diversity among the farmed Procambarus clarkii populations using the SLAF-seq technology

LIU Ya-nan1，2， LIU Jie1，2， WEI Shang1，2， LI Ya-lin1，2， LI Ming3，

XIAO Jun4， QIU Gao-feng1，2， LU Ying1，2*

（1Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of Education，Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China; 2International Research Center for Marine Bioscience，Ministry of Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China; 3Aquatic Products Technology Extension

Station of Jinhua City， Jinhua， Zhejiang? 321017， China; 4Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi

Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】This study was designed to investigate the intra-group and inter-group genetic diversity of farmed Procambarus clarkii populations，and to provide fundamental data bases for improving the germplasm of breeding groups through required introduction and crossbreeding. 【Method】A total of 120 individuals of 14 farmed populations collected in Hubei， Jiangxi， Anhui， Zhejiang and Jiangsu were sequenced with a Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing （SLAF-seq） technology， one of the restriction site-associated DNA sequencing technologies. The single nucleotide polymorphisms （SNPs） were identified to conduct the analyzation of phylogeny， population structure， principal component and genetic diversity. 【Result】According to the identified 741147 SNPs in this study， the phylogenic analysis suggested that the 14 populations originated from two main origins， Jinhua and Suqian. Then they were introduced and migrated to different places. The results of the population structure analysis agreed with the phylogenetic analysis. The principal component analysis revealed that the five populations， including Changfeng （Anhui）， Chuzhou （Anhui）， Longkou， Jingzhou （Hubei）， Heping， Jingzhou （Hubei） and Dongyang （Zhejiang） had relatively distant genetic relationships to the others， which might be the potential provenances for the future hybridization. The estimated genetic diversity of the 14 populations exhibited that Ho ranged from 0.2171 to 0.2801 with a mean of 0.2476， He from 0.3424 to 0.3598 with a mean of 0.3534 and PIC from 0.2750 to 0.2878， the difference among populations was small， especially for the PIC all close to 0.25. Each population approached the lower limit of intermediate levels of genetic diversity. 【Conclusion】Comparison of sequence variations reveals a considerably low genetic diversity within and among the 14 farmed P. clarkii populations. The kinship between groups is close， with obvious signs of single breed and long-term crossing. As a low-cost and effective approach，the SLAF-seq sequencing should be suited to regularly monitor the genetic diversity of the farmed populations.

Key words： Procambarus clarkii; SLAF-seq; SNP; genetic diversity; population genetics

Foundation item： National Key Research and Development Program of “Blue Granary Science and Technology Innovation”（2018YFD0900101）;Zhejiang One Million Project of Rice-fishery Integrated Planting and Raising（zjjhdy20200701）;Guangxi Natural Science Foundation（2016GXNSFFA380002）

0 引言

【研究意義】克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，屬甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）鰲蝦科（Cabaridae）（劉其根等，2008），原產(chǎn)于北美洲墨西哥。克氏原螯蝦具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，不僅對(duì)生長(zhǎng)水質(zhì)要求較低，甚至可以存活于高污染性的水體中。此外，其廣譜的雜食性使之還能有效清除魚(yú)類排泄物，對(duì)水體清潔有重要意義。近年來(lái)螯蝦種群已迅速蔓延到東亞、歐洲和北非尼羅河流域（宋光同等，2018;Yi et al.，2018;徐濱等，2019）。克氏原螯蝦約在20世紀(jì)30年代末由日本傳入我國(guó)（張愛(ài)軍和沈繼紅，2005），現(xiàn)已在我國(guó)廣泛分布。鰲蝦被作為水產(chǎn)資源物種以來(lái)，其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖面積也越來(lái)越大，已成為一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種（嚴(yán)維輝等，2019）。但近年來(lái)，克氏原螯蝦的養(yǎng)殖面臨個(gè)體變小、疫病多發(fā)、種質(zhì)退化等問(wèn)題，已對(duì)其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成明顯影響。因此，了解不同養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性信息和親緣關(guān)系，為種間交流、品種優(yōu)化提供參考依據(jù)，對(duì)克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為明確克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳信息，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要采用微衛(wèi)星序列的測(cè)序和分析。Barbaresi等（2003，2007）對(duì)歐洲5個(gè)種群的遺傳變異分析表明引種種群來(lái)自葡萄牙、法國(guó)和意大利等地區(qū)，通過(guò)分析西歐12個(gè)克氏原螯蝦群體中5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)其傳播可能涉及遠(yuǎn)距離跳躍擴(kuò)散和微觀地理范圍內(nèi)的自然擴(kuò)散。王長(zhǎng)忠等（2009）運(yùn)用微衛(wèi)星序列分析長(zhǎng)江下游4個(gè)種群的遺傳多樣性，結(jié)果表明隨著克氏原螯蝦群體在長(zhǎng)江流域的自然擴(kuò)散和人為遷移，其遺傳多樣性出現(xiàn)不同程度的降低。曹玲亮等（2010）開(kāi)展了安徽水系中克氏原螯蝦種群的遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)種群的遺傳多樣性水平和雜合度相對(duì)較高，水系間的交流是種群擴(kuò)散的重要途徑。彭剛等（2010）根據(jù)7對(duì)微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，比較了3個(gè)克氏原螯蝦野生和養(yǎng)殖群體間的遺傳多樣性，得出長(zhǎng)江流域野生群體之間具有較高遺傳多樣性的結(jié)論。邢智珺等（2014）利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)江蘇省8個(gè)地區(qū)克氏原螯蝦的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)群體存在中等程度的分化。黃小芳等（2020）利用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)克氏原螯蝦群體基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，分析其遺傳多樣性，數(shù)據(jù)顯示各群體間存在廣泛的基因交流，僅存在低度至中度的遺傳分化。Zhong等（2020）利用線粒體DNA和微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)廣西5個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明遺傳變異是由種群內(nèi)因素決定的，廣西南部的群體遺傳多樣性較低，應(yīng)對(duì)其種質(zhì)資源進(jìn)行改良。從現(xiàn)有研究來(lái)看，普遍存在著不足之處，如調(diào)查取樣的樣品種群數(shù)量較少，樣品地理分布代表性不足;微衛(wèi)星方法研究所能獲得的有效分子標(biāo)記數(shù)量太少，結(jié)果的可靠性低;很少使用第二代高通量基因組測(cè)序技術(shù)和方法等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)研究極少涉及克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析。此外，克氏原螯蝦基因組具有高度復(fù)雜性，有94對(duì)染色體（張莎等，2018），基因組大小近3.5 Gb，參考基因組序列尚未發(fā)表。因此，采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)——特定區(qū)點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序技術(shù)（Specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）（Sun et al.，2013）對(duì)其開(kāi)展遺傳多樣性分析十分必要。該技術(shù)通過(guò)在基因組酶切測(cè)序后獲得的大量序列標(biāo)簽上獲得的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)分析，能在較低測(cè)序成本下對(duì)群體遺傳多樣性實(shí)現(xiàn)無(wú)參分析（不依賴參考基因組的序列分析）。由于SNP的數(shù)量大，分辯率高，能適用于遺傳差異較小的養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用基因組測(cè)序的方法對(duì)分布于湖北、江西、安徽、浙江和江蘇5省的14個(gè)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行測(cè)序，獲得比以往研究更豐富的基因組多態(tài)性序列標(biāo)簽，以分析養(yǎng)殖群體間的遺傳多樣性，為判斷和指導(dǎo)克氏原螯蝦養(yǎng)殖過(guò)程中是否需要進(jìn)行及時(shí)引種或群體間雜交提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品收集和基因組DNA提取

2020年5—6月采集來(lái)自浙江、安徽、湖北、江西和江蘇5省的14個(gè)養(yǎng)殖群體（圖1和表1），每個(gè)養(yǎng)殖群體選取8～10個(gè)個(gè)體的肌肉組織，共120份樣品，利用液氮速凍后，采用CTAB法提取基因組DNA（閆苗苗等，2008），用Agilent 5400檢測(cè)DNA濃度。

1. 2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和標(biāo)簽SNP鑒定

預(yù)酶切實(shí)驗(yàn)后，選擇限制性內(nèi)切酶切HaeIII對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，將酶切得到的片段，即長(zhǎng)度約400 bp的SLAF標(biāo)簽，按照測(cè)序的流程構(gòu)建Paire-dend測(cè)序文庫(kù)，使用HiSeq XTen測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，獲得雙向長(zhǎng)度各為150 bp的原始序列。原始序列經(jīng)過(guò)去除接頭和質(zhì)量評(píng)估后的干凈序列（Clean reads），按序列相似性進(jìn)行聚類，來(lái)源于同一個(gè)SLAF標(biāo)簽被聚類到一起。鑒定SNP時(shí)，每個(gè)SLAF標(biāo)簽中測(cè)序深度最高的序列類型作為參考序列，使用BWA（Li and Durbin，2009）將Clean reads比對(duì)到對(duì)應(yīng)參考序列上，使用GATK（Mckenna et al.，2010）和Samtools（Li et al.，2009）工具，默認(rèn)參數(shù)下，鑒定出SNP。

1. 3 群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析

鑒定后的SNP，使用MEGA X（Kumar et al.，2018），基于鄰接法（Neighbor-joining），采用Kimura 2-parameter模型（Davidson and Campo，2020），Bootstrap重復(fù)1000次，構(gòu)建樣品的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)?；赟NP，使用EIGENSOFT（Price et al.，2006）進(jìn)行主成分分析（PCA）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC），并使用Stacks v1.42計(jì)算群體觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）等遺傳多樣性指數(shù)。使用ADMIXTURE（Alexander et al.，2009）分析群體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行聚類，最后根據(jù)最低交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率（CV error）值來(lái)判斷最優(yōu)分群數(shù)。PIC按Botstein等（1980）的公式計(jì)算：

PIC=1-（[i=1nPi2]）-[i=1n-1j=i+1n2Pi2]Pj?

式中，Pi和Pj分別為第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率，n為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 群體系統(tǒng)進(jìn)化分析

由表1可知，用于測(cè)序的14個(gè)養(yǎng)殖群體共120個(gè)個(gè)體涵蓋了長(zhǎng)江中游、下游和錢塘江等水系。對(duì)120個(gè)個(gè)體樣品進(jìn)行SLAF測(cè)序后，共得到191.2 M初始Reads。序列經(jīng)過(guò)聚類后，獲得超過(guò)35萬(wàn)個(gè)SLAF標(biāo)簽，每個(gè)標(biāo)簽的平均測(cè)序深度約為12.5 x。對(duì)群體中存在多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽進(jìn)行分析后，鑒定出741147個(gè)SNP位點(diǎn)，個(gè)體平均SNP數(shù)量在208803～284126，即使是擁有SNP數(shù)量最少的個(gè)體也攜帶16萬(wàn)以上的SNP。如此數(shù)量巨大的SNP為后續(xù)準(zhǔn)確的群體遺傳學(xué)分析打下了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)換和顛換是SNP的主要類型，對(duì)這些SNP的轉(zhuǎn)換與顛換信息進(jìn)行詳細(xì)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表2）顯示，在克氏原鰲蝦各養(yǎng)殖群體中，轉(zhuǎn)換與顛換的比例在1.4∶1左右，高于完全隨機(jī)情形下的1∶2。同大多數(shù)后生動(dòng)物相似，存在轉(zhuǎn)換——顛換的偏差（Seplyarskiy et al.，2012）。通常，在密碼子中發(fā)生的顛換更易導(dǎo)致氨基酸的改變，且轉(zhuǎn)換比起顛換更容易，因此這在進(jìn)化上是合理的。

利用這些SNP，構(gòu)建120個(gè)克氏原螯蝦個(gè)體的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示樣本在遺傳上主要聚成2個(gè)簇（clade）：一支由浙江金華的義烏和蘭溪群體與浙江嘉興的海鹽和南湖2個(gè)群體構(gòu)成;另一支由浙江金華東陽(yáng)的群體和其余4省的其他群體構(gòu)成。由個(gè)體在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上的分布可看出，浙江義烏、江西鷹潭、湖北洪湖和平及龍口、安徽滁州、安徽合肥長(zhǎng)豐和江蘇常州等養(yǎng)殖點(diǎn)的個(gè)體幾乎均單獨(dú)聚集在一起，說(shuō)明這些養(yǎng)殖點(diǎn)品種較單一，幾乎沒(méi)有與其他養(yǎng)殖點(diǎn)間進(jìn)行過(guò)雜交。而如浙江金華蘭溪、浙江嘉興海鹽和南湖、安徽安慶、江西上饒等群體，個(gè)體的分布與其他養(yǎng)殖點(diǎn)的個(gè)體有較明顯的混雜，表明該養(yǎng)殖點(diǎn)品種與其他養(yǎng)殖點(diǎn)品種間交流較多。系統(tǒng)進(jìn)化分析揭示某些在地理分布上有較遠(yuǎn)距離的群體卻顯示出較近的親緣關(guān)系，如浙江金華東陽(yáng)與湖北荊州的2個(gè)群體，江蘇常州與江西上饒、安徽安慶的3個(gè)群體間在進(jìn)化關(guān)系上較接近。

根據(jù)所有樣品的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，可大致預(yù)測(cè)出克氏原螯蝦養(yǎng)殖種群的遷徙過(guò)程（圖3）。由圖3可看出，取樣點(diǎn)的克氏原螯蝦最初可能來(lái)自兩個(gè)祖先群體，在這些養(yǎng)殖點(diǎn)中，目前能回溯到與這兩個(gè)祖先親緣關(guān)系最近的養(yǎng)殖點(diǎn)，一個(gè)是浙江義烏或蘭溪，另一個(gè)是江蘇宿遷。然后再由這兩個(gè)地方，分別向各地引種遷徙。第一條線路，從浙江義烏/蘭溪到嘉興海鹽再到嘉興南湖，但隨后這幾個(gè)地方的養(yǎng)殖群體不斷交流。第二條線路較復(fù)雜，從江蘇宿遷開(kāi)始即分成兩支：一支先到江西鷹潭，再到浙江東陽(yáng)，最后到湖北荊州的龍口和和平;另一支先到安徽安慶，隨后又分成三支，分別遷移至滁州、長(zhǎng)豐至上饒，其中上饒的那支再到達(dá)常州。此外，浙江金華東陽(yáng)的群體源自江蘇宿遷，與金華的另兩個(gè)群體不同。

2. 2 群體結(jié)構(gòu)分析

基于群體的SNP位點(diǎn)，通過(guò)ADMIXTURE（Ale-xander et al.，2009）對(duì)克氏原螯蝦群體的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖4）。從圖4可看出，當(dāng)K=2時(shí)，對(duì)應(yīng)的CV error值最低，表明14個(gè)群體可能來(lái)源于兩個(gè)祖先，該結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果吻合。另外，K=3時(shí)CV error值也較低，且與K=2時(shí)的CV error值很接近。而在系統(tǒng)進(jìn)化分析中，浙江金華義烏和浙江金華蘭溪的群體親緣關(guān)系很近，很難區(qū)分哪個(gè)更接近祖先種，因此在一定程度上，較難區(qū)分所有群體是雙起源的還是三起源的，與群體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)。由于金華義烏與蘭溪的地理距離很近，可能本身就來(lái)自同一個(gè)群體。所以，更傾向于這些種群最初來(lái)自于兩個(gè)種源群體。

2. 3 群體主成分分析

為進(jìn)一步明確群體間親緣關(guān)系，利用741147個(gè)SNP位點(diǎn)通過(guò)EIGENSOFT進(jìn)行PCA分析（圖5）。從三維聚類后的情況看出（第一、二、三主成分分別為PC1、PC2和PC3），安徽長(zhǎng)豐和滁州群體親緣關(guān)系較近，聚集成1個(gè)簇（Cluster）;湖北荊州洪湖的2個(gè)群體及浙江東陽(yáng)的群體，分別聚集成3個(gè)獨(dú)立的簇。這4個(gè)簇都游離于由剩下的9個(gè)群體形成的主簇（Main cluster）之外。在主簇中，江蘇常州和浙江金華蘭溪群體的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果相似。PCA分析結(jié)果表明：湖北的2個(gè)群體，安徽的長(zhǎng)豐和滁州及浙江東陽(yáng)與其他群體間存在相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

2. 4 群體遺傳多樣性分析

為評(píng)估群體的遺傳多樣性，通過(guò)計(jì)算Ho、He和PIC等參數(shù)來(lái)考察各個(gè)群體的遺傳變異程度，是遺傳資源保護(hù)的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容（Talebi et al.，2008），常用來(lái)表示群體遺傳多樣性情況（Pan et al.，2016）。從基于SNP位點(diǎn)計(jì)算得到14個(gè)群體的Ho、He和PIC數(shù)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖6）來(lái)看，Ho介于0.2171～0.2801，平均值為0.2476，He介于0.3424～0.3598，平均值為0.3534。其中，浙江嘉興南湖群體的He最高，但Ho最低，表明這個(gè)群體經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)交，遺傳多樣性較低。14個(gè)群體的PIC均處于0.2750～0.2878，群體間相差不大，接近0.25，表明這14個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳變異，雖然還居于中等水平（劉楚吾等，2010），但已非常接近中等水平的下限。從14個(gè)群體的He和PIC來(lái)看，浙江群體的遺傳多樣性大多較低，可能會(huì)面臨更多的種質(zhì)退化風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)PCA分析結(jié)果和遺傳多樣性分析結(jié)果，當(dāng)浙江群體需要進(jìn)行引種時(shí)，可選擇遺傳多樣性相對(duì)較高及單獨(dú)成簇的安徽長(zhǎng)豐和滁州的群體。

3 討論

與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星等分子標(biāo)記相比，通過(guò)鑒定SNP檢測(cè)遺傳多樣性，不再以DNA長(zhǎng)度差異作為檢測(cè)手段，而是直接通過(guò)檢測(cè)序列變化，是更加高效的遺傳標(biāo)記，在大多數(shù)基因組中，這是最豐富和穩(wěn)定的遺傳變異形式（Liu et al.，2012）。對(duì)于缺少參考基因組的物種，特別是基因組復(fù)雜的物種來(lái)說(shuō)，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)不僅節(jié)省費(fèi)用，測(cè)序分析周期短，而且獲得的大量多態(tài)性位點(diǎn)分析結(jié)果較接近深度全基因組測(cè)序結(jié)果（胡亞亞等，2018）。以往的克氏原螯蝦群體遺傳多樣性研究中，多采用SSR標(biāo)記和ISSR標(biāo)記，利用的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)很少，而且這些方法適用于個(gè)體差異較顯著的野生群體，不適用于個(gè)體差異較小的養(yǎng)殖群體?？耸显r作為一種重要的水產(chǎn)物種，人工養(yǎng)殖規(guī)模大，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性檢測(cè)直接與生長(zhǎng)實(shí)踐相關(guān)聯(lián)，定期監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖群體對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展極為重要。

定期檢測(cè)養(yǎng)殖群體的生物多樣性，有助于及時(shí)采取措施，降低種質(zhì)退化風(fēng)險(xiǎn)。與國(guó)內(nèi)其他重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種如中華絨螯蟹、中國(guó)對(duì)蝦等相比（劉萍等，2004;馬海濤等，2007），克氏原螯蝦的遺傳多樣性相對(duì)偏低。過(guò)去對(duì)克氏原螯蝦的研究主要關(guān)注生態(tài)和引種種源方面，對(duì)克氏原鰲蝦遺傳多樣性的檢測(cè)方法研究較少。定期檢測(cè)養(yǎng)殖群體中遺傳多樣性水平，并適時(shí)引種是解決克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)面臨的種質(zhì)退化問(wèn)題的有效措施。本研究以湖北、江西、安徽、浙江和江蘇5省的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體為研究對(duì)象，通過(guò)SLAF測(cè)序，利用獲得的741147個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14個(gè)群體的PIC在0.2750～0.2878，與其他利用微衛(wèi)星標(biāo)記的研究結(jié)果相比相對(duì)較低。相比于以往利用微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估的報(bào)告結(jié)果（譚云飛等，2020），本研究計(jì)算所得的PIC值較低，推測(cè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性已明顯低于野生群體，與此前報(bào)道關(guān)于克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的數(shù)據(jù)出入較大的原因可能是所選養(yǎng)殖場(chǎng)封閉式養(yǎng)殖時(shí)間較長(zhǎng)，與其他養(yǎng)殖點(diǎn)間的交流過(guò)少，近親繁殖嚴(yán)重。當(dāng)然，雜交親本的選擇還需要更多更細(xì)致的遺傳差異數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

此外，群體的聚類分析結(jié)果表明，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并沒(méi)有按照長(zhǎng)江中游、中下游和錢塘江等水系的地理位置劃分，說(shuō)明養(yǎng)殖群體的遷移可能是人為引種或養(yǎng)殖的結(jié)果。與預(yù)測(cè)的群體遷移結(jié)果相似的是，從PCA分析中發(fā)現(xiàn)的游離在外的5個(gè)群體，均位于遷移過(guò)程的末梢。國(guó)內(nèi)這些養(yǎng)殖點(diǎn)的種源相對(duì)較單一，不同養(yǎng)殖群體間的交流較少，許多養(yǎng)殖點(diǎn)可能已經(jīng)或?qū)⒁媾R因過(guò)度近親繁殖而帶來(lái)的負(fù)面影響。如成年體型越來(lái)越小，生長(zhǎng)緩慢，抗病力降低、病害頻發(fā)、種質(zhì)退化（舒新亞，2010）。近年來(lái)廣泛發(fā)生的“五月瘟”（魏文燕等，2020），也是種群遺傳多樣性降低的結(jié)果。纖毛蟲(chóng)病（鐘亮等，2021）也是養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)病害之一，患病后，蟲(chóng)體寄生在龍蝦外殼上，影響正常蛻殼生長(zhǎng)，進(jìn)而失去商業(yè)價(jià)值。因此，及時(shí)引種、提高養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，是目前解決這些問(wèn)題的最便捷方式。

基于生物大數(shù)據(jù)分析，對(duì)不同地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的差異、群體內(nèi)個(gè)體的差異進(jìn)行及時(shí)調(diào)查，適時(shí)引種及加強(qiáng)不同地區(qū)群體間的交流，才能加強(qiáng)克氏原螯蝦優(yōu)良種質(zhì)資源的保護(hù)，且定期監(jiān)測(cè)還能為引種提供重要參考依據(jù)。本研究中首次發(fā)現(xiàn)浙江金華東陽(yáng)的群體與另外2個(gè)金華的養(yǎng)殖群體有較大的遺傳差異，種質(zhì)來(lái)源不同，將來(lái)可作為一個(gè)就近引種的選擇。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)浙江群體的遺傳多樣性低于其他省的養(yǎng)殖群體，可能與其內(nèi)交及與其他地區(qū)交流過(guò)少有關(guān)。為保證各地區(qū)克氏原螯蝦的遺傳多樣性，建議可適當(dāng)從遺傳多樣性較高的安徽和湖北等地引種進(jìn)行雜交，選育出多樣性更加豐富的群體進(jìn)行繁殖，加強(qiáng)不同地區(qū)、不同水系間群體的交流。通過(guò)大數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)，一方面有利于保護(hù)好現(xiàn)有的克氏原螯蝦物種基因庫(kù);另一方面有利于充分利用其遺傳多樣性，挖掘育種潛力，用科學(xué)方法及時(shí)準(zhǔn)確掌握克氏原螯蝦的種質(zhì)狀況，以促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。

4 結(jié)論

14個(gè)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體內(nèi)的遺傳多樣性較低，群體間的親緣關(guān)系較接近，品種單一、長(zhǎng)期內(nèi)交跡象明顯，面臨較高的種質(zhì)退化風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)群體的基因組重測(cè)序獲得的多態(tài)性信息遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)的微衛(wèi)星方法，能以較低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的全面定期監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

曹玲亮，周立志，張保衛(wèi). 2010. 安徽三大水系入侵物種克氏原螯蝦的種群遺傳格局[J]. 生物多樣性，18（4）：398-407. [Cao L L，Zhou L Z，Zhang B W. 2010. Genetic patterns of an invasive Procambarus clarkii population in the three river basins of Anhui Province[J]. Biodiversity Science，18（4）：398-407.] doi：10.3724/SP.J.1003.2010.398.

胡亞亞，劉蘭服，冀紅柳，韓美坤，焦偉靜，高志遠(yuǎn)，馬志民. 2018. 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 江蘇師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），36（4）：63-68. [ Hu Y Y，Liu L F，Ji H L，Han M K，Jiao W J，Gao Z Y，Ma Z M. 2018. Research progress on the reduced-representation genome sequencing technique[J]. Journal of Jiangsu Normal University（Natural Science Edition），36（4）：63-68.] doi：10.3969/ j.issn.2095-4298.2018.04.012.

黃小芳，唐章生，劉俊丹，張宏燕，鐘一治，盧智發(fā)，侯樹(shù)鑒，王大鵬，陸專靈. 2020. 廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，51（2）：437-444.[Huang X F，Tang Z S，Liu J D，Zhang H Y，Zhong Y Z，Lu Z F，Hou S J，Wang D P，Lu Z L. 2020. Genetic diversity microsatellite analysis of Procambarus clarkii populations in different regions of Guangxi[J]. Journal of Sou-thern Agriculture，51（2）：437-444.] doi：10.3969/j.issn.2095- 1191.2020.02.025.

劉楚吾，黎錦明，劉麗，郭昱嵩. 2010. 中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及遺傳多樣性分析[J]. 遺傳，32（7）：737-743. [Liu C W，Li J M，Liu L，Guo Y S. 2010. Screening and gene-tic diversity analysis of microsatellite markers in Chinese lobster（Panulirus stimpsoni）[J]. Hereditas，32（7）：737-743.] doi：10.3724/SP.J.1005.2010.00737.

劉萍，孟憲紅，何玉英，孔杰，李健，王清印. 2004. 中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）黃、渤海3個(gè)野生地理群遺傳多樣性的微衛(wèi)星DNA分析[J]. 海洋與湖沼，35（3）：252-257. [Liu P，Meng X H，He Y Y，Kong J，Li J，Wang Q Y. 2004.? Genetic diversity in three wild populations of Fenneropenaeus chinensis in Yellow and Bohai Seas as revealed by microsatellite DNA[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，35（3）：252-257.] doi：10.3321/j.issn：0029-814X.2004.03.009.

劉其根，李應(yīng)森，陳藍(lán)蓀. 2008. 克氏原螯蝦的生物學(xué)[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，35（1）：21-23. [Liu Q G，Li Y S，Chen L S. 2008. Ecological culture of red swamp crawfish Procambarus clarkii（I）[J]. Fisheries Science & Technology Information，35（1）：21-23.] doi：10.3969/j.issn.1001-1994. 2008.01.011.

馬海濤，常玉梅，于冬梅，孫效文. 2007. 利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析四個(gè)中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性（英文）[J]. 動(dòng)物學(xué)研究， 28（2）：126-133. [Ma H T，Chang Y M，Yu D M，Sun X W. 2007. Microsatellite variations among four populations of Eriocheir sinensis[J]. Zoological Research，28（2）：126-133.] doi：10.3321/j.issn：0254-5853.2007.02. 003.

彭剛，劉偉杰，李佳佳，嚴(yán)維輝，唐建清. 2010. 長(zhǎng)江流域3個(gè)克氏原螯蝦野生群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，26（5）：1115-1117. [Peng G，Liu W J，Li J J，Yan W H，Tang J Q. 2010. Microsatellite DNA analysis of genetic structure of three wild populations of Procambarus clarkii in the Yangtze River basin[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，26（5）：1115-1117.] doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2010.05.040.

舒新亞. 2010. 克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展及存在的問(wèn)題[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，（8）：22-25. [Shu X Y. 2010. The development and existing problems of clarkiis original crayfish industry[J]. China Fisheries，（8）：22-25.] doi：10.3969/j.issn.1002- 6681.2010.08.011.

宋光同，何吉祥，吳本麗，陳靜，黃龍，汪翔，武松. 2018. 克氏原螯蝦雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育及組織結(jié)構(gòu)觀察[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（2）：68-75. [Song G T，He J X，Wu B L，Chen J，Huang L，Wang X，Wu S. 2018. Study on development of female reproductive system and histological structure of Procambarus clarkii[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（2）：68-75.] doi：10.19386/j.cnki.jxnyxb.2018.02.16.

譚云飛，蓬國(guó)輝，熊禮靜，彭波，吳毅博，宋朝偉，白旭峰. 2020. 長(zhǎng)江中下游流域13個(gè)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39（2）：33-39. [Tan Y F，Peng G H，Xiong L J，Peng B，Wu Y B，Song C W，Bai X F. 2020. Genetic diversity and structure ana-lysis of 13 red swamp crayfish（Procambarus clarkii）popu-lations in Yangtze River basin[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，39（2）：33-39.] doi：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2020.02.005.

王長(zhǎng)忠，李忠，梁宏偉，呼光富，吳勤超，鄒桂偉，羅相忠. 2009. 長(zhǎng)江下游地區(qū)4個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性分析[J]. 生物多樣性，17（5）：518-523.[Wang C Z，Li Z，Liang H W，Hu G F，Wu Q C，Zou G W，Luo X Z. 2009. Genetic diversity in four Procambarus clarkii populations in the lower reaches of the Yangtze River[J]. Biodiversity Science，17（5）：518-523.] doi：10.3724/SP.J.1003. 2009.09017.

魏文燕，楊馬，劉家星，李良玉，吳艷蓉. 2020. 小龍蝦“五月瘟”成因及防控措施[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚(yú)，（6）：50-51. [Wei W Y，Yang M，Liu J X，Li L Y，Wu Y R. 2020. Causes and control measures of crayfish “May plague”[J]. Scientific Fish Farming，（6）：50-51.] doi：10.3969/j. issn1004-843X. 2020.06.026.

邢智珺，姜虎成，陸偉，錢照君，于宏偉，李家樂(lè). 2014. 江蘇8個(gè)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 23（5）：656-662. [Xing Z J，Jiang H C，Lu W，Qian Z J，Yu H W，Li J L. 2014. Genetic diversity analysis of eight procambarus clarkii stocks in Jiangsu Province based on microsatellites[J]. Journal of Shanghai Ocean University，23（5）：656-662.]

徐濱，李忠，魏開(kāi)金，馬寶珊，朱祥云，徐進(jìn). 2019. 6個(gè)克氏原螯蝦群體形態(tài)學(xué)分析[J]. 淡水漁業(yè)，49（6）：27-32. [Xu B，Li Z，Wei K J，Ma B S，Zhu X Y，Xu J. 2019. Morphological variations among six populations of Procambarus clarkia[J]. Freshwater Fisheries，49（6）：27-32.] doi：10.13721/j.cnki.dsyy.2019.06.005.

閆苗苗，魏光成，潘效紅，馬懷雷，李偉振. 2008. 一種適用于動(dòng)物與植物總DNA提取的方法——改良CTAB法（英文）[J]. Agricultural Science & Technology，9（2）：39-41. [Yan M M，Wei G C，Pan X H，Ma H L，Li W Z. 2008. A method suitable for extracting genomic DNA from animal and plant—Modified CTAB method[J]. Agricultural Science & Technology，9（2）：39-41.] doi：10.16175/j.cnki. 1009-4229.2008.02.001.

嚴(yán)維輝，唐建清，許志強(qiáng)，李佳佳. 2019. 克氏原螯蝦大棚育苗試驗(yàn)總結(jié)[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，40（12）：8-9. [Yan W H，Tang J Q，Xu Z Q，Li J J. 2019. Summary of greenhouse seedling experiment of Procambarus clarkii[J]. Journal of Aquaculture，40（12）：8-9.] doi：10.3969/j.issn.1004-2091. 2019.12.005.

張愛(ài)軍，沈繼紅. 2005. 龍蝦的綜合加工利用[J]. 中國(guó)資源綜合利用，（9）：35-36. [Zhang A J，Shen J H. 2005. The comprehensive machining utilization of Chinese lobster[J]. China Resources Comprehensive Utilization，（9）：35-36.] doi：10.3969/j.issn.1008-9500.2005.09.011.

張莎，俞樹(shù)惠，邱高峰. 2018. 克氏原螯蝦染色體及其核型[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，42（10）：1513-1519. [Zhang S，Yu S H，Qiu G F. 2018. Chromosome and karyotype of the crayfish（Procambarus clarkii）[J]. Journal of Fisheries of China，42（10）：1513-1519.] doi：10.11964/jfc.20171211084.

鐘亮，黃小麗，徐銘，李良玉. 2021. 小龍蝦纖毛蟲(chóng)病的診斷與防治[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚(yú)，（1）：50-51. [Zhong L，Huang X L，Xu M，Li L Y. 2021. Diagnosis and control of ciliosis in crayfish[J]. Scientific Fish Farming，（1）：50-51.] doi：10.3969/j.issn1004-843X.2021.01.027.

Alexander D H，Novembre J，Lange K. 2009. Fast model-based estimation of ancestry in unrelated individuals[J]. Genome Research，19（9）：1655-1664. doi：10.1101/gr.094 052.109.

Barbaresi S，F(xiàn)ani R，Gherardi F，Mengoni A，Souty-Grosset C. 2003. Genetic variability in European populations of an invasive American crayfish：Preliminary results[J]. Biolo-gical Invasions，5（3）：269-274. doi：10.1023/A：10261335 19707.

Barbaresi S，Gherardi F，Mengoni A，Souty-Grosset C. 2007. Genetics and invasion biology in fresh waters：A pilot study of Procambarus clarkii in Europe[M]//Gherardi F. Biological invaders in inland waters：Profiles， distribution， and threats. Dordrecht：Springer：381-400.doi：10.1007/978-1-4020-6029-8_20.

Botstein D，White R L，Skolnick M，Davis R W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics，3（3）：314-331.

Davidson R，Campo A M D. 2020. Combinatorial and computational investigations of neighbor-joining bias[J]. Frontiers in Genetics，（11）：584785. doi：10.3389/fgene.2020. 584785.

Kumar S，Stecher G，Li M，Knyaz C，Tamura K. 2018. MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution，35（6）：1547-1549. doi：10.1093/molbev/msy096.

Li H，Durbin R. 2009. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform[J]. Bioinformatics，25（14）：1754-1760. doi：10.1093/bioinformatics/btp324.

Li H，Handsaker B，Wysoker A，F(xiàn)ennell T，Ruan J，Homer N，Marth G，Abecasis G，Durbin R. 2009. The sequence alignment/map format and SAMtools[J]. Bioinformatics，25（16）：2078-2079. doi：10.1093/bioinformatics/btp352.

Liu J，Huang S M，Sun M Y，Liu S Y，Liu Y M，Wang W X，Zhang X R，Wang H Z，Hua W. 2012. An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application[J]. Plant Methods，8（1）：34. doi：10.1186/1746-4811-8-34.

Mckenna A，Hanna M，Banks E，Sivachenko A，Cibulskis K，Kernytsky A，Garimella K，Altshuler D，Gabriel S，Daly M，DePristo M A. 2010. The Genome Analysis Toolkit：A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data[J]. Genome Research，20：1297-1303. doi：10.1101/gr.107524.110.

Pan Y Z，Wang X Q，Sun G L，Li F S，Gong X. 2016. Application of RAD sequencing for evaluating the genetic diversity of domesticated Panax notoginseng（Araliaceae）[J]. PLoS One，11（11）：e0166419. doi：10.1371/journal.pone.0166419.

Price A L，Patterson N J，Plenge R M，Weinblatt M E，Shadick N A，Reich D. 2006. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies[J]. Nature Genetics，38（8）：904-909. doi：10.1038/ ng1847.

Seplyarskiy V B，Kharchenko P，Kondrashov A S，Bazykin G A. 2012. Heterogeneity of the transition/transversion ratio in Drosophila and hominidae genomes[J]. Molecular Biology and Evolution，29（8）：1943-1955. doi：10.1093/molbev/mss071.

Sun X W，Liu D Y，Zhang X F，Li W B，Liu H，Hong W G，Jiang C B，Guan N，Ma C X，Zeng H P，Xu C H，Song J，Huang L，Wang C M，Shi J J，Wang R，Zheng X H，Lu C Y，Wang X W，Zheng X K. 2013. SLAF-seq：An efficient method of large-scale De Novo SNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing[J]. PLoS One，8（3）：e58700. doi：10.1371/journal.pone.0058700.

Talebi R，Naji A M，F(xiàn)ayaz F. 2008. Geographical patterns of genetic diversity in cultivated chickpea（Cicer arietinum L.）characterized by amplified fragment length polymorphism[J]. Plant，Soil and Environment，54（10）：447-452. doi：10.17221/399-PSE.

Yi S K，Li Y H，Shi L L，Zhang L，Li Q B，Chen J. 2018. Characterization of population genetic structure of red swamp crayfish，Procambarus clarkii，in China[J]. Scientific Reports，8（1）：5586. doi：10.1038/s41598-018-23986-z.

Zhong Y Z，Tang Z S，Huang L M，Wang D P，Lu Z L. 2020. Genetic diversity of Procambarus clarkii populations based on mitochondrial DNA and microsatellite markers in different areas of Guangxi，China[J]. Mitochondrial DNA Part A，31（2）：48-56. doi：10.1080/24701394.2020. 1721484.

（責(zé)任編輯 王 暉）