劉鑫 李華 齊磊 宋富 徐蘭舉

河北納科生物科技有限公司，石家莊050000

0 引 言

膠原蛋白是細胞外基質中含量最豐富的蛋白家族，發(fā)揮傳遞生長因子和細胞因子、維持組織結構完整性、影響細胞黏附和增殖等多種生物學功能[1]。膠原蛋白具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、生物可降解性及可規(guī)?；a等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于生物材料、保健食品、化妝品及醫(yī)藥工業(yè)等領域[2-3]。

膠原蛋白及其衍生物市場需求量大，目前膠原蛋白的生產方法主要有傳統(tǒng)提取法、化學合成法和現(xiàn)代生物技術生產法。研究所需的膠原蛋白一般提取自動物的皮膚和跟腱等組織，絕大多數(shù)以易于處理的牛腱、鼠尾腱為原料[4]。提取的動物膠原蛋白具有潛在的病毒隱患，易引發(fā)機體免疫反應[5-6]，還存在提取工藝難度大、周期長、成本高、水溶性差等問題。Kotch 和Raines[7]于2006年通過化學法合成了具有（Gly-X-Y）n膠原蛋白特征序列的多肽，該多肽可通過自組裝成功形成三螺旋結構，但該法在批量制備和成本控制方面研究進展較為緩慢。利用基因工程技術進行重組膠原蛋白表達具有成本低、效率高等優(yōu)點，且能通過菌種發(fā)酵技術獲得產業(yè)化推廣，受到越來越多研究者的關注[8]。重組人膠原蛋白是基于人膠原蛋白的特征和主要功能域重新優(yōu)化設計基因序列，表達的目標蛋白具有與人膠原蛋白相似的結構特征。與傳統(tǒng)提取法提取的動物膠原蛋白相比，重組人膠原蛋白具有產量高、批次穩(wěn)定、親水性強、生物相容性好、無免疫病毒風險等優(yōu)點[9]，是一種理想的生物醫(yī)用材料。

重組人Ⅲ型膠原蛋白（recombinant human typeⅢcollagen，rhCol）在醫(yī)藥、保健、營養(yǎng)等方面具有重要的應用價值，提高其產量將促進其發(fā)揮巨大的市場價值。Mirazul 等[10]利用化學交聯(lián)法將重組人膠原蛋白制成膠原基角膜替代物，該替代物具備良好的光學性能、力學性能及生物安全性，為角膜病致盲患者帶來了重見光明的曙光。2017年李偉娜等[11]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母高密度發(fā)酵表達的Ⅲ型類人膠原在胃黏膜修復方面具有顯著功效。2019年劉彤等[12]探討了rhCol 水凝膠對豬全層皮膚缺損創(chuàng)面修復的影響，結果表明該膠原蛋白水凝膠可顯著促進豬皮膚內的血管新生及創(chuàng)面愈合過程，并減輕瘢痕增生的產生。

目前已有多種表達體系用于重組人膠原蛋白的研究，如大腸桿菌、畢赤酵母[13]、昆蟲細胞、轉基因作物、轉基因蠶[14]等。相比之下，畢赤酵母和大腸桿菌表達系統(tǒng)具有成本低、速度快、技術簡便、可進行高密度發(fā)酵等優(yōu)點，是工業(yè)化生產的首選方式。

本研究采用重組基因工程技術，在大腸桿菌中進行高密度發(fā)酵，將人Ⅲ型膠原蛋白和病毒來源的脯氨酰羥化酶基因共表達，經分離純化成功獲得了羥基化的rhCol；同時采用了鹽析-透析法和鹽析-柱層析結合法兩種純化工藝，所得rhCol 的純度分別滿足化妝品及醫(yī)藥級原料的要求；還對rhCol 的羥脯氨酸含量進行了測定，并對其細胞相容性進行了評價。本研究提出的工藝相對簡便，蛋白結構穩(wěn)定可靠，為rhCol 的后續(xù)開發(fā)生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

rhCol 發(fā)酵液（筆者所在實驗室生產），層析柱[利穂科技（蘇州）有限公司]，填料Ni-IDA（蘇州納微科技股份有限公司），填料G-25[博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g有限公司]，His 標簽小鼠單克隆抗體（6×His）、辣根過氧化物酶標記的親和純化山羊抗小鼠IgG（H＋L）（美國Proteintech Group 公司），二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），其他試劑均為分析純。

ClearFirst-2000 蛋白純化系統(tǒng)（上海閃譜生物科技有限公司），Scientz-150 高壓均質機（寧波新芝生物科技股份有限公司），GRJD-5D-2 雙聯(lián)不銹鋼發(fā)酵系統(tǒng)（鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司），CL8R 高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），BSA124S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，F(xiàn)iveEasy Plus FE28 pH 計（瑞士Mettler-Toledo 公司），DDS-307雷磁電導率儀（上海儀電科學儀器股份有限公司），Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），GelView 6000Pro 全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)（廣州博鷺騰生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的組成

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g/L，酵母提取物7.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.9 g/L，KH2PO46.8 g/L，（NH）42SO44.0 g/L，MgSO·47H2O 1.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，丙三醇12.0 g/L，pH7.0。

補料培養(yǎng)基：丙三醇500 g/L。

1.2.2 rhCol 工程菌的獲得

依據(jù)人Ⅲ型膠原蛋白氨基酸序列和巨型病毒4-脯氨酰羥化酶氨基酸序列反向設計基因序列，進行密碼子優(yōu)化，得到人Ⅲ型膠原蛋白的編碼基因序列和羥化酶Hy726 基因序列。根據(jù)優(yōu)化的基因序列進行基因序列的全基因合成，構建了重組質粒pET30a（＋）-1880 和pACYCDuet-hy726。將雙質粒通過熱激法同時轉化入BL21（DE3）感受態(tài)細胞，篩選獲得重組基因工程菌pET30a（＋）-1880/pACYCDuethy726/BL21（DE3），穩(wěn)定共表達rhCol 和脯氨酰羥化酶。

1.2.3 rhCol 的發(fā)酵及純化

（一）發(fā)酵表達

將重組工程菌接入LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，第2 天以10%的接種量轉接至5 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。利用5 L 發(fā)酵罐進行rhCol 的高密度發(fā)酵表達，發(fā)酵條件為：pH7.4，溶解氧>20%，37 ℃，700 r/min。待菌體濕重達20%時，使用終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷于25 ℃誘導菌種進行目的蛋白的表達。分別于誘導后4、8、12、15 h取適量發(fā)酵液超聲破碎，對裂解完成的菌體進行蛋白樣品的制備，完成十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析及蛋白質印跡表達鑒定。誘導表達15 h 后放罐，離心收集菌體，記錄菌體濕重后于-80 ℃凍存。

（二）細胞破碎及鹽析粗純

取凍存菌體，按質量體積比1∶10 加入磷酸緩沖液重懸，混勻，設置強度1000 Bar 均質3 次。將高壓均質后的細胞破碎液12000× g 離心20 min，取上清。邊攪拌邊緩慢加入質量濃度為200 g/L 的硫酸銨至上清中，室溫放置10 min，12000× g 離心20 min，分別收集上清及沉淀，進行SDS-PAGE。

（三）鹽析-透析法純化膠原蛋白

取200 g/L 硫酸銨鹽析沉淀，按原體積的20%加雙蒸水復溶。然后用磷酸調pH 值至2.5，離心取上清。將上清轉入14 ku 的透析袋內，以雙蒸水作為交換液，4 ℃透析，每8 小時更換1 次雙蒸水，透析72 h。透析過程中監(jiān)測透出液的電導率和pH 改變情況，透析完成后進行冷凍干燥。

（四）鹽析-柱層析結合法純化膠原蛋白

?。ㄈ┲型肝銮暗纳锨澹? mol/L NaOH 溶液調pH 值至8.5，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，使用Ni-IDA 層析柱通過線性洗脫方式進行親和層析（平衡液：20 mmol/L 磷酸緩沖液，0.3 mol/L NaCl，pH8.5；洗脫液：20 mmol/L 磷酸緩沖液，0.2 mol/L 咪唑，0.1 mol/L NaCl，pH8.5），收集洗脫液。洗脫液經分子篩凝膠G-25 脫鹽后冷凍干燥。

（五）rhCol 凍干品的制備

分別將采用（三）、（四）方法純化獲得的蛋白樣品溶液于無菌條件下經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝至10 ml 的無菌西林瓶中，真空冷凍干燥36 h，即得rhCol 凍干品。

1.2.4 rhCol 性能研究

（一）rhCol 凍干品水溶性考察

分別取適量rhCol 凍干品，加入雙蒸水配制成1、100 mg/ml 的水溶液，觀察并記錄rhCol 的溶解速度、溶液顏色和狀態(tài)。

（二）rhCol 純度分析

取適量rhCol 凍干品，加入雙蒸水溶解配制成1 mg/ml 的溶液，進行SDS-PAGE。采用全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行凝膠成像，BioAnaly 軟件對目的蛋白及雜蛋白條帶進行灰度分析，計算目的蛋白的純度。

（三）rhCol 中羥脯氨酸含量測定

羥脯氨酸是膠原蛋白特有的一種氨基酸，是膠原組織的主要成分之一，約占膠原蛋白氨基酸含量的9%～13%[15]。水解后可通過測定產生的羥脯氨酸含量進而求得膠原蛋白的含量。羥脯氨酸含量測定按照文獻[16]進行。

（四）rhCol 的N 端氨基酸測序

采用全自動蛋白質多肽測序儀對rhCol 的N 端序列15 個氨基酸進行分析。

（五）rhCol 細胞相容性評價

采用噻唑藍法檢測不同質量濃度的rhCol 對小鼠成纖維細胞L929 增殖的作用。取rhCol 凍干品，以含血清的MEM 培養(yǎng)基為溶劑配制成0.1、1.0、5.0、10.0 mg/ml 質量濃度梯度的樣品，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌得到4 組實驗液。然后按文獻[17]測定各實驗組的細胞相對增殖率。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（Mean±SD）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 rhCol 發(fā)酵表達驗證

發(fā)酵過程中分別于誘導前和誘導后4、8、12、15 h 取適量發(fā)酵液超聲破碎，對發(fā)酵菌體進行SDSPAGE 及蛋白質印跡表達鑒定。結果如圖1 所示，在發(fā)酵誘導后4、8、12、15 h 的工程菌細胞破碎液中均檢測到了目的蛋白的表達，其相對分子質量約為70 ku；經蛋白質印跡法鑒定，70 ku 處的蛋白條帶即為rhCol。

圖1 重組人Ⅲ型膠原蛋白發(fā)酵過程中不同誘導時間的檢測結果

2.2 鹽析-透析法純化結果

由圖2 可知，將發(fā)酵菌體高壓均質破碎液用硫酸銨鹽析，當硫酸銨質量濃度為200 g/L 時即能使目的蛋白沉淀出來，同時去除一部分雜蛋白，達到粗分離和濃縮的目的。鹽析沉淀用水復溶后加磷酸調pH 值至2.5，可去除大部分雜蛋白，相對分子質量大于70 ku 的雜蛋白基本被去除干凈，存在少量低相對分子質量的雜蛋白。最后結合透析工藝，獲得了純度大于85%的rhCol，可作為化妝品級原料。

圖2 重組人Ⅲ型膠原蛋白鹽析/酸處理過程的檢測結果

2.3 鹽析-親和層析法純化結果

圖3 為鹽析粗純樣品過Ni-NTA 親和層析柱后的SDS-PAGE 結果，rhCol 樣品純度達95%以上。親和層析洗脫液經分子篩凝膠G-25 脫鹽處理、冷凍干燥，即可獲得純品，可作為醫(yī)藥級原料用于組織工程材料、醫(yī)用敷料等產品的開發(fā)。

圖3 重組人Ⅲ型膠原蛋白親和層析檢測結果

2.4 rhCol 性能研究

2.4.1 rhCol 凍干品及其水溶性考察

圖4A 所示為rhCol 凍干品，為白色柔軟的多孔海綿狀樣品，水溶性良好，遇水可迅速溶解。當rhCol的質量濃度為1 mg/ml 時，溶液無色透明澄清（圖4B）；當rhCol 的質量濃度達100 mg/ml 時，溶液于4 ℃放置4 h 后呈凝膠態(tài)（圖4C），這可能是由于在低溫下膠原纖維發(fā)生了自組裝。

圖4 rhCol凍干品及其水溶液狀態(tài)

2.4.2 rhCol 純度分析

圖5 為rhCol 的SDS-PAGE 結果，由目的蛋白及雜蛋白條帶灰度分析結果得到rhCol 蛋白純度在95%以上。

圖5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定重組人Ⅲ型膠原蛋白純度

2.4.3 rhCol 中羥脯氨酸含量測定

本研究分別測定了牛跟腱中提取的Ⅰ型天然膠原蛋白、rhCol 和某市售重組膠原蛋白3 種樣品中的羥脯氨酸含量。結果顯示rhCol 中的羥脯氨酸含量約11.44%，與Ⅰ型天然膠原蛋白中的羥脯氨酸含量（9.92%）較為接近，而某市售重組膠原樣品中不含羥脯氨酸。

2.4.4 rhCol 的N 端氨基酸測序

重組膠原蛋白的N 端氨基酸序列直接影響其整體的生物學功能。為進一步確認rhCol 為預期優(yōu)化設計的基因序列所表達的目的蛋白，本研究對rhCol的N 端氨基酸序列進行了測定，結果如下：NH2-Met-Tyr-Asp-Ser-Tyr-Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val-Ala-Val-Gly-Gly，這與預期設計的蛋白N 端序列相同。

2.4.5 rhCol 的細胞相容性評價

噻唑藍實驗結果見表1，陰性對照組及樣品組的L929 細胞均生長良好；0.1～5.0 mg/ml 的rhCol 溶液均無細胞毒性，且顯示出促細胞增殖的活性；而10.0 mg/ml 的rhCol 溶液對L929 細胞增殖具有微弱抑制作用，這可能是由于在此質量濃度下樣品的滲透壓已超過細胞的正常滲透壓，從而影響了細胞的正常生長[18]。綜上所述，rhCol 無明顯細胞毒性，具有良好的細胞相容性，是一種優(yōu)良的生物活性材料。

表1 rhCol 樣品與L929 細胞作用24 h 后的細胞相對增殖率

3 討論與結論

本研究成功構建了重組基因工程菌pET30a(+)-1880/pACYCDuet-hy726/BL21（DE3），穩(wěn)定共表達rhCol 和脯氨酰羥化酶，通過高密度發(fā)酵和蛋白純化技術獲得羥基化的rhCol。本研究發(fā)酵得到的最終菌體濕重約為200 g/L，將收集的菌體高壓均質破碎，取細胞破碎上清液，以200 g/L 硫酸銨鹽析和調酸處理，進行初步分離。然后通過透析法脫鹽、脫酸，獲得rhCol，其純度大于85%，可用于食品和化妝品行業(yè)；而結合鹽析-柱層析法純化獲得的rhCol，其純度大于95%，可作為醫(yī)藥級原料用于組織工程材料、醫(yī)用敷料等產品的開發(fā)。

本研究結果還顯示，通過基因工程技術獲得的rhCol 的羥脯氨酸含量與天然膠原蛋白接近，其水溶性及細胞相容性良好，可作為一種優(yōu)良的生物材料用于醫(yī)藥領域，為重組人膠原蛋白在組織工程材料、醫(yī)用敷料、皮膚護理等方向的廣泛應用奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突