王冰月 姜埃利 賈嵐 王立華

1天津市第三中心醫(yī)院腎內(nèi)科300170；2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎臟病與血液凈化中心300211

0 引 言

良好的血管通路，尤其是動(dòng)靜脈內(nèi)瘺，是保證維持性血液透析順利進(jìn)行，維持患者長(zhǎng)期生存的前提，而靜脈內(nèi)膜增生是導(dǎo)致血管通路失功的最常見(jiàn)因素[1]。靜脈內(nèi)膜增生與動(dòng)靜脈內(nèi)瘺狀態(tài)下，剪切力的變化與內(nèi)膜功能紊亂密切相關(guān)，其中涉及許多超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞基因及信號(hào)通路等。有研究結(jié)果顯示，Kruppel 樣因子2（Krüppel-like factor 2，KLF2）及內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）都會(huì)受到剪切力作用，發(fā)揮不同的生理功能，調(diào)節(jié)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能。本研究中，分析正常生理及尿毒癥狀態(tài)下剪切力作用對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KLF2 及eNOS 表達(dá)的影響，從基礎(chǔ)理論方面更好地理解動(dòng)靜脈內(nèi)瘺失功的原因，對(duì)臨床實(shí)際工作中治療內(nèi)瘺狹窄或阻塞有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）（上海星博生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas 公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）試劑盒（美國(guó)Roche 公司）。

BK800 細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus Sepatech 公司），XDY-1 倒置熒光顯微鏡（深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

HUVECs 以常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)細(xì)胞，每1～3 天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上融合時(shí)，胰蛋白酶消化按1∶3 傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 體外尿毒癥培養(yǎng)基配置方法

尿毒癥血清取自于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院透析中心的規(guī)律血液透析患者，所有患者均簽署知情同意書?；颊叩脑l(fā)病均為慢性腎小球腎炎，每周透析3 次，透析時(shí)間4 h，排除1 周內(nèi)感染、心衰、患腫瘤及嚴(yán)重免疫性疾病的患者?；颊哂谘和肝銮翱崭谷⊙? ml，收集后盡快處理，以3000 r/min 離心處理10 min；采集上清液，放置于56 ℃的水浴中處理30 min 清除血清補(bǔ)體，再經(jīng)孔徑為0.2 μm 的微孔濾膜過(guò)濾除細(xì)菌，儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

尿毒癥培養(yǎng)液的配制方法：DMEM 培養(yǎng)液45 ml，加入尿毒癥血清5 ml，加入雙抗（青鏈-霉素混合液）1 ml。

1.2.3 平行板流動(dòng)室模型建立

剪切力的大小及循環(huán)流速的確定，采用下式

式中：μ 是液體黏度，Q 是液體流量，r 是管腔半徑。

所有實(shí)驗(yàn)器材在使用前進(jìn)行高溫高壓處理。提前1 天將靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至載玻片上并放置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。用泵管連接實(shí)驗(yàn)器皿（錐形瓶、水準(zhǔn)瓶）和恒流泵/注射泵，在鋪滿細(xì)胞的載玻片上放置硅膠墊片，然后與平行板固定，放入平行板流動(dòng)室的固定裝置中。將上述裝置放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱之中，注入DMEM 培養(yǎng)液或含尿毒癥血清的DMEM培養(yǎng)液（均含體積分?jǐn)?shù)為5%的FBS）。

采用恒流泵模擬層流剪切力作用，通過(guò)調(diào)整不同的流速和時(shí)間，模擬不同的剪切條件。設(shè)置3 個(gè)剪切組、1 個(gè)振蕩組和2 個(gè)對(duì)照組。在生理對(duì)照組和尿毒癥對(duì)照組中，樣品保持靜態(tài)狀態(tài)，即不受剪切力的作用。3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組為低剪切力組（LSS）、正常剪切力組（生理強(qiáng)度）（NSS）和高剪切力組（HSS）。其中，LSS 組的剪切力為0.4Pa，對(duì)應(yīng)泵流速為18ml/min；NSS 的剪切力為1.2 Pa，對(duì)應(yīng)泵流速為52 ml/min；HSS組的剪切力為2 Pa，對(duì)應(yīng)泵流速為86 ml/min。振蕩剪切力組（OSS）中，采用恒流泵聯(lián)合注射泵產(chǎn)生周期性的流體運(yùn)動(dòng)，以模擬振蕩剪切力，強(qiáng)度為±0.4 Pa。

實(shí)驗(yàn)中，生理狀態(tài)采用DMEM 培養(yǎng)基，尿毒癥狀態(tài)采用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）尿毒癥血清的DMEM培養(yǎng)基；對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；分別在生理狀態(tài)和尿毒癥狀態(tài)下，在平行板流動(dòng)腔內(nèi)模擬不同剪切力，用剪切力作用各組靜脈內(nèi)皮細(xì)胞4、12、24 h。

1.2.4 免疫熒光方法

將靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞爬片上培養(yǎng)，然后放置在循環(huán)裝置中循環(huán)，結(jié)束后取出，用4℃磷酸鹽緩沖液沖洗，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.25%通透液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透，血清封閉，加入KLF2 及eNOS 抗體（稀釋比例1∶50）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過(guò)夜孵育，加入熒光抗體（稀釋比例1∶50）孵育，最后滴加4"6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片，進(jìn)行細(xì)胞核染色，處理后的細(xì)胞法倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞抗原表達(dá)情況。應(yīng)用ImageJ 圖像處理軟件進(jìn)行免疫熒光度的測(cè)定。

1.2.5 RNA 提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

將提取的細(xì)胞應(yīng)用Trizol 法進(jìn)行RNA 提取，取2 μl RNA 用無(wú)酶水稀釋5 倍后進(jìn)行濃度測(cè)定，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒，按步驟進(jìn)行RNA 測(cè)定。所用的基因引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生理?xiàng)l件下剪切力對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KLF2 表達(dá)的影響

如圖1 所示，隨剪切力作用時(shí)間的增長(zhǎng)，對(duì)照組的KLF2 表達(dá)水平基本沒(méi)有變化，而HSS 組和NSS 組的KLF2 表達(dá)增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)24 h 后，HSS 組和NSS 組的KLF2 表達(dá)水平明顯超過(guò)4 h（均P<0.05）和12 h（均P<0.05），且HSS 組的KLF2 表達(dá)增強(qiáng)更為明顯；剪切作用24 h 后，HSS 組的KLF2 表達(dá)水平明顯高于OSS 組（P<0.01）。圖1B 顯示的是差異倍數(shù)，其反映實(shí)驗(yàn)組和振蕩組的KLF2 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組表達(dá)量的差異倍數(shù)，大于1 表示表達(dá)量較對(duì)照組高，小于1 表示表達(dá)量較對(duì)照組低。

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，KLF2 主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，隨著剪切力的作用KLF2 在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)（圖2）。上述結(jié)果說(shuō)明，KLF2 可以被高強(qiáng)度層流剪切力激活。

圖2 正常條件下KLF2 蛋白的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×600）

2.2 生理?xiàng)l件下剪切力對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 表達(dá)的影響

如圖3 所示，HSS 組和NSS 組的eNOS 表達(dá)水平明顯高于LSS 組和OSS 組（均P<0.05）；隨剪切作用時(shí)間的增長(zhǎng)，對(duì)照組的KLF2 表達(dá)水平基本沒(méi)有變化，而HSS 組的eNOS 表達(dá)水平總體上呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)24 h 后，HSS 組的eNOS 的表達(dá)水平明顯高于4 h（P<0.05）和12 h（P<0.05）；此外，隨剪切作用時(shí)間的增長(zhǎng)，LSS 和OSS 組的eNOS 表達(dá)雖有所下降，但并不明顯（均P>0.05）。

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，eNOS 主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)呈顆粒樣表達(dá)（圖4）。上述結(jié)果說(shuō)明，eNOS 的表達(dá)可以被高強(qiáng)度層流剪切力激活，被振蕩剪切力及低強(qiáng)度層流剪切力抑制，eNOS 的表達(dá)特征與KLF2 基本同步。

表1 基因引物序列

圖1 正常條件下剪切力對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中KLF2 表達(dá)的影響

圖3 正常條件下剪切力對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS 表達(dá)的影響

圖4 正常條件下eNOS 蛋白的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×600）

2.3 尿毒癥條件下剪切力對(duì)KLF2 表達(dá)的影響

如圖5 所示，與正常對(duì)照組相比，尿毒癥對(duì)照組中的KLF2 表達(dá)很低（P<0.01）；剪切作用24 h 后，各剪切組中KLF2 的表達(dá)有所增強(qiáng)，其中OSS 組的KLF2 表達(dá)量低于HSS 組（P<0.01）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在尿毒癥條件下KLF2 主要在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)；剪切作用后，KLF2 的表達(dá)不僅在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，在胞質(zhì)中也有表達(dá)（圖6）。

圖5 尿毒癥條件下剪切作用24 h 后靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中KLF2 的表達(dá)

圖6 尿毒癥條件下KLF2 蛋白的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×600）

2.4 尿毒癥條件下剪切力對(duì)eNOS 表達(dá)的影響

如圖7 所示，與正常對(duì)照組相比，尿毒癥對(duì)照組中的eNOS 表達(dá)降低（P<0.01）；與尿毒癥對(duì)照組比較，剪切作用24 h 后，HSS 組的eNOS 表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01），而LSS 組和OSS 組的eNOS 表達(dá)明顯降低（均P<0.01）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在尿毒癥條件下，eNOS 主要在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)（圖8）。

圖7 尿毒癥條件下剪切作用24 h 后靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS 的表達(dá)

圖8 尿毒癥條件下eNOS 蛋白的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×600）

3 討論與結(jié)論

目前，自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（autogenous arteriovenous fistulas，AVF）是需要維持性血液透析的尿毒癥患者的首選血管通路。其具有方便操作、感染風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)勢(shì)，但AVF 技術(shù)現(xiàn)狀仍不樂(lè)觀，其1年的成熟率僅為60%[2-5]。AVF 失功與多重因素相關(guān)，研究者在分子生物學(xué)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面對(duì)此進(jìn)行了大量研究，以探討AVF 失功的病理生理機(jī)制，提高AVF成熟率及通暢率。對(duì)于尿毒癥患者，尿毒癥毒素、尿毒癥基礎(chǔ)原發(fā)?。ㄈ缣悄虿?、高血壓等）、氧化應(yīng)激、炎癥、缺氧、酸中毒等都會(huì)導(dǎo)致其靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重，產(chǎn)生靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致一系列病理生理改變，最終導(dǎo)致內(nèi)膜增生、血管狹窄[6-11]。此外，AVF 引起的血流動(dòng)力學(xué)改變也非常重要。剪切力的變化貫穿內(nèi)瘺成熟的全過(guò)程，且動(dòng)靜脈的剪切力變化也存在明顯差異。在本研究中，不僅考慮了剪切力的作用，而且模擬了尿毒癥的環(huán)境條件，這是以往研究所沒(méi)有涉及的?？疾爝@兩種雙重因素的共同作用更能準(zhǔn)確反映尿毒癥患者AVF 時(shí)的病理生理改變。

靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在受到剪切力作用后，其細(xì)胞膜表面的壓力感受器會(huì)發(fā)揮作用，將力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號(hào)，并通過(guò)各種信號(hào)通路，影響下游的靶因子及蛋白的調(diào)控，發(fā)揮各自的病理生理作用[12-14]。以往研究發(fā)現(xiàn)，剪切力可以直接調(diào)控靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的敏感細(xì)胞因子（如KLF2）。KLF2 是KLF 家族中的重要成員，除了調(diào)控T 細(xì)胞成熟和脂肪分化過(guò)程之外，還在抗炎、抗凝、抗血栓、抗氧化、血管生成、內(nèi)分泌調(diào)控等方面發(fā)揮重要的作用。

血流動(dòng)力學(xué)的改變與KLF2 表達(dá)水平密切相關(guān)。血流剪切力是生理情況下誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KLF2 表達(dá)的唯一因素[15]。在層流剪切力作用的直段血管，KLF2 表達(dá)明顯增高。已有研究結(jié)果證實(shí)，層流剪切力是誘導(dǎo)KLF2 高表達(dá)的剪切力類型，兩者之間有明顯的線性關(guān)系。與之相反，在受振蕩剪切力作用的血管彎曲及分叉部位，KLF2 表達(dá)明顯被抑制。本研究結(jié)果顯示，KLF2 明顯受剪切力作用調(diào)節(jié)，高強(qiáng)度剪切力和生理強(qiáng)度剪切力會(huì)上調(diào)KLF2 的表達(dá)，而低強(qiáng)度剪切力和振蕩剪切力會(huì)下調(diào)KLF2的表達(dá)，但隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，KLF2 的表達(dá)也會(huì)有所上調(diào)。在AVF 的吻合口附近的血流多為湍流模式，表現(xiàn)為低強(qiáng)度剪切力及振蕩剪切力，使KLF2 的表達(dá)受抑制，不能正常發(fā)揮抗炎、抗凝、抗氧化及血管調(diào)節(jié)作用，長(zhǎng)期作用時(shí)，將導(dǎo)致靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、內(nèi)膜增厚，最終導(dǎo)致血管狹窄、AVF 失功。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)在尿毒癥狀態(tài)下，KLF2 表達(dá)明顯被抑制，即使給予高剪切力作用，KLF2 水平也不及正常生理狀態(tài)；在低剪切力及振蕩剪切力作用下，KLF2 表達(dá)更明顯地被抑制。因此，KLF2 在尿毒癥環(huán)境及振蕩剪切力雙重作用下的表達(dá)被抑制，可能在AVF 失功的病理生理機(jī)制上發(fā)揮很重要的作用。

eNOS 的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié)。eNOS 是KLF2 的靶基因，因此KLF2 的表達(dá)可以直接調(diào)控eNOS 的表達(dá)。本研究中，在高強(qiáng)度及正常強(qiáng)度（生理強(qiáng)度）層流剪切力作用下，eNOS 表達(dá)明顯上調(diào)，而低強(qiáng)度剪切力及振蕩剪切力則抑制了eNOS 的表達(dá)，該結(jié)果與針對(duì)KLF2 的研究結(jié)果一致。eNOS 的表達(dá)受抑制，會(huì)使NO 合成減少，血管調(diào)節(jié)功能異常，導(dǎo)致血栓形成、血管平滑肌細(xì)胞增殖，這些均是AVF 失功的機(jī)制。除剪切力影響之外，尿毒癥狀態(tài)也影響eNOS 的表達(dá)，在尿毒癥狀態(tài)下，eNOS 的表達(dá)較正常生理狀態(tài)下明顯下降，并且在振蕩剪切力作用下，eNOS 的表達(dá)更進(jìn)一步被抑制，不能發(fā)揮正常的生理功能，最終會(huì)導(dǎo)致靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，這與AVF 失功有著密切的關(guān)系。

綜上所述，AVF 術(shù)后在尿毒癥環(huán)境及剪切力的多重因素作用下，會(huì)使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)具有保護(hù)性的因子（如KLF2、eNOS）的表達(dá)受到抑制。該結(jié)論提示尿毒癥狀態(tài)更容易出現(xiàn)炎癥、氧化應(yīng)激、血管調(diào)節(jié)功能下降，進(jìn)而出現(xiàn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)一系列細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，再加之振蕩剪切力的進(jìn)一步作用，會(huì)使上述蛋白或因子的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。這些因素可能是導(dǎo)致靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、內(nèi)膜增生、AVF 失功的病理生理機(jī)制。本研究中所得結(jié)果均在體外細(xì)胞條件下取得，相關(guān)機(jī)制尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突