崔蕊 鄧琦

天津市第一中心醫(yī)院血液科300192

0 引 言

作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是機(jī)體抗擊病毒感染及腫瘤的第一道防線。過(guò)去15年中，盡管諸多臨床試驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)供體NK 細(xì)胞治療腫瘤的安全性及可行性，但因腫瘤細(xì)胞可通過(guò)免疫逃逸機(jī)制逃避NK 細(xì)胞攻擊而限制了NK 細(xì)胞的臨床應(yīng)用。鑒于嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell,CART） 在急性B 淋巴細(xì)胞白血病（B cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）及B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma, B-NHL）中的顯著療效，2017年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局及歐盟批準(zhǔn)兩種CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品用于治療B-ALL 和BNHL，使CAR-T 細(xì)胞免疫治療成為當(dāng)今血液腫瘤治療的前沿。嵌合抗原受體自然殺傷細(xì)胞（chimeric antigen receptor natural killer cell, CAR-NK）可通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)胞外抗原識(shí)別區(qū)[單鏈抗體可變區(qū)（single-chain variable fragment, scFv）]而克服其免疫逃逸缺陷。相較于CAR-T 療法，CARNK 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞具有諸多優(yōu)良特性。例如CAR-NK 細(xì)胞的毒副作用較CAR-T 低，可大大降低CAR-T 治療毒性所致的昂貴住院費(fèi)用。此外，制作CAR-NK 現(xiàn)貨型（off-the-shelf）產(chǎn)品可縮短生物制品的制作周期，并克服血液腫瘤患者因自身T 細(xì)胞功能缺陷而影響CAR-T 細(xì)胞擴(kuò)增[1]。本文對(duì)CAR-NK載體構(gòu)建、在血液腫瘤中的臨床初步應(yīng)用及面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述。

1 CAR-NK 免疫治療機(jī)制

CAR-T 細(xì)胞治療是一項(xiàng)基因工程技術(shù)，其機(jī)制為使正常T 細(xì)胞表面表達(dá)能識(shí)別腫瘤抗原的受體，通過(guò)將抗體對(duì)腫瘤抗原的高親和性和T 淋巴細(xì)胞的殺傷功能相結(jié)合，使T 細(xì)胞能識(shí)別并特異性殺傷腫瘤細(xì)胞[2-3]。CAR 是靶向目標(biāo)表面分子的重組受體，其結(jié)構(gòu)主要包括胞外抗原結(jié)合域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)3 個(gè)部分，針對(duì)每個(gè)區(qū)域的不同設(shè)計(jì)會(huì)影響CAR-T 細(xì)胞的功能。胞外區(qū)源于scFv，由輕鏈和重鏈共同組成，負(fù)責(zé)抗原的識(shí)別。目前已設(shè)計(jì)出的scFv 可識(shí)別抗原包括CD19、CD20、CD22、CD33 等?？缒^(qū)連接胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)，一般由二聚體膜蛋白組成，將CAR 結(jié)構(gòu)錨定于T 細(xì)胞膜上?？缒^(qū)的不同設(shè)計(jì)影響導(dǎo)入的CAR 基因的表達(dá)能力。此外，胞內(nèi)信號(hào)區(qū)結(jié)構(gòu)域決定著活化信號(hào)的強(qiáng)弱，直接影響殺傷效果。第一代CAR-T 使用CD3ζ 作為細(xì)胞信號(hào)結(jié)構(gòu)域，第二代CAR-T 采用CD3ζ 聯(lián)合CD28 或4-1BB，第三代CAR-T 采用CD3ζ 聯(lián)合CD28 和4-1BB胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，第四代的CAR 結(jié)構(gòu)則加入了細(xì)胞因子或共刺激配體，從而使改造過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增活性和壽命有所提升[4]。

目前多數(shù)CAR-NK 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域源自T 細(xì)胞的CAR 結(jié)構(gòu)，其中Chu 等[5]設(shè)計(jì)的針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系及原代細(xì)胞的CAR-NK 結(jié)構(gòu)采用二代CART 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。亦有研究采用CD3ζ 聯(lián)合CD28 和4-1BB 胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域作為CAR-NK 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[6]。CD28/CD3ζ 共刺激信號(hào)雖對(duì)NK 細(xì)胞同樣有效，但因NK 細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域與T 細(xì)胞存在顯著差異，NK 細(xì)胞特異CAR 結(jié)構(gòu)中胞內(nèi)信號(hào)段仍需改進(jìn)優(yōu)化。近期研究設(shè)計(jì)的針對(duì)NK 細(xì)胞特異活化受體2B4 聯(lián)合CD3ζ 以及采用DAP10、DAP12 信號(hào)作為胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，均體現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)NK 細(xì)胞活化的特性。其中，Xu 等[7]設(shè)計(jì)了針對(duì)CD5+CAR NK-92 細(xì)胞，該結(jié)構(gòu)采用NK 特異活化受體2B4 與CD3ζ 聯(lián)用的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，較4-1BB 與CD3ζ 胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?qū)D5+的慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphoblastic leukemia,CLL）及T 淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤原代細(xì)胞均具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，且該胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物體內(nèi)同樣具有較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用。此外，Toepfer 等[8]研究發(fā)現(xiàn)DAP12作為胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域與CD3ζ 同樣具有較強(qiáng)的激活下游信號(hào)的能力。以NKG2D 作為胞外域的CAR結(jié)構(gòu)可與多種腫瘤表面配體結(jié)合，Chang 等[9]利用NKG2D-DAP10-CD3ζ 構(gòu)建的NK 細(xì)胞活化受體對(duì)于ALL 及前列腺癌等腫瘤擁有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。因此利用NK 細(xì)胞自身相關(guān)激活元件設(shè)計(jì)的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域能較好地在體內(nèi)誘導(dǎo)、活化NK 細(xì)胞。

2 NK 細(xì)胞來(lái)源

2.1 NK-92 細(xì)胞系

NK-92 細(xì)胞系的表型為CD56bright/CD16neg/low，低表達(dá)CD3、CD8，高表達(dá)活化受體NKG2D、天然細(xì)胞毒受體NKp30 和NKp46 以及一系列與細(xì)胞毒有關(guān)的分子如穿孔素和顆粒酶B[10]。NK-92 是廣泛應(yīng)用的NK 細(xì)胞系，與原代NK 細(xì)胞相比缺乏殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體，一直處于活化狀態(tài)。NK-92 細(xì)胞系因缺乏或低表達(dá)CD16 而不能通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，使得NK-92 細(xì)胞系與原代NK 細(xì)胞有很大不同。有研究人員在NK-92 細(xì)胞系上過(guò)表達(dá)CD16 受體結(jié)合抗腫瘤單克隆抗體，以增強(qiáng)通過(guò)ADCC 達(dá)到清除腫瘤的效果[11]。眾多研究結(jié)果顯示，表達(dá)CAR 結(jié)構(gòu)的NK-92 細(xì)胞系較未改造的NK-92 在抗原暴露后會(huì)釋放更多的γ-干擾素[7]。此外，NK-92 基礎(chǔ)細(xì)胞系的CAR 產(chǎn)品具有無(wú)限擴(kuò)增的能力，可有效避免反復(fù)凍存對(duì)細(xì)胞的損傷，這使NK-92 細(xì)胞系有可能成為現(xiàn)貨型細(xì)胞產(chǎn)品。然而，NK-92 細(xì)胞系EBV 病毒陽(yáng)性且源自NK 細(xì)胞淋巴瘤，攜帶多種致畸基因突變，因此輸注前需要照射。NK-92 輻照后可保留細(xì)胞毒性，但體內(nèi)增殖能力較弱，輸注后7 d 即被清除，因此以NK-92 為基礎(chǔ)的CAR-NK 治療需反復(fù)多次輸注NK-92[12-13]。

2.2 臍帶血來(lái)源的NK 細(xì)胞

靜息狀態(tài)的臍帶血來(lái)源的NK 細(xì)胞較外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞表型及功能更為原始，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)且對(duì)細(xì)胞因子的刺激較敏感。臍帶血來(lái)源的NK 細(xì)胞高表達(dá)抑制性受體NKG2A，低表達(dá)激活性受體如NKp46、NKG2C 和DNAM-l 等[14]。在來(lái)自MD Anderson 的一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱa 臨床試驗(yàn)中，采用臍帶血來(lái)源的NK 細(xì)胞表達(dá)抗CD19 CAR，過(guò)表達(dá)增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的白細(xì)胞介素-15（interleukin-15,IL-15）及可誘導(dǎo)的自殺基因iCas9，用于治療復(fù)發(fā)難治的CLL、ALL 及NHL，臨床試驗(yàn)結(jié)果提示總體治療效果顯著且無(wú)明顯毒副作用[15]。

2.3 外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞

相比于臍帶血來(lái)源的NK 細(xì)胞，外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞更加成熟，增殖能力減弱而功能性更強(qiáng)[16]。外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞作為過(guò)繼細(xì)胞治療的安全性已被多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，其中有自體或異體NK 細(xì)胞來(lái)源的，亦有人類白細(xì)胞抗原相合或不相合NK 細(xì)胞，殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體配體匹配或不匹配的供者NK 細(xì)胞被用于臨床試驗(yàn)[17-20]。外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞通常采自正常健康供者外周血有核細(xì)胞，去除CD3 和CD19 后通過(guò)細(xì)胞因子IL-2 及IL-1 體外擴(kuò)增進(jìn)而輸注入患者體內(nèi)。NK 細(xì)胞的擴(kuò)增方式主要有兩種：細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的體外擴(kuò)增及滋養(yǎng)層細(xì)胞為基礎(chǔ)的擴(kuò)增。

2.4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的NK 細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）來(lái)源的NK 細(xì)胞同時(shí)擁有外周血來(lái)源的NK細(xì)胞和NK 細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)，不僅性質(zhì)均一，可通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)染而大量擴(kuò)增，還無(wú)需輻照即可注入體內(nèi)。與NK-92 細(xì)胞一樣，iPSC 低表達(dá)CD16 且高表達(dá)NKG2A，過(guò)表達(dá)CD16 受體結(jié)合抗腫瘤單克隆抗體，發(fā)揮ADCC 作用達(dá)到清除腫瘤的效果[21]。目前僅在卵巢癌的移植鼠模型中證實(shí)iPSC 來(lái)源的NK 細(xì)胞過(guò) 表 達(dá)NKG2D、2B4 及CD3ζ 信 號(hào) 域（NK-CARiPSC-NK），與外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞及利用T 細(xì)胞CAR 結(jié)構(gòu)域的iPSC 來(lái)源的NK 細(xì)胞（T-CAR-iPSCNK）相比，利用NK 細(xì)胞特異性信號(hào)結(jié)構(gòu)域的NKCAR-iPSC-NK 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及延長(zhǎng)小鼠生存能力顯著增強(qiáng)[22]。

3 CAR-NK 細(xì)胞與CAR-T 細(xì)胞治療比較

目前國(guó)際上注冊(cè)的有關(guān)CAR-T 臨床試驗(yàn)達(dá)200 余項(xiàng)，CAR-T 對(duì)血液腫瘤治療的優(yōu)勢(shì)在于：①特異性抗原識(shí)別及主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）分子非依賴性。與傳統(tǒng)T 細(xì)胞相比，CAR-T 細(xì)胞可利用該新型受體特異性攻擊表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞，且這種免疫識(shí)別無(wú)需MHC分子的介導(dǎo)[23]。該特性可在一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)免疫治療無(wú)法識(shí)別不表達(dá)MHC 的腫瘤細(xì)胞的短板。②抗原識(shí)別種類廣泛。CAR-T 細(xì)胞可識(shí)別各種類型的潛在抗原，包括脂類、蛋白類、碳水化合物類抗原，且可聯(lián)合特異性抗體共同識(shí)別不同類型抗原[24]。然而，CAR-T 細(xì)胞治療存在毒副作用較大、制備費(fèi)用昂貴、制作周期較長(zhǎng)、復(fù)發(fā)后再次輸注療效欠佳、在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）及CLL 患者體內(nèi)擴(kuò)增受限等問(wèn)題，限制了其在其他血液腫瘤中的廣泛應(yīng)用。CAR-NK 細(xì)胞的主要優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：①多種機(jī)制有效抗腫瘤殺傷效應(yīng)。CAR-NK 細(xì)胞可通過(guò)CAR 依賴性和NK 細(xì)胞受體依賴性機(jī)制殺死靶細(xì)胞，以消除腫瘤相關(guān)抗原陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞或表達(dá)NK 細(xì)胞受體配體的腫瘤細(xì)胞。既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AML 患者異基因造血干細(xì)胞移植后通過(guò)移植物抗腫瘤效應(yīng)達(dá)到抗腫瘤作用，因腫瘤抗原表位MHC-Ⅰ分子表達(dá)丟失導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞[17,25]。CAR-NK 細(xì)胞無(wú)自身抗原表達(dá)，執(zhí)行殺傷功能時(shí)無(wú)需被激活，且無(wú)限制性，因此可識(shí)別MHC-Ⅰ陰性的腫瘤細(xì)胞而保留自身的天然殺傷作用[26]。腫瘤干細(xì)胞低表達(dá)MHC-Ⅰ分子，同時(shí)表達(dá)激活性受體NKp30、NKp44 和NKG2D配體，這些配體的表達(dá)可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)的NK 細(xì)胞殺傷作用的敏感性。②安全性及操作簡(jiǎn)易。同種異體的NK 細(xì)胞臨床應(yīng)用較為安全，無(wú)引起移植物抗宿主?。╣raft versus host disease,GVHD）的風(fēng)險(xiǎn)[27]。目前CAR-T 細(xì)胞治療的主要相關(guān)毒副作用如細(xì)胞因子綜合釋放征（cytokine release syndrome,CRS）和神經(jīng)毒性是導(dǎo)致患者病死率增加及治療費(fèi)用昂貴的重要因素。CAR-NK 細(xì)胞可作為現(xiàn)貨型產(chǎn)品生產(chǎn)，制作周期較短，臨床試驗(yàn)及臨床前期試驗(yàn)結(jié)果均提示其治療后的毒副作用較小[4]。

4 CAR-NK 臨床前研究及臨床轉(zhuǎn)化研究

4.1 AML

一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，外周血來(lái)源的記憶性NK 細(xì)胞在AML 患者體內(nèi)擴(kuò)增良好，對(duì)AML細(xì)胞系及AML 原代細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)[28]。9例患者中5例有治療反應(yīng)，其中4例達(dá)到完全緩解。因此，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶性NK 細(xì)胞未來(lái)有望成為復(fù)發(fā)難治AML 的有效免疫治療方法[28]。CD33在正常及腫瘤干細(xì)胞表面均有表達(dá)，Tang 等[29]設(shè)計(jì)出抗CD33 的CAR-NK-92 細(xì)胞用以治療1例14 歲AML-ETO(+)復(fù)發(fā)難治AML-M4 患者，該患者為異基因造血干細(xì)胞移植后15 個(gè)月復(fù)發(fā)?；颊哂诮邮茴A(yù)處理后第1、3、5 天分別輸注抗CD33 的CAR-NK-92細(xì)胞（輸注劑量分別為3×108、6×108、1×109個(gè)）。輸注后第2 天患者體溫升至38.5 ℃；輸注后第6 天細(xì)胞因子IL-6 及IL-10 水平顯著升高，但48 h 后很快降至正常；輸注后腫瘤壞死因子-α、IL-2、IL-4 及IL-17A 等水平無(wú)顯著變化，CRS分級(jí)1 級(jí)，輸注后1 個(gè)月骨髓涂片結(jié)果提示原始細(xì)胞比例降至0%[29]。

4.2 淋巴瘤及白血病

目前CAR-NK 細(xì)胞用于B/T 細(xì)胞淋巴瘤、B 細(xì)胞來(lái)源的白血病及多發(fā)性骨髓瘤的臨床前研究結(jié)果見(jiàn)表1。

Romanski 等[36]發(fā)現(xiàn)NK-92-CD19-CD3ζ 結(jié)構(gòu)對(duì)NK 細(xì)胞耐受的CD19 陽(yáng)性白血病細(xì)胞系及原代白血病細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)。Shimasaki 等[37]將CD19-4-1BB mRNA 電轉(zhuǎn)入NK 細(xì)胞，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了CAR-NK 細(xì)胞的殺傷作用，且回輸CAR-NK 后小鼠白血病腫瘤負(fù)荷明顯下降。除CD19靶點(diǎn)外，Chu 等[32]將CD20 CAR mRNA 電轉(zhuǎn)入外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Raji 細(xì)胞移植的NSG 小鼠模型腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得到抑制，小鼠生存期延長(zhǎng)，提示CD20 CAR-NK 細(xì)胞對(duì)CD20 陽(yáng)性Burkitt 淋巴瘤具有抗腫瘤效應(yīng)。該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)羅米地辛單獨(dú)或聯(lián)合CAR-NK 細(xì)胞對(duì)Burkitt 淋巴瘤也具有抗腫瘤效應(yīng)[33]。在CLL 原代細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，抗CD20 CAR-NK-92 細(xì)胞較美羅華及奧法木單抗具有更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)[12]。但迄今尚無(wú)抗CD20 CAR-NK的臨床轉(zhuǎn)化研究數(shù)據(jù)報(bào)道。

目前僅有少數(shù)來(lái)自臨床轉(zhuǎn)化研究的結(jié)果。其中MD Anderson 的一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱa 期試驗(yàn)（NCT03056339）將CD19 CAR-NK 細(xì)胞用于治療淋巴瘤取得了振奮人心的臨床試驗(yàn)結(jié)果[15]。該試驗(yàn)中臍帶血來(lái)源的NK細(xì)胞體外持續(xù)表達(dá)IL-15 及iCas9 自殺基因，共有11例復(fù)發(fā)或難治性CD19 陽(yáng)性腫瘤患者接受治療，包括5例CLL 和6例NHL。中位隨訪13.8 個(gè)月（2.8～20 個(gè)月），有8例（73%）患者獲得治療反應(yīng)，其中7例（64%，4例NHL 和3例CLL）病情達(dá)到完全緩解。接受抗CD19 CAR-NK 治療患者未發(fā)生CRS、神經(jīng)毒性和GVHD，炎癥細(xì)胞因子IL-6 水平較基線無(wú)顯著增加，且此次臨床試驗(yàn)中CD19 CAR-NK 細(xì)胞未達(dá)到最大耐受劑量。除B 細(xì)胞淋巴瘤及白血病外，抗CD5 CAR-NK-92 細(xì)胞在體外對(duì)CD5 陽(yáng)性細(xì)胞系和原代細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[35,38]，抗CD3 CAR-NK-92 細(xì)胞在體外對(duì)T 細(xì)胞淋巴瘤及白血病細(xì)胞系也具有較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)[39]。因此，CARNK 細(xì)胞在T 細(xì)胞淋巴瘤及白血病治療領(lǐng)域擁有較廣闊的研究前景及臨床價(jià)值。

4.3 多發(fā)性骨髓瘤

CS1 又被稱作信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員7（signaling lymphocytic activation molecule 7，SLAM7）。多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）細(xì)胞高表達(dá)CS1，而正常免疫細(xì)胞包括NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞的某些亞群和正常B 細(xì)胞均低表達(dá)CS1，骨髓細(xì)胞幾乎不表達(dá)CS1[40]。因此，研究者構(gòu)建抗CS1 的CAR 結(jié)構(gòu)并表達(dá)于CAR-NK-92 細(xì)胞系。CS1-CAR-NK-92 細(xì)胞對(duì)原代MM 細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，此外，給予NSG 免疫缺陷鼠模型尾靜脈注射CS1-CARNK 細(xì)胞可有效控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并延緩小鼠的生存期。CD138 作為MM 的基本診斷指標(biāo)，與腫瘤生長(zhǎng)和MM 疾病進(jìn)展密切相關(guān)[5]。Jiang 等[34]構(gòu)建了抗CD138 的NK-92MI 細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)CAR-NK-92MI 對(duì)CD138 陽(yáng)性的MM 細(xì)胞系及原代細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，CAR-NK-92MI 在NOD-SCID小鼠模型中的殺傷作用也較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，殺傷腫瘤過(guò)程中會(huì)釋放更多的顆粒霉素B、γ-干擾素且CD107a 脫顆粒活性增強(qiáng)。除上述CS1 和CD138 靶點(diǎn)外，抗CD38、BCMA、CD269 等也是CAR-NK 細(xì)胞可能的特異性治療靶點(diǎn)，但目前尚無(wú)相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果公布。

5 CAR-NK 技術(shù)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)

5.1 轉(zhuǎn)染效率

目前CAR 基因轉(zhuǎn)染的兩大系統(tǒng)主要是無(wú)病毒的轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和基于慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染體系。原代NK 細(xì)胞利用病毒轉(zhuǎn)染體系的效率僅約15%，且反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會(huì)引起插入突變[41]，外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞采用慢病毒轉(zhuǎn)染效率亦很低。研究結(jié)果顯示，將CAR 的mRNA 電轉(zhuǎn)入原代NK 細(xì)胞，24 h 后轉(zhuǎn)染效率可達(dá)82%[42]。無(wú)病毒的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染技術(shù)可克服上述問(wèn)題，被認(rèn)為是目前較為安全的轉(zhuǎn)染方式，也是未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要研究方向。

5.2 NK 細(xì)胞體外擴(kuò)增、純化及凍存

表1 CAR-NK 免疫治療血液腫瘤的臨床前研究結(jié)果

NK 細(xì)胞體外擴(kuò)增體系是NK 細(xì)胞臨床應(yīng)用的一個(gè)主要瓶頸。目前，NK 細(xì)胞體外擴(kuò)增體系主要有飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞兩種?；陲曫B(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增體系所得NK 細(xì)胞純度高、數(shù)量多，但因飼養(yǎng)細(xì)胞多為K562 等基因修飾的腫瘤細(xì)胞，其臨床應(yīng)用仍有潛在風(fēng)險(xiǎn)顧慮；無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增體系可獲得滿足臨床需要的細(xì)胞數(shù)量和純度的NK 細(xì)胞，但個(gè)體差異較大，工藝穩(wěn)定性仍有待提高。純化外周血來(lái)源的NK 細(xì)胞是臨床應(yīng)用的前提。外周血來(lái)源的異體NK細(xì)胞可能摻雜T 細(xì)胞而引起GVHD 或淋巴細(xì)胞增殖性疾病。調(diào)節(jié)T 細(xì)胞及髓系抑制性細(xì)胞也會(huì)輸入患者體內(nèi)，從而抑制NK 細(xì)胞的活性[43]。合理凍存NK 細(xì)胞是CAR-NK 細(xì)胞成為即用型產(chǎn)品的前提。NK 細(xì)胞對(duì)于凍融異常敏感，NK 細(xì)胞的活性及細(xì)胞毒性在復(fù)蘇后會(huì)大大降低[44]。文獻(xiàn)報(bào)道，凍存NK 細(xì)胞的活性可通過(guò)添加IL-2 得以部分恢復(fù)[45]。

6 結(jié) 語(yǔ)

基于NK 細(xì)胞MHC 非限制性、泛特異性識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞及快速應(yīng)答的特點(diǎn)，CAR-NK 細(xì)胞在血液腫瘤免疫治療的應(yīng)用方面被寄予越來(lái)越多的關(guān)注和期待。但因其僅占外周血淋巴細(xì)胞的15%左右、體外擴(kuò)增培養(yǎng)技術(shù)仍不成熟、DNA 轉(zhuǎn)染效率低等技術(shù)瓶頸，臨床應(yīng)用方案等研究仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于T 細(xì)胞。新近的臨床研究及臨床前研究結(jié)果均提示CAR-NK 細(xì)胞對(duì)于AML、淋巴瘤、MM 等惡性血液腫瘤具有較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)且不良反應(yīng)較小，未來(lái)作為細(xì)胞免疫治療擁有良好的前景及研究?jī)r(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突