曹紋僑，李 鍇，喻 云，譚青青，陸 合,2，張 靜,2

剛地弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會性致病原蟲，可感染幾乎所有恒溫動物[1]，全球約1/3的人口感染弓形蟲[2]。機體的免疫狀態(tài)和弓形蟲感染的結(jié)局密切相關(guān)。免疫力正常的人群中，弓形蟲感染多為隱性感染。但是免疫力低下或免疫力受損患者的弓形蟲隱性感染可以被激活，從而引起嚴重的弓形蟲病(toxoplasmosis)。由于弓形蟲在全世界范圍內(nèi)的高感染率以及近年來艾滋病等的流行，使弓形蟲病嚴重威脅到特殊人群的健康。

肺部為弓形蟲病最常累及的器官之一[3]。弓形蟲肺炎(Toxoplasmapneumonia)是由剛地弓形蟲引起的肺部感染，是一種非典型肺炎。1963年Ludldam等[4]報道了9例肺部感染病例，其中6例為弓形蟲性肺炎。弓形蟲肺炎的病理表現(xiàn)有間質(zhì)性肺炎、壞死性肺炎、肺實變和胸腔積液[5]。由于該病發(fā)展迅速，病情嚴重，病死率高，臨床無特異表現(xiàn)，所以常常被誤診和漏診,從而使患者失去有效的治療。

已知細胞因子和細胞因子受體在宿主抗弓形蟲免疫當(dāng)中發(fā)揮重要作用,如IFN-γ[6]、IL-18[7]、CCL2[8]、CCR5[9]等。但是弓形蟲感染肺組織后，哪些細胞因子發(fā)生了變化并影響了肺炎的發(fā)生發(fā)展目前還不明確。本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，比較了感染弓形蟲前后小鼠肺組織轉(zhuǎn)錄組的變化。通過分析篩選到兩條與細胞因子相關(guān)的通路：Cytokine-cytokine receptor interaction 和Chemokine singnaling pathway信號通路。從這兩條通路中顯著富集的24個基因中篩選得到10個關(guān)鍵驅(qū)動基因，它們均是胞因子或細胞因子受體。這些關(guān)鍵驅(qū)動基因有望為弓形蟲肺炎的診斷和治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1剛地弓形蟲和小鼠 剛地弓形蟲RH株為本實驗室連續(xù)傳代培養(yǎng)，純化收集并保存在液氮中。BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2主要試劑和儀器 TRIZOL，美國Invitrogen 公司生產(chǎn)。三氯甲烷，異戊醇，異丙醇，中國西隴化工生產(chǎn)。DNA提取試劑盒，中國天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。熒光定量PCR試劑盒，中國寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。BGISEQ-500平臺，中國華大基因生產(chǎn)。Bio Rad CFX96 Real-time PCR Detection system，美國伯樂公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1急性弓形蟲感染小鼠模型的構(gòu)建及肺組織樣本采集 BALB/c小鼠6只，雌性，8周，隨機分為兩組，每組3只。按腹腔注射弓形蟲速殖子的方法構(gòu)建急性弓形蟲感染小鼠模型。實驗組每只小鼠接種含800個速殖子的弓形蟲懸液0.2 mL，對照組注射生理鹽水0.2 mL。當(dāng)小鼠出現(xiàn)典型弓形蟲感染癥狀時，處死小鼠。在無盡可能外源性RNA酶和DNA酶條件下，迅速取出小鼠肺組織，在生理鹽水中快速洗去血液，將組織剪成黃豆大小，立即放進液氮中凍存?zhèn)溆谩Ｈ嶒灲M和對照組小鼠肺組織提取DNA，根據(jù)文獻[10]獲得弓形蟲B1基因引物序列，F(xiàn):5′-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3′, R:5′-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3′，從小鼠肺組織DNA中擴增長度為194 bp的弓形蟲B1基因片段，驗證弓形蟲感染小鼠模型是否構(gòu)建成功。

1.2.2總RNA提取 取實驗組和對照組小鼠肺組織，每份樣品約50 mg，在液氮保護下將肺組織研磨成粉末，采用TRIZOL-Reagent按照說明書操作提取小鼠肺組織總RNA。采用Fragment analyzer檢測總RNA濃度和RNA的完整性指標：28s/18s和 RNA 質(zhì)量指數(shù)(RNA quality number,RQN)。

1.2.3mRNA純化分離及cDNA文庫構(gòu)建 取消化的總 RNA樣品，適溫變性打開其二級結(jié)構(gòu)，使用oligo(dT)磁珠富集mRNA。在mRNA中加入打斷試劑，將mRNA片段化。以片段化后的mRNA為模板，依次合成第一鏈cDNA和二鏈cDNA。配制反應(yīng)體系，修復(fù)雙鏈cDNA末端，并在3′末端加上A堿基，配制接頭連接反應(yīng)體系，使接頭與cDNA連接。配制PCR反應(yīng)體系，對連接產(chǎn)物進行擴增，并回收產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物變性為單鏈，配制環(huán)化反應(yīng)體系，得到單鏈環(huán)形產(chǎn)物，消化掉未被環(huán)化的線性DNA分子，得到最終的文庫。

1.2.4文庫質(zhì)檢和高通量測序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測cDNA文庫的片段大小及濃度。質(zhì)檢合格后，單鏈環(huán)狀DNA分子通過滾環(huán)復(fù)制，形成一個包含200多個拷貝的DNA納米球(DNB)將得到的DNBs采用高密度DNA納米芯片技術(shù)，加到芯片上的網(wǎng)狀小孔內(nèi)。采用BGISEQ-500測序平臺，通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS)進行測序，得到150 bp的測序讀長。

1.2.5差異表達基因的篩選和功能分析 為保證結(jié)果的可靠性，在數(shù)據(jù)分析之前，使用SOAP2[11]將Raw reads過濾得到Clean reads。Clean reads的低質(zhì)量堿基序列不超過20%，接頭污染序列不超過5%，未知N含量過高序列不超過5%。使用HISAT2(v2.0.4)[12]將Clean reads比對到小鼠參考基因組(nm10)。使用Bowtie2(v2.2.5)[13]將Clean reads比對到參考編碼基因集，使用RSEM(v1.212)[14]計算基因的表達水平。使用DESeq2(v1.4.5)[15]，以|Log2fold change|≥3，Q value(adjusted p value)<0.01的標準篩選差異表達基因。使用Heat map builder[16]繪制差異基因表達量聚類熱圖。對差異表達基因進行GO富集分析、KEGG富集分析和KDA分析，差異顯著性閾值設(shè)定為Q value<0.05。

1.2.6差異表達基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證 取步驟1.2.2提取的小鼠肺組織總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，引物見表1。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系構(gòu)成：TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×) 12.5 μL、上下游引物各1 μL(終濃度為0.4 μmol/L)、cDNA模板2 μL、去離子水8.5 μL。擴增循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s,共39個循環(huán)；95 ℃ 10 s，熔解曲線：從65 ℃到95 ℃每次增加0.5 ℃。以2-△△CT計算基因的相對表達量。采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1成功構(gòu)建弓形蟲急性肺部感染小鼠模型 實驗組小鼠在接種弓形蟲后第5 d出現(xiàn)典型的弓形蟲感染癥狀：顫抖，豎毛，弓背，活動量減少。實驗組小鼠腹部隆起，取出的腹水中觀察到大量弓形蟲速殖子。弓形蟲B1基因擴增的目的片段長度為194 bp,實驗組小鼠肺組織均檢測到弓形蟲B1基因片段(圖1)。

M:Maker; RH_1、RH_2、RH_3為實驗組，Con_1、Con_2、Con_3為對照組。圖1 小鼠肺組織弓形蟲B1基因檢測Fig.1 Detection of the T.gondii B1 gene in lungs of mice

2.2測序結(jié)果 所有樣本RQN均>8，28 s/18 s均大于1.4，所有樣本濃度均大于120 ng/μL(表2)。BGISEQ-500測序平臺一共檢測了6個樣本，平均每個樣本產(chǎn)出Clean reads數(shù)為45.51G，總共檢測到17 828個基因。Clean reads比對到小鼠參考基因組的平均比對率為94.39%,唯一比對到小鼠參考基因組的平均比對率為85.70%。Clean reads Q20在96.86%～97.34%，Clean reads Q30在88.57%～89.94%，分別代表堿基正確識別率在90%和99.9%的堿基占總體堿基的百分比(表3)。

表1 qPCR驗證基因引物Tab.1 Primers used for qPCR validation

表2 總RNA質(zhì)量檢測Tab.2 Examination of total RNA quality

表3 高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量 Tab.3 High throughput RNA-seq data quality

2.3差異表達基因篩選和功能分析 根據(jù)設(shè)定的篩選條件(|Log2FC|≥3，Q value<0.01)總共挖掘到286個差異表達基因，其中上調(diào)基因234個，下調(diào)基因52個。從差異基因表達量聚類熱圖(圖2)可以看出大部分基因和免疫系統(tǒng)、信號分子相互作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。說明與免疫相關(guān)的基因在宿主抵抗弓形蟲感染時發(fā)揮了重要作用。

圖2 總差異表達基因的表達量聚類熱圖Fig.2 Cluster analysis heat map of all DEGs

差異表達基因的GO注釋分為生物過程(Biological process, BP)、細胞組分(Cellular component, CC)和分子功能(Molecular function, MF)，每個分類下的Top 20 GO術(shù)語見圖3。在每個分類的TOP 20術(shù)語中，CC下顯著富集的術(shù)語有15個，MF和BP下的TOP20術(shù)語全部顯著富集，(Q value<0.05即視為顯著富集)。從分析結(jié)果可知，BP下的術(shù)語大多數(shù)和免疫相關(guān)如：免疫應(yīng)答(immune response)、免疫系統(tǒng)過程(immune system process)、防御應(yīng)答(defense response)、固有免疫應(yīng)答(innate immune response)、炎癥應(yīng)答(inflammatory response)等。而MF下的術(shù)語大多數(shù)和細胞因子以及GTP酶相關(guān)，如：細胞因子活性(cytokine activity)、趨化因子活性(chemokine activity)、趨化因子受體活性(chemokine receptor activity)、CXCR3趨化因子受體結(jié)合(CXCR3 chemokine receptor binding)、CCR趨化因子受體結(jié)合(CCR chemokine receptor binding)、C-C 趨化因子結(jié)合(C-C chemokine binding)、C-C趨化因子受體活性(C-C chemokine receptor activity)、GTP酶活性(GTPase activity)、GTP結(jié)合(GTP binding)。

圖3 GO富集分析柱狀圖Fig.3 GO enrichment analysis histogram

差異表達基因的KEGG富集分析結(jié)果(圖4)顯示，在TOP20 KEGG信號通路中顯著富集的通路有13條。在小鼠肺組織中，弓形蟲感染影響最顯著的通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)。綜合GO和KEGG富集分析的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)改變的KEGG通路和GO條目都和免疫相關(guān)，其中特別是細胞因子和趨化因子所占比重較大。大量研究表明細胞因子和弓形蟲感染存在密切的關(guān)系，同時趨化因子是細胞因子成員之一，因此我們選擇了Cytokine-cytokine receptor interaction和Chemokine signaling pathway中顯著富集的24個差異表達基因進行KDA分析。

圖4 KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis histogram

24個差異表達基因可以分為3個聚類：顯著升高、升高和降低，表達量聚類熱圖見圖5。其中絕大多數(shù)差異表達基因被上調(diào)，而表達降低的細胞因子只有4個，分別是Gng8、Adcy1、Gdf10和Ackr4。接下來，對這24個差異表達基因進行KDA分析(圖6)，用以在復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)里找出起關(guān)鍵作用的基因，通過分析最終篩選出10個關(guān)鍵驅(qū)動基因，分別是Tnf、Cxcl10、Il10、Ccl2、Ifng、Cxcl9、Ccr5、Ccl4、Cxcr2和Ccl7,且都上調(diào)表達。

圖5 24個差異表達基因的表達量聚類熱圖Fig.5 Cluster analysis heat map of the 24 DEGs

注：圓圈的大小代表該基因與其他基因的連接數(shù)(nodes number)，圓圈越大表示連接數(shù)越多，該基因起到的作用越關(guān)鍵。圖6 24個差異表達基因的KDA分析Fig.6 KDA analysis of the 24 DEGs

2.4實時熒光定量PCR驗證差異表達基因 從286個差異表達基因中隨機選擇10個基因用于qPCR驗證，其中8個為上調(diào)基因，2個為下調(diào)基因。qPCR數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，P值均小于0.05實驗組和對照組基因的相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明qPCR和RNA-seq結(jié)果具有一致性，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠(圖7)。

A為RNA-seq轉(zhuǎn)錄水平；B為qPCR相對表達量 圖7 差異表達基因qPCR驗證Fig.7 Identification of DEGs by qPCR

3 討 論

細胞因子是可溶性的細胞外蛋白或糖蛋白，它們通過與目標細胞表面的特定受體結(jié)合從而發(fā)揮作用，參與先天性和適應(yīng)性炎癥免疫應(yīng)答、細胞生長、分化、死亡等過程。本研究將細胞因子與細胞因子受體互作和趨化因子信號通路下共24個差異表達基因進行了KDA分析，篩選得到10個關(guān)鍵驅(qū)動基因：Tnf(Tnfa)、Cxcl10、Il10、Ccl2、Ifng、Cxcl9、Ccr5、Ccl4、Cxcr2和Ccl7，它們在弓形蟲感染小鼠的肺組中均上調(diào)表達。

弓形蟲感染引起Th1型免疫應(yīng)答，并伴隨大量促炎性細胞因子的釋放，如：TNF-α和IFN-γ[17]。在本研究中TNF-α和IFN-γ均上調(diào)表達，同時還是關(guān)鍵驅(qū)動基因。在急性弓形蟲感染時，TNF-α可以協(xié)同IFN-γ發(fā)揮抗弓形蟲作用，IFN-γ也可以誘導(dǎo)TNF-α的釋放。IFN-γ是抵抗弓形蟲感染的主要的介導(dǎo)者[6]。在小鼠，IFN-γ可以誘導(dǎo)GTPases家族的IRGs和GBPs合成，IRGs和GBPs可以破壞弓形蟲納蟲泡膜(PVM)[18-20]，使弓形蟲暴露于宿主免疫系統(tǒng)并將其殺死。小鼠GBPs家族含有11個成員，Gbp1-Gbp11，在本實驗中除Gbp9、Gbp11外，其他基因均顯著上調(diào)，而IRGs家族成員則全部顯著上調(diào)。在感染弓形蟲的小鼠肺組織中，IFN-γ誘導(dǎo)表達的GBPs和IRGs家族成員發(fā)生了顯著上調(diào)，由此說明弓形蟲RH株感染的小鼠肺組織中，GBPs和IRGs可能是IFN-γ誘導(dǎo)的主要抗弓形蟲效應(yīng)分子。

在本研究中，顯著差異表達的趨化因子和趨化因子受體主要來自于CXC亞家族、CC亞家族以及其對應(yīng)的受體家族。其中，Cxcl9、Cxcl10屬于CXC亞家族，Ccl2、Ccl4和Ccl7屬于CC亞家族，Cxcr2屬于CXC亞家族受體，Ccr5屬于CC亞家族受體。Cxcl9和Cxcl10可在IFN-γ的誘導(dǎo)下大量表達，兩者的受體都是Cxcr3。在GO 富集分析的MF板塊，Cxcr3受體結(jié)合(Cxcr3 chemokine receptor binding)被顯著富集到。在弓形蟲慢性感染的小鼠腦組織中，Cxcl9和Cxcl10的水平顯著升高[21]，Cxcl9可以募集T細胞到感染灶，從而阻斷慢性感染被激活[22]。在小鼠弓形蟲眼病模型中Cxcl10是維持T細胞免疫應(yīng)答的重要細胞因子[23]。同時在弓形蟲感染的人血清以及豬器官中Cxcl9、Cxcl10也顯著升高[24-25]。由此可見，在弓形蟲感染后的大多數(shù)哺乳動物體中Cxcl9、Cxcl10都會上調(diào)表達，發(fā)揮募集T細胞和維持T細胞免疫應(yīng)答的作用。Ccl2和Ccl7具有趨化單核細胞到達感染灶以清除外來病原生物的作用。有研究表明，人外周血單個核細胞感染弓形蟲后，轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Ccl2顯著上調(diào)，同時檢測到Ccl2大量合成和釋放[8]。雖然目前暫無Ccl7與弓形蟲相關(guān)的研究，但是小鼠若缺陷Ccl7的受體Ccr1，小鼠對弓形蟲的易感性和死亡率都會增加[26]。Cxcr2和Ccr5作為10個關(guān)鍵驅(qū)動基因中僅有的2個趨化因子受體基因，大量的研究表明它們發(fā)揮了重要的抗弓形蟲效應(yīng)。Cxcr2缺陷小鼠,在急性弓形蟲感染早期，腹腔中性粒細胞顯著減少；在慢性感染時則腦組織包囊顯著增加，同時小鼠體內(nèi)促炎性細胞因子IFN-γ、TNF-α水平也顯著降低[27]。Ccl4是Ccr5的天然配體之一，在本研究中CD4、CD5均為關(guān)鍵驅(qū)動基因。NK細胞是弓形蟲感染早期IFN-γ的主要來源，而Ccr5是NK細胞表面發(fā)揮趨化NK細胞到感染灶的主要趨化因子受體。在Ccr5基因缺陷的小鼠體內(nèi)，弓形蟲感染灶周圍的NK細胞顯著減少，體內(nèi)蟲荷量增加，腸道和肝臟損傷加重，另外還出現(xiàn)了嚴重的脂肪代謝紊亂，最終導(dǎo)致小鼠死于蟲血癥[28]。

弓形蟲感染宿主后誘導(dǎo)機體釋放了大量的促炎細胞因子，產(chǎn)生了強烈的免疫反應(yīng)，但是大量的炎性細胞因子可以造成組織和器官嚴重的病理損傷。此時機體會釋放許多的抗炎性細胞因子如IL-10、IL-27和TGF-β，以維持體內(nèi)的免疫平衡。IL-10缺陷小鼠因不能中和IFN-γ引起的炎性作用，在急性感染期常由于嚴重的組織病理損傷而死亡[29]。在本研究中IL-10顯著上調(diào)表達，同時還是關(guān)鍵驅(qū)動基因,說明IL-10可能是弓形蟲肺部感染負調(diào)控的主要效應(yīng)分子。

在弓形蟲感染的小鼠肺組織中，眾多與免疫相關(guān)的基因發(fā)生了上調(diào)，其中細胞因子和細胞因子受體變化最為顯著。本研究通過生物信息學(xué)分析，從Cytokine-cytokine receptor interaction和Chemokine signaling pathway 2條通路中，篩選到10個關(guān)鍵驅(qū)動基因：Tnf、Cxcl10、Il10、Ccl2、Ifng、Cxcl9、Ccr5、Ccl4、Cxcr2和Ccl7，這些基因在弓形蟲感染肺組織中的作用還有待進一步深入研究。

利益沖突：無