陳瑤瑤,趙曉南，孫艷紅，張美玲，周潔楠

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是披膜病毒科甲病毒屬的單股正鏈RNA病毒，主要通過(guò)白紋伊蚊和埃及伊蚊叮咬傳播[1]。1952年，在坦桑尼亞首次檢測(cè)到CHIKV[2]，隨后在烏干達(dá)和許多其他撒哈拉以南非洲國(guó)家均發(fā)現(xiàn)了CHIKV，在過(guò)去的5年里，更是以驚人的速度擴(kuò)散到亞洲、非洲、歐洲和美洲的100多個(gè)國(guó)家，成為日益嚴(yán)重的全球健康威脅[3]。1986年云南省從蝙蝠腦組織中分離出一株CHIKV毒株[4]，這是我國(guó)首次分離得到CHIKV毒株，2008年在廣東出現(xiàn)了首例輸入性基孔肯雅熱病例[5]，隨后在我國(guó)的其他地方不斷出現(xiàn)輸入性病例和本地疫情[6-8]。云南省位于中國(guó)西南邊陲，與多個(gè)東南亞國(guó)家接壤，經(jīng)濟(jì)貿(mào)易往來(lái)及國(guó)際間旅行日益頻繁, 存在極大輸入性風(fēng)險(xiǎn)，再加上豐富多樣的氣候類型，適合伊蚊生存繁殖的自然地理環(huán)境[9]，云南省基孔肯雅熱流行風(fēng)險(xiǎn)正在加劇。2019年6月，通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，云南省確診1例基孔肯雅熱輸入性病例，本研究通過(guò)對(duì)CHIKV進(jìn)行分離培養(yǎng)和全基因組測(cè)序，分析病毒遺傳進(jìn)化趨勢(shì)及氨基酸位點(diǎn)變異情況，為云南省防控基孔肯雅熱提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 2019年6月27日采集得到1名緬甸仰光飛抵昆明長(zhǎng)水機(jī)場(chǎng)的旅客血清，送至云南省疾病預(yù)防控制中心排查基孔肯雅熱。

1.2核酸提取及real-time RT-PCR檢測(cè) 采用江蘇碩世全自動(dòng)核酸提取儀和病毒核酸提取試劑盒(貨號(hào)：SDK60104)進(jìn)行核酸提取，病毒核酸檢測(cè)使用基孔肯雅病毒檢測(cè)試劑盒(江蘇碩世，貨號(hào)：JC40104)，具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3病毒分離培養(yǎng) 將患者血清接種于80%單層非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，加入含有2%胎牛血清、7.5%碳酸氫鈉及雙抗的維持液(維持液基質(zhì)DMEM)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察病變情況。收獲盲傳第2代72 h培養(yǎng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4測(cè)序引物 設(shè)計(jì)參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，合成基孔肯雅全基因組擴(kuò)增引物，對(duì)CHIKV進(jìn)行分段擴(kuò)增，以便后續(xù)測(cè)序。引物由昆明擎科生物公司合成。

1.5全基因組測(cè)序 使用TAKARA One Step RT-PCR試劑盒(貨號(hào)：RR057)對(duì)病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×1 step Buffer 12.5 μL，1 step Enzyme mix 1 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L)1.5 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)1.5 μL，無(wú)酶水6 μL，模板2.5 μL，反應(yīng)體系總體積25 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至昆明擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6序列拼接和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹構(gòu)建及分析 使用DNAStar 7.1軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，在NCBI上下載參考株序列，通過(guò)Mega5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建。采用Neighbor-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。

2 結(jié) 果

2.1流行病學(xué)調(diào)查 患者趙某，男，43歲，云南人。在緬甸經(jīng)商，經(jīng)常往返于昆明-仰光?；颊哂?019年1月前往仰光，2019年6月26日返回昆明，期間當(dāng)?shù)赜形脗骷膊∩l(fā)，自述有蚊蟲叮咬史。

2.2Real-time RT-PCR檢測(cè) 病例血清標(biāo)本核酸檢測(cè)顯示CHIKV陽(yáng)性，Ct值為15.73。

2.3病毒分離鑒定 將1代細(xì)胞培養(yǎng)物接種細(xì)胞后，觀察細(xì)胞病變情況，細(xì)胞逐漸融合、堆聚，在72 h后病變達(dá)到80%，將細(xì)胞板置于-70 ℃冰箱。反復(fù)凍融2次，取200 μL融解后的培養(yǎng)物進(jìn)行核酸提取及病毒核酸檢測(cè)。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示CHIKV陽(yáng)性，Ct值為9.14。見圖1。

圖1 CHIKV感染Vero細(xì)胞病變情況Fig.1 Cytopathogenic effects after Vero cells infection with CHIKV

2.4全基因組測(cè)序 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接處理后獲得CHIKV全基因組序列，命名為YN0627，全長(zhǎng)為11 586 nt，其基因結(jié)構(gòu)符合CHIKV的基因特征，基因組內(nèi)包含兩個(gè)完整的編碼框，分別編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1-nsP2-nsP3-nsP4)和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C-E3-E2-6K-E1)，兩個(gè)編碼框之間有一個(gè)非編碼的連接區(qū)，長(zhǎng)度為65個(gè)核苷酸。非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)共包含7 425個(gè)核苷酸，編碼2 474個(gè)氨基酸；結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)共包含3 747個(gè)核苷酸，編碼1 248個(gè)氨基酸，均不存在堿基的插入和缺失。5′端起始的76個(gè)核苷酸和3′端273個(gè)核苷酸為非編碼區(qū)。

2.5全基因組進(jìn)化分析 通過(guò)對(duì)YN0627的全基因組以及編碼區(qū)進(jìn)行BLAST N檢索，得到序列相似度最高的均為CHIKV。將YN0627的基因組編碼區(qū)與選取的參考序列進(jìn)行多重比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示YN0627與來(lái)自泰國(guó)的MN630017、MK468801、來(lái)自中國(guó)的MH400249、來(lái)自孟加拉的MF773566等毒株關(guān)系密切，并與東中南非洲遺傳譜系(East, Central and South African Lineage, ECSA)的其他流行株聚集在一起，顯示出緊密的進(jìn)化相關(guān)性，見圖2。與ECSA譜系內(nèi)的參考序列進(jìn)行多重比對(duì)，YN0627的編碼區(qū)與參考序列相比，核苷酸同源性為85.24%～99.96%，氨基酸同源性為95.34%～99.97%；與非洲原型株S27比較，核苷酸同源性為97.33%，氨基酸同源性為98.53%。

圖2 CHIKV-YN0627系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogeny of CHIKV-YN0627

2.6基因位點(diǎn)分析 在YN0627的 5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的編碼區(qū)域中，一共觀察到28個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)。未觀察到E1中的對(duì)白紋伊蚊的適應(yīng)性突變A226V，但是有E1：D284E、E1：K211E、E2：V264A和E2：I211T突變，其他一些位點(diǎn)，例如可能影響氨基酸pH值的E2：K252Q[5]沒有被觀察到；E2蛋白上兩個(gè)重要糖基化抗原位點(diǎn)263N和345N呈高度保守[10]，見表1。

3 討 論

系統(tǒng)進(jìn)化分析通過(guò)不同的地理位置將CHIKV分為3個(gè)遺傳譜系：東中南非洲(ESCA)譜系、亞洲(Asian)譜系和西非(West Africa)譜系。從本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果來(lái)看，YN0627與東南亞各國(guó)毒株關(guān)系密切，屬于ESCA遺傳譜系，與流行病學(xué)調(diào)查資料結(jié)果相一致，是來(lái)自東南亞國(guó)家緬甸的輸入性病例。中國(guó)分離得到大部分基孔肯雅毒株都屬于輸入型的，因此國(guó)內(nèi)各毒株間進(jìn)化關(guān)系并不是特別密切，但是我們依舊需要對(duì)該病毒進(jìn)行密切關(guān)注和更加深入的研究，特別應(yīng)該關(guān)注能夠增強(qiáng)病毒毒力和適應(yīng)性突變的位點(diǎn)。

表1 CHIKV YN0627結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸變異位點(diǎn)分析Tab.1 Amino acid variation sites in the structural protein of CHIKV-YN0627

CHIKV共編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白不會(huì)包裝到最終病毒體中，結(jié)構(gòu)蛋白才是宿主體液免疫應(yīng)答和大多數(shù)疫苗的關(guān)鍵靶點(diǎn)[11]，因此本研究著重對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)YN0627沒有E1：A226V的突變，而觀察到了E1：K211E、E1：D284E、E2：V264A和E2：I211T突變。E1：A226V突變?cè)?005年首次被發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的突變能夠提高CHIKV在白紋伊蚊中的適應(yīng)性[12]，在東南亞白紋伊蚊為優(yōu)勢(shì)種群的多個(gè)地區(qū)，都分離到了有E1：A226V突變的CHIKV毒株[13]。但是有研究證明，在E1：226A的基礎(chǔ)上引入E1：K211E和E2：V264A的突變，能使CHIKV在感染埃及伊蚊14天后，其體內(nèi)的滴度成倍數(shù)增長(zhǎng)：在中腸中增加13倍，在腿和翅膀中增加15倍，在唾液中增加62倍[14]。有學(xué)者在云南省邊境地州開展蚊媒媒介的相關(guān)監(jiān)測(cè)和研究，結(jié)果表明，白紋伊蚊在云南省內(nèi)分布廣泛，但是近年來(lái)埃及伊蚊的分布區(qū)域呈現(xiàn)出逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)，埃及伊蚊孳生優(yōu)勢(shì)較白紋伊蚊明顯，有取代白紋伊蚊成為優(yōu)勢(shì)種及不斷向周邊區(qū)域擴(kuò)散和定殖的分布趨勢(shì)[15-16]，綜合分離株YN0627中存在E1：226A的基礎(chǔ)上的E1：K211E和E2：V264A，文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示這些突變能夠提高CHIKV對(duì)埃及伊蚊的適應(yīng)性，提示云南省應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)CHIKV的監(jiān)測(cè)和研究。

在YN0627中還觀察到了E1：D284E和E2：I211T突變，E1：D284E對(duì)膜融合和病毒體的裝配有很重要的作用[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，E2：I211T突變?cè)谧罱l(fā)現(xiàn)的ESCA譜系中普遍存在，這表明E2：I211T的突變對(duì)于CHIKV適應(yīng)ECSA流行區(qū)域普遍存在的某些特定條件非常重要[17]。我們還觀察到了結(jié)構(gòu)蛋白上的其他變異如C：P23S，C：V27I，E3：I23T，6K：V8I，E1：M269V等等，但是這些位點(diǎn)對(duì)病毒功能的影響尚不清楚。

基于我國(guó)的基孔肯雅熱疫情一直以輸入性的散發(fā)病例為主，國(guó)內(nèi)人群缺乏免疫力，普遍易感，且目前尚無(wú)有效的疫苗和抗病毒藥物，做好對(duì)CHIKV感染源頭的防控，即防蚊滅蚊工作至關(guān)重要。還需加強(qiáng)重點(diǎn)人群宣教，到高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)旅居的人應(yīng)采取基本的防蚊措施，返回時(shí)如感不適，就醫(yī)時(shí)應(yīng)主動(dòng)提供自身旅居史。同時(shí)需加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員培訓(xùn)，提高醫(yī)務(wù)人員對(duì)疾病的識(shí)別能力和對(duì)傳染病的敏感性，防止本地病例的產(chǎn)生。

利益沖突：無(wú)