寇 娜，郝 鈺，趙瑞珍，趙子珺，王 丹，唐啟盛

卒中后焦慮(post stroke anxiety，PSA)是發(fā)生于腦卒中后以焦慮為主要表現(xiàn)的情緒障礙，發(fā)病率呈逐年增長趨勢，對病人的生存質(zhì)量及死亡風(fēng)險影響較大，故有效控制和治療至關(guān)重要[1]。本團(tuán)隊前期研究證實p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38-MAPK)在腦卒中后病理變化和轉(zhuǎn)歸的過程中占有重要地位，且對腦神經(jīng)炎癥應(yīng)答有一定的影響[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，運用頤腦解郁方治療腦卒中后精神疾病療效顯著[3]。因此，本研究旨在探討炎性因子及p38-MAPK信號蛋白表達(dá)與卒中后焦慮的關(guān)系及頤腦解郁方的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠90只，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[動物許可證：SCXK(京)2016-0006]。大鼠分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)實驗環(huán)境1周，室溫22～25 ℃，相對濕度55%～65%，自由進(jìn)食、飲水，普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 動物模型建立及分組 大鼠卒中后焦慮模型參考Longa等[4]報道的線栓造模方法，手術(shù)過程中室內(nèi)溫度保持在27～30 ℃，并采用數(shù)字量表評價大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)神經(jīng)功能，選擇術(shù)后24 h評分為7～12分中度損傷大鼠，采用不確定性空瓶飲水應(yīng)激制備卒中后焦慮大鼠模型。實驗將30只卒中后焦慮大鼠隨機分為模型組、治療組，每組15只。另選取15只MCAO大鼠不予應(yīng)激干預(yù)作為卒中組，15只正常大鼠作為正常組。其中治療組大鼠灌胃中藥頤腦解郁方，正常組、卒中組、模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，灌胃生理鹽水，每日劑量10 mL/kg，連續(xù)4周。動物保健及使用經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會實驗協(xié)議批準(zhǔn)。

1.3 主要試劑及藥品 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)放免試劑盒由北京華英公司提供；p38-MAPK抗體(單克隆抗體，兔抗鼠)購于上海Abcam公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒、50x蛋白酶抑制劑混合物購于北京凱基生物公司；5x SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PAGE膠促凝劑、過硫酸銨及封閉專用脫脂奶粉購買于北京普利萊公司；細(xì)胞裂解液、5x Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10x電轉(zhuǎn)液、10x封閉-洗滌緩沖液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液及30%雙丙烯酰胺溶液購買于北京Solarbio公司；蛋白免疫印跡(Western Blot)一抗稀釋液購于上海Beyotime公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購于Millipore公司；蛋白質(zhì)分子量Marker購于Thermo公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及內(nèi)參抗體購于北京博奧森公司；化學(xué)發(fā)光劑購于美國GE Healthcare公司；戊巴比妥購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；二甲苯購于天津市進(jìn)豐化工有限公司；無水乙醇購于北京化工廠等。頤腦解郁方配方顆粒劑(刺五加20 g、梔子10 g、五味子10 g、郁金10 g)由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。灌胃劑量按照成人用量(每天20 mg/60 kg)的7倍計算大鼠用量濃煎，儲存于4 ℃冰箱中備用。灌胃前加熱，大鼠每日劑量為10 mL/kg，早晚各灌胃1次。

1.4 主要儀器 超純水儀(型號D7411)購于美國Barnstead公司；超聲破碎儀(型號YD-6L)購于金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；轉(zhuǎn)移脫色搖床(型號TS-8型)購于海門市其林貝爾公司；電子天平(型號MP5002)購于上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；微型電動勻漿器(型號AG285)購于美國Sigma公司；電泳儀(型號DYY-8C)購于北京市六一儀器廠；垂直電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀購于美國Bio-Rad公司等。

1.5 曠場實驗 大鼠于末次灌胃后行曠場實驗，選取大小為100 cm×100 cm×40 cm的敞箱，四壁涂黑，底面平均劃分為25塊方格，實驗時將大鼠朝同一方向放入底部中心方格，安靜狀態(tài)下記錄大鼠中央?yún)^(qū)穿越方格數(shù)。水平次數(shù)以大鼠四肢均進(jìn)入方格為準(zhǔn)；直立次數(shù)以大鼠兩前肢離地1次為準(zhǔn)。每只大鼠測定1次，每次3 min。每只大鼠實驗結(jié)束后清理糞便，用乙醇擦拭箱底，待酒精揮發(fā)后，進(jìn)行下一只測試。

1.6 高架十字迷宮實驗 大鼠于曠場實驗后行高架十字迷宮實驗，兩條開放臂(50 cm×10 cm)、兩條閉合臂(50 cm×10 cm)以及連接開放臂和閉合臂的呈十字形的中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)組成高架十字迷宮。實驗時將大鼠放到中央?yún)^(qū)，使其頭部正對其中一側(cè)開放臂，釋放后分別記錄大鼠3 min進(jìn)入開放臂的次數(shù)、時間。每只大鼠實驗結(jié)束后清理糞便，用乙醇擦拭箱底，待乙醇揮發(fā)后，進(jìn)行下一只測試。

1.7 TNF-α、IL-1α和IL-6的含量檢測 在末次灌胃行為學(xué)檢測后，每組隨機選取12只大鼠麻醉并腹主動脈取血，4 ℃離心10 min取血清，并用全自動放免計數(shù)儀按試劑盒說明的放射免疫法測定血清TNF-α、IL-1α和IL-6的含量。

1.8 p38-MAPK蛋白檢測 在末次灌胃行為學(xué)檢測后，每組隨機選取6只大鼠麻醉并斷頭取腦皮質(zhì)和海馬體組織并迅速投入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-70 ℃冰箱保存。采用Western Blot法檢測p38-MAPK蛋白表達(dá)，其方法為將組織取出，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進(jìn)行快速研磨成粉末，制備蛋白樣品并等量加載到SDS-PAGE凝膠上制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜于PVDF膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗(p38-MAPK濃度為1∶2 000；actin濃度為1∶2 000)，封口，4 ℃封閉培養(yǎng)過夜，二抗孵育(濃度為1∶2 000)1 h后曝光掃描，利用Image Pro Plus(Roper Industries，紐約，美國)測定波段的光學(xué)密度，結(jié)果以相對密度比表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，檢測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，各組間方差齊，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)測試 與正常組比較，卒中組水平及垂直運動次數(shù)減少(P<0.01)，開放臂次數(shù)減少，開放臂時間增加，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組、治療組的水平及垂直運動次數(shù)、開放臂次數(shù)及時間均明顯減少(P<0.05或P<0.01)；與卒中組比較，模型組水平及垂直運動次數(shù)、開放臂次數(shù)及時間均降低(P<0.01)；與模型組比較，治療組水平及垂直運動次數(shù)、開放臂次數(shù)及時間均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

2.2 炎性因子應(yīng)答 與正常組比較，卒中組、模型組、治療組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量均升高(P<0.01)；與卒中組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量升高(P<0.05或P<0.01)，與模型組比較，治療組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量降低(P<0.01)。詳見表2。

表2 頤腦解郁方對血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量的影響(x±s) 單位：pg/mL

2.3 p38-MAPK蛋白的表達(dá) 與正常組比較，模型組大鼠海馬及皮質(zhì)p38-MAPK表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與卒中組比較，模型組大鼠海馬p38-MAPK表達(dá)明顯升高(P<0.05)，皮質(zhì)p38-MAPK表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，治療組大鼠海馬及皮質(zhì)p38-MAPK表達(dá)下降(P<0.01)。詳見表3、圖1。

表3 頤腦解郁方對P38-MAPK蛋白表達(dá)的影響 (x±s)

圖1 頤腦解郁方對p38-MAPK蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

卒中后焦慮與原發(fā)性焦慮障礙相似，屬中醫(yī)學(xué)“郁證”“不寐”“臟躁”“百合病”等范疇[5]。唐啟盛教授認(rèn)為，卒中后焦慮屬本虛標(biāo)實，腎精虧虛為本，氣機壅滯為標(biāo)。腎虛精水空虛，水不涵木，肝陽上亢而致氣血上逆，氣血瘀滯而致神竅閉阻，發(fā)為中風(fēng)；中風(fēng)病后，腎精虧虛，肝失所養(yǎng)，肝疏泄功能不調(diào)，氣機不暢，致肝氣郁結(jié)，肝氣郁久化熱，神受其擾，則出現(xiàn)坐立不安、煩躁擔(dān)心及汗出、心悸、手抖等一系列自主神經(jīng)癥狀的焦慮樣表現(xiàn)[3]。其治療當(dāng)以益腎調(diào)氣、解郁安神為治療原則[6]。頤腦解郁方由刺五加、五味子、郁金、梔子組成，方中刺五加益氣健脾、補腎安神，郁金疏肝解郁、行氣活血、清心安神，五味子益氣生津、補腎寧心，梔子瀉火除煩，四味藥物共奏益腎調(diào)氣、解郁安神之功效。本課題組前期研究已證實，唐啟盛教授臨床使用頤腦解郁方治療該病證有效率高達(dá)86.67%[7]。

本實驗采用不確定性空瓶飲水刺激復(fù)合腦缺血建立大鼠卒中后焦慮模型。在動物行為學(xué)方法中，高架十字迷宮能夠檢測動物焦慮模型是否建立成功。曠場實驗是利用大鼠懼怕空曠環(huán)境但又喜歡探索的心理沖突，其中大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)反映了對新環(huán)境的探究行為及適應(yīng)度[8-10]。本研究數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠傾向選擇黑暗安全環(huán)境，開放臂停留時間以及次數(shù)明顯縮短，進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)水平及垂直活動次數(shù)減少，表明不確定性空瓶飲水刺激復(fù)合腦缺血建立大鼠卒中后焦慮模型成功。與模型組比較，治療組大鼠開放臂停留時間及次數(shù)、進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)水平及垂直活動次數(shù)增加，表明頤腦解郁方能夠減輕卒中后焦慮大鼠的焦慮程度。

近年來，大量研究表明炎性因子應(yīng)答參與腦卒中及精神障礙的發(fā)病過程[11-12]。腦卒中后大量炎癥細(xì)胞浸潤和激活，引起強烈的免疫應(yīng)答，同時激活小神經(jīng)細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1α、IL-6等參與腦卒中的發(fā)病[13-14]。另有研究表明，TNF-α、IL-1α、IL-6等炎性因子由破壞的血-腦屏障進(jìn)入中樞系統(tǒng)，促進(jìn)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的活化，并引起神經(jīng)細(xì)胞丟失，促進(jìn)焦慮的發(fā)生[13]。p38-MAPK活化參與多種炎性因子反應(yīng)，而在下丘腦應(yīng)激信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中，通過外界應(yīng)激，如促炎因子或細(xì)胞應(yīng)激引起p38-MAPK磷酸化，增加神經(jīng)元細(xì)胞損傷[2]。另外，研究證實在焦慮癥狀行為時，大鼠海馬p38-MAPK表達(dá)明顯升高，而抗焦慮藥物可降低p38-MAPK及其通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善焦慮癥狀[15]。本實驗結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6濃度，海馬及皮質(zhì)p38-MAPK蛋白表達(dá)升高，與先前的研究結(jié)果[16]一致。而治療組大鼠TNF-α、IL-1α、IL-6濃度，海馬及皮質(zhì)p38-MAPK蛋白表達(dá)均較模型組降低，表明頤腦解郁方可能通過降低腦卒中引起的p38-MAPK磷酸化水平，減輕炎性因子的應(yīng)答，改善腦卒中后引起的焦慮障礙。

綜上所述，通過不確定性空瓶飲水刺激復(fù)合腦缺血成功建立卒中后抑郁大鼠模型，頤腦解郁方可改善腦卒中后引起的焦慮障礙，其機制可能與抑制下丘腦和皮質(zhì)p38-MAPK磷酸化水平，減輕炎性因子應(yīng)答相關(guān)，初步驗證p38-MAPK可能是頤腦解郁方發(fā)揮作用的一個靶點。