張 潔，楊 猛，彭維朝，陳 平，魯 瑤，馬宏光，黃林平

（中日友好醫(yī)院 普外科，北京 100029）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，美國(guó)2020年預(yù)計(jì)新發(fā)乳腺癌27640 例，高居所有女性惡性腫瘤第一位； 預(yù)計(jì)死于乳腺癌的女性患者42170例，位于女性所有惡性腫瘤死因第2 位[1]。在我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率也逐年上升[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是可在腫瘤患者外周血中檢測(cè)到。研究表明，CTCs 檢測(cè)對(duì)乳腺癌預(yù)后判斷、 治療效果評(píng)價(jià)及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)具有重要意義[3]。我們前瞻性收集了原發(fā)性乳腺癌外周血標(biāo)本，利用密度梯度離心富集及上皮標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白（pan-cytokeratin，CK）聯(lián)合上皮黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM） 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)CTCs，以探討乳腺癌外周血CTCs 陽(yáng)性率與原發(fā)腫瘤臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及患者臨床資料

前瞻性收集中日友好醫(yī)院普外科2014年1月～8月收治的乳腺癌患者術(shù)前外周血樣本41份，采集每名受試者清晨空腹外周血10ml?；颊吣挲g28～84 歲，中位年齡53 歲；≥53 歲的22 例（53.7%），＜53 歲的19 例（46.3%）。

組織病理類型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌32 例，其他類型者9 例。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)2017年第八版乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者行TNM 分期。所有入組患者均進(jìn)行電話隨訪。

1.2 密度梯度離心法富集CTC

將PBS 及人淋巴細(xì)胞分離液 （Ficoll PaqueTMPlus，GE Healthcare） 從冰箱取出放置在室溫預(yù)熱。將含EDTA 抗凝管收集的乳腺癌患者外周血10ml 加入到等體積淋巴細(xì)胞分離液中，1500r/min離心20min，吸取中間有核細(xì)胞層，加入PBS 洗滌，并再次離心，棄去上清液，加入蒸餾水洗滌并離心2 次，棄去上清液，向白色沉淀中加入PBS 200滋l，并將細(xì)胞懸浮，制作細(xì)胞涂片20 張，自然風(fēng)干后，用中性福爾馬林固定15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CTC 檢測(cè)

1.3.1 甲苯胺藍(lán)染色

吸取甲苯胺藍(lán)染色液100滋l 覆蓋已固定CTC玻片標(biāo)本，自來(lái)水流水沖洗，除去浮色。由同一檢驗(yàn)員顯微鏡下讀片。

1.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CTC

將已固定CTC 玻片浸入0.3%過(guò)氧化氫溶液中氧化15min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用0.01M PBS 洗滌5min、3 次，孵育一抗（鼠抗人pan-CK抗體1：200，兔抗人EPcam 抗體1：100），4℃過(guò)夜。0.01M PBS 洗滌5min、3 次，二抗（DAKO A液）孵育1～3h，0.01M PBS 洗滌5min、3 次。然后利用即用型DAB 液顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，0.01M PBS 終止顯色。Meyer 蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1min，流水沖走浮色。梯度酒精各脫水2min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片。由同一檢驗(yàn)員顯微鏡下讀片。

1.4 原發(fā)性腫瘤的免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判讀

（1）雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）：≥1%癌細(xì)胞核著色；ER 和（或）PR（+）定義為激素受體（+）。（2）Ki67：計(jì)數(shù)1000 個(gè)癌細(xì)胞中細(xì)胞核著色的百分?jǐn)?shù)，＜15%定義為低表達(dá)，≥15%為高表達(dá)。（3）HER-2：癌細(xì)胞中細(xì)胞膜無(wú)著色為（0）；任何比例的癌細(xì)胞顯示弱的、 不完整的細(xì)胞膜著色，或＜10%的癌細(xì)胞顯示弱的、完整的細(xì)胞膜著色為（+）；≥10%的癌細(xì)胞顯示弱的或中度的完整細(xì)胞膜著色，或＜30%的癌細(xì)胞顯示一致的、強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜著色為（++）；≥30%的癌細(xì)胞顯示一致的、強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜著色為（+++）。（0）或者（+）定義為陰性；（+++）定義為陽(yáng)性；（++）為不確定狀態(tài)，均行熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步明確HER-2 狀態(tài)。

表1 乳腺癌患者外周血CTC 與臨床病理因素的關(guān)系

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher 精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者外周血CTCs 的鑒定

利用甲苯胺藍(lán)染色及上皮細(xì)胞標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白（CK）及上皮黏附分子（Ep-CAM）檢測(cè)到了乳腺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在。甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞核藍(lán)染，可見細(xì)胞核增大的CTCs（見圖1A 箭頭所示，封三）。進(jìn)一步利用上皮細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)，結(jié)果顯示CK染色陽(yáng)性（圖1B，見封三）以及Ep-CAM 染色陽(yáng)性（圖1C，見封三）的即為CTCs。

圖1 乳腺癌患者外周血CTC的鑒定

2.2 CTC 與原發(fā)性乳腺癌臨床特點(diǎn)的關(guān)系

表1 示，乳腺癌患者外周血CTC 陽(yáng)性率在不同乳腺癌分子分型、原發(fā)腫瘤分期（T）及TNM 分期亞組之間具有顯著性差異（均P＜0.05）。而在不同患者年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Ki67、Her-2 表達(dá)、淋巴結(jié)分期（N）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）亞組間無(wú)顯著性差異（均P＞0.05）。

失訪6 例，其它患者隨訪時(shí)間73～80 個(gè)月，平均75.9±2.59 個(gè)月。CTC 陽(yáng)性組與CTC 陰性組在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡發(fā)生率方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.555）（見表1）。CTC 陽(yáng)性組在隨訪期間發(fā)生骨轉(zhuǎn)移1 例、肺轉(zhuǎn)移2 例、死亡2 例。CTC 陰性組在隨訪期間發(fā)生骨轉(zhuǎn)移1 例、死亡1 例，死于化療副作用。

3 討論

CTCs 是指自發(fā)或因診療操作由原發(fā)部位進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，并在一定條件下可發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。于1896年由澳大利亞的Ashworth首次提出。血液中CTCs 的存在與腫瘤的微轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]，已在肺[5]、結(jié)腸[6]等不同實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)且具有預(yù)后意義。目前，外周血中的CTCs 提供了一種易于獲得的惡性細(xì)胞群，是一種實(shí)時(shí)的“液體活檢”標(biāo)記物[7，8]。

我們前瞻性收集了41 例乳腺癌患者外周血，利用密度梯度離心進(jìn)行CTCs 富集，甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析以及利用上皮細(xì)胞標(biāo)記物Epcam 和CK 免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定CTCs。當(dāng)前常用的CTCs 檢測(cè)方法存在局限性，CTCs 檢測(cè)方法包括細(xì)胞富集及腫瘤細(xì)胞鑒定2 個(gè)部分。CTCs富集是CTCs 檢測(cè)的難點(diǎn)，也是CTCs 計(jì)數(shù)及分子特征檢測(cè)的技術(shù)關(guān)鍵[9]。利用CTCs 密度、體積大小、細(xì)胞剛性和電性能等物理性質(zhì)與血細(xì)胞不同，可實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs 初步篩選，其中最常用的是密度梯度離心法。物理富集方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、價(jià)格相對(duì)低、 對(duì)CTCs 活性影響小和便于進(jìn)行下游分析。CTCs 的鑒定在蛋白質(zhì)分子水平利用CTCs表面的特有分子以區(qū)分腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞，通?；诳乖贵w反應(yīng)的原理。最常用的特異性標(biāo)記物有EpCAM 和CK 等。

我們進(jìn)一步探討了CTCs 陽(yáng)性率與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明乳腺癌患者外周血CTC 陽(yáng)性率在乳腺癌分子分型、 原發(fā)腫瘤分期（T）及TNM 分期方面具有顯著性差異（P＜0.05）。而與患者年齡、 雌激素受體 （ER）、 孕激素受體（PR）、Ki67、Her-2 表達(dá)、淋巴結(jié)分期（N）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）無(wú)顯著相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。部分研究利用Cell Search 系統(tǒng)檢測(cè)乳腺癌外周血CTCs，結(jié)果表明CTCs 與患者年齡、激素受體狀態(tài)、Ki67 表達(dá)水平、病理類型、組織學(xué)分級(jí)以及原發(fā)腫瘤T 分期無(wú)明顯相關(guān)性[10，11]。本研究結(jié)果部分與其相一致。此外，研究表明[9，10]HER-2 陽(yáng)性患者外周血CTCs 陽(yáng)性率顯著高于HER-2 陰性患者。HER-2 狀態(tài)是唯一能夠可靠預(yù)測(cè)外周血CTCs 存在的原發(fā)腫瘤特征。與其相一致，本研究結(jié)果表明，HER-2 陽(yáng)性組CTCs 陽(yáng)性率為85.7%，HER-2 陰性組CTCs 陽(yáng)性率為64.7%，HER-2 陽(yáng)性組具有更高的陽(yáng)性率。既往研究[12]利用RTPCR 檢測(cè)CTCs，結(jié)果表明CTCs 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期相關(guān)。亦有研究[13]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)外周血CTCs，結(jié)果表明在腫塊直徑＞5cm、≥10 枚腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ期、HER-2 陽(yáng)性亞組中，可手術(shù)乳腺癌組外周血CTCs 陽(yáng)性率更高。德國(guó)的一項(xiàng)針對(duì)3173 例乳腺癌患者的回顧性分析[14]結(jié)果顯示，CTC 陽(yáng)性患者比CTC 陰性患者的腫瘤更大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此結(jié)果相一致，我們的研究結(jié)果表明T3+T4亞組、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期亞組CTCs 陽(yáng)性率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。N3 亞組呈現(xiàn)更高的CTCs 陽(yáng)性率（100%，6/6）。

平均隨訪6年余，CTC 陽(yáng)性組與CTC 陰性組在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡發(fā)生率方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是CTC 陽(yáng)性組在隨訪期間發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡例數(shù)明顯多于CTC 陰性組。2018年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)指南已將CTCs 列為乳腺癌預(yù)后評(píng)估工具，即乳腺癌患者外周血中存在CTCs 提示預(yù)后不良。本研究樣本量有限，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步論證該結(jié)論。

本研究不足之處是，未充分考慮到CTCs 中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的存在。EMT 是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，它能導(dǎo)致E-cadherin、EpCAM 等上皮標(biāo)志物丟失，N-cadherin 過(guò)度表達(dá)以及細(xì)胞骨架改變（如波形蛋白表達(dá)），最終產(chǎn)生表型和結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和侵襲性增強(qiáng)[15，16]。因此可能低估了CTCs 在某些病例中的陽(yáng)性率，從而對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異產(chǎn)生影響。我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步完善。