劉曉慧 馬麗霞 張晶

肝細(xì)胞癌是世界上最常見惡性腫瘤之一，是全球第二大與癌癥相關(guān)的死亡原因[1]。氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于抗抑郁治療[2]。越來越多的證據(jù)表明，氟西汀能夠抑制多種腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[3-7]。本實(shí)驗(yàn)探討氟西汀對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡影響的分子機(jī)制，為氟西汀應(yīng)用于肝細(xì)胞癌治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料與儀器

人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購自美國ATCC公司；氟西汀購自美國Sigma公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自美國Gibco公司；TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人Bcl-2單抗、Bax單抗購自美國Cell signaling公司；兔抗人Caspase-3多抗、兔抗人β-actin單抗購自美國abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)抗兔二抗購自北京中山金橋有限公司。

二、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氟西汀對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

應(yīng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取2×105個(gè)細(xì)胞鋪種于6孔板中，培養(yǎng)體系為2 mL。孵育24 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去原培養(yǎng)基，換為2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)給予不同濃度氟西汀，未加藥組為對(duì)照組，孵育24 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用碘化丙啶染色方法制成流式標(biāo)本，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。

三、熒光定量PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)

(一)細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取2×105個(gè)細(xì)胞鋪種于6孔板中，培養(yǎng)體系為2 mL。孵育24 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去原培養(yǎng)基，換為2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)給予12.5 μmoL氟西汀，未加藥組為對(duì)照組，分別孵育6 h、12 h、24 h。

(二)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR 使用RNA提取試劑盒從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定總RNA含量，然后采用20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄成cDNA， 最后用EASY Dilution將cDNA液按100、101、102、103梯度稀釋后，各取2 μL稀釋好的cDNA進(jìn)行Real-time PCR，檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增效率和管家基因(GAPDH)的擴(kuò)增效率一致。PCR引物序列如下：Bcl-2上游(5′-3′)gAgAAATCAAACAg-AggCCg，下游(5′-3′)CTgAgTACCTgAACC-ggCA；Bax上游 (5′-3′)TgACCTCACTgTgACCTTgACT，下游(5′-3′)TgAgCAATTCCAgAggCAgT。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平

根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書步驟提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配置12%SDS-PAGE分離膠，分離等量的蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在10 mL 5%脫脂奶粉中加入10 μL(1∶1 000)一抗(分別為兔抗人Bcl-2單抗，兔抗人Bax單抗，兔抗人caspase-3多抗，兔抗人β-actin單抗)，放搖床上4℃輕搖過夜。過夜后，取出PVDF膜，用1×TBST室溫?fù)u床洗3次，每次30 min。將PVDF膜放入相對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)，放搖床上，4℃輕搖2 h；用1×TBST室溫?fù)u床洗3次，每次30 min。將ECL發(fā)光試劑A 500 μL與試劑B 500 μL混合后，均勻?qū)VDF膜浸透，將其包于保鮮膜中，反應(yīng)5 min。在暗室內(nèi)取出膠片，放在被保鮮膜覆蓋的PVDF膜上，蓋上X-線片夾板，根據(jù)條帶亮度調(diào)整曝光時(shí)間。取出膠片，常規(guī)顯影、定影。膠片經(jīng)掃描后，用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，比較各組目的蛋白/內(nèi)參蛋白的表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、氟西汀對(duì)HepG2細(xì)胞周期影響

氟西汀以濃度依賴方式使HepG2細(xì)胞停滯于G2/M期。對(duì)照組G2/M期細(xì)胞與5 μmoL實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=，P>0.05)。10 μmoL組和12.5 μmoL組G2/M期細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各組HepG2細(xì)胞不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例見表1。

二、HepG2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)

熒光定量PCR法檢測(cè)12.5 μmoL氟西汀處理HepG2細(xì)胞0、6、12和24 h后Bcl-2、Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量并記錄CT值，計(jì)算2-△△CT值。結(jié)果顯示隨著氟西汀孵育時(shí)間延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞Bcl-2的mRNA表達(dá)逐漸降低，各組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；而隨著氟西汀孵育時(shí)間延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞Bax的mRNA表達(dá)各組與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

三、氟西汀處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表達(dá)

12.5 μmoL氟西汀處理HepG2細(xì)胞0、6、12和24 h后Bcl-2蛋白表達(dá)在12 h開始下降，Bax蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯變化，Bax/Bcl-2在12 h及24 h蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)，caspase-3蛋白表達(dá)在12 h開始增多，12 h及24 h蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)

討 論

研究表明，氟西汀抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2增殖可能與影響細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡則可能是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。

氟西汀以濃度依賴方式使HepG2細(xì)胞停滯于G2/M期，G2/M期是DNA合成和有絲分裂的準(zhǔn)備期，在細(xì)胞周期進(jìn)程中有至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，G2/M期細(xì)胞隨著氟西汀濃度增大而增加，因此氟西汀抑制體外培養(yǎng)的HepG2增殖，可能與氟西汀使HepG2在細(xì)胞周期G2/M期積累停滯有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是由多種基因控制的程序性死亡，線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮舉足輕重的作用。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的重要通路，受Bcl-2家族蛋白成員調(diào)節(jié)[8]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中或與細(xì)胞凋亡激活因子結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[9]。Bax是與Bcl-2功能相反的一個(gè)基因，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax/Bcl-2比值對(duì)決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有重要意義[10]。

在線粒體凋亡通路中，DNA損傷、代謝紊亂、藥物誘導(dǎo)等因素可導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜通透性增加，釋放線粒體凋亡蛋白，包括細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合，形成復(fù)合物，可促進(jìn)caspase-9前體的自身活化，活化的caspase-9激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，caspase-3的活化是線粒體凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11,12]。本研究結(jié)果顯示，隨著氟西汀處理時(shí)間延長(zhǎng)，bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)降低，而Bax mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化，Bax/Bcl-2及活化的casepase-3蛋白表達(dá)增多，說明氟西汀可通過線粒體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

表1 各組HepG2細(xì)胞不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例(%，±s)

表2 氟西汀對(duì)HepG2細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響(±s)

表3 Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平灰度比值結(jié)果(±s)

本實(shí)驗(yàn)明確了氟西汀體外的抗肝細(xì)胞癌作用，闡明了氟西汀可能是通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程和下調(diào)Bcl-2表達(dá)、激活caspase-3，抑制肝癌細(xì)胞系HepG2增殖并誘導(dǎo)其凋亡。后期可通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究氟西汀的肝癌抑制作用。