沈逵，何倩，秦愛建,3，錢琨,3*

(1.揚(yáng)州大學(xué)教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是一種能夠引起宿主產(chǎn)生嚴(yán)重免疫抑制的反轉(zhuǎn)錄病毒，最終導(dǎo)致宿主產(chǎn)生多種惡性腫瘤[1]。嚴(yán)重的免疫抑制常常造成多種病原的混合感染，有研究表明，先天感染ALV是導(dǎo)致雞馬立克病疫苗免疫效果低下的主要原因之一[2]，其與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒共感染條件下可以促進(jìn)彼此的復(fù)制[3-4]，因此ALV對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。

ALV的基因組具有典型的慢轉(zhuǎn)化型反轉(zhuǎn)錄序列：5′-R-U5-gag-pol-env-U3-R-3′[5]，主要編碼各種結(jié)構(gòu)蛋白(gag、pol、env)，包括磷蛋白(如p19)、核衣殼蛋白(如p15、p27)、DNA聚合/整合酶蛋白(如p68、p32)、囊膜蛋白(如gp85、gp37)等。gag基因十分保守，主要編碼12 kDa、15 kDa、19 kDa和27 kDa 4種蛋白質(zhì)，它們分別命名為p12、p15、p19和p27，其中p15和p27為衣殼蛋白[6]。目前對(duì)病毒編碼蛋白的研究主要集中在p27、gp85和gp37蛋白，已報(bào)道的研究發(fā)現(xiàn)，gp37在胞漿區(qū)域的C末端酪氨酸基序在體內(nèi)外均可影響ALV-J的致病性[7]，gp85含有病毒受體決定簇，其高變區(qū)和可變區(qū)決定了ALV的中和活性和特異性[8]，p27存在多種抗原表位，基因組十分保守，是群特異性抗原，常被作為各亞群ALV的檢測(cè)指標(biāo)[9]。衣殼蛋白p15作為一種由124個(gè)氨基酸組成的蛋白酶，可對(duì)gag和pol基因編碼的多聚蛋白進(jìn)行切割，使其加工成為成熟的非糖基化蛋白和一些多肽。有研究表明，gag末端攜帶活化狀態(tài)下的p15時(shí)，前體蛋白的成熟和釋放過(guò)程將十分迅速，并且p15-蛋白N端的7個(gè)氨基酸組成的區(qū)域有增加病毒裝配效率的作用[10]。但目前對(duì)于衣殼蛋白p15的生物學(xué)功能研究還知之甚少。

慢病毒載體作為一種十分靈活且強(qiáng)大的載體工具，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)的基因傳遞、穩(wěn)定地將載體整合到宿主基因組，在分裂和非分裂細(xì)胞中均可表達(dá)，其感染效率可達(dá)到80%以上[11]。近年來(lái)，慢病毒載體廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域也有大量報(bào)道。Kang等[12]構(gòu)建了含有山羊chi-pri-mir-204基因的重組慢病毒載體pCDH-CMV-mir204-EF1-GreenPuro，包裝產(chǎn)生的慢病毒可影響小鼠生精小管中Sirt1、Oct4和Plzf等相關(guān)基因的表達(dá)；龐中兵等[13]成功以慢病毒表達(dá)載體共表達(dá)Cas9和sgRNA，獲得了一株敲除TLR4基因的DF-1細(xì)胞系。本研究嘗試構(gòu)建了禽白血病病毒p15基因的慢病毒表達(dá)載體，并檢測(cè)p15蛋白在LMH細(xì)胞中的表達(dá)，為在禽源細(xì)胞中深入研究p15蛋白的生物學(xué)功能提供良好的生物材料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

人腎上皮細(xì)胞系(HEK 293T)、雞肝癌細(xì)胞系(LMH)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)的質(zhì)粒pCAGGS-p15由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、鑒定、保存。慢病毒骨架質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen1，輔助質(zhì)粒慢病毒外殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒psPAX2(pHelper1)和慢病毒膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pMD2·G(pHelper2)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)趙欽教授饋贈(zèng)。DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

胎牛血清，DMEM-F12(1∶1)培養(yǎng)基，Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自GIBCO公司；雙抗購(gòu)自碧云天公司；T4連接酶購(gòu)自Promega公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；兔源抗Flag多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；1 kb DNA Maker、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自康為世紀(jì)公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自Bio-Rad公司；山羊抗兔IgG Alexa 594購(gòu)于Jackson公司；Hoechst 33342細(xì)胞核染色試劑、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠、抗兔IgG全分子抗體、聚凝胺(polybrene)均購(gòu)自SIGMA公司；BCA蛋白定量試劑盒、高保真PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ(FD)、EcoRⅠ(FD)、熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ 購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2購(gòu)自Mirus公司，其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI查到的ALV-J基因序列(GenBank No.Z46390.1)中p15片段序列設(shè)計(jì)引物序列，引物下游3′端融合有Flag標(biāo)簽。利用DNAStar設(shè)計(jì)PCR引物序列如下(下劃線分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，斜體為Flag標(biāo)簽序列，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為372 bp)：

p15-F：CGGAATTCATGTTAGCGATGACAATGGAACATAA;

p15-R：GCCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTAAATTTGTCAAGCGGAGCCCT。

1.4 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室前期制備的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-p15為模板擴(kuò)增目的片段。p15基因PCR擴(kuò)增體系為：2×Phanta Max Buffer 25 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，p15-F(10 μmol/L) 2 μL，p15-R(10 μmol/L) 2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，質(zhì)粒pCAGGS-p15 2.4 μL，ddH2O 16.6 μL，共50 μL體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；之后95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，降至4 ℃。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定，條帶大小正確后切膠回收，用于酶切。

酶切反應(yīng)均使用快切酶，分別酶切膠后，回收產(chǎn)物和慢病毒骨架質(zhì)粒。反應(yīng)體系為：10×Green Buffer 2 μL，EcoRⅠ(FD)1 μL，XhoⅠ(FD)1 μL，膠回收片段產(chǎn)物3 μL，ddH2O 13 μL，共20 μL體系。置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，將產(chǎn)物進(jìn)行純化并回收。骨架質(zhì)粒plvx-IRES-ZsGreen1使用相同處理方法以獲得黏性末端用于連接。

連接體系為：2×T4 DNA Ligase Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，酶切骨架質(zhì)粒plvx-IRES-ZsGreen 11 μL，酶切目的片段回收產(chǎn)物 3 μL，共20 μL體系。4 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中，次日挑取單個(gè)菌落，抽提質(zhì)粒，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)，并命名為plvx-p15-Flag。

1.5 慢病毒的包裝和滴度測(cè)定

1.5.1 慢病毒的包裝和收集

將3×107個(gè)HEK 293T細(xì)胞接種于T25規(guī)格細(xì)胞方瓶中，培養(yǎng)12 h，待密度達(dá)到約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染體系質(zhì)?？偭繛? μg，質(zhì)粒含量比例為：plvx-p15-Flag(慢病毒骨架質(zhì)粒)∶psPAX2(慢病毒外殼表達(dá)質(zhì)粒)∶pMD2·G(慢病毒膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒) = 5∶4∶1。轉(zhuǎn)染體系為：3 μg plvx-p15-Flag+2.4 μg psPAX2+0.6 μg pMD2·G+18 μL TransIT-X2，轉(zhuǎn)染過(guò)程按照TransIT-X2說(shuō)明書進(jìn)行。

于顯微鏡下觀察共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每隔12 h觀察1次。待視野下自發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目達(dá)到50%以上時(shí)，凍融細(xì)胞，離心收取上清，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 慢病毒滴度測(cè)定

取HEK 293T細(xì)胞接種入12孔板中，每孔約9×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜；次日，用梯度稀釋法稀釋pLvx-p15-Flag病毒液，以相應(yīng)稀釋倍數(shù)(100，10-1，10-3)稀釋病毒液，每孔加入300 μL，感染293T細(xì)胞72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算慢病毒滴度。病毒滴度(TU/mL)=綠色熒光細(xì)胞數(shù)量×病毒液稀釋倍數(shù)/病毒液體積。

1.6 plvx-p15-Flag質(zhì)粒的慢病毒感染及目的蛋白表達(dá)的鑒定

將293T細(xì)胞、LMH細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約120萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，可用于感染。將凍存于-70 ℃的病毒上清液于室溫融解，按照1 000∶1的比例與polybrene混合感染293T細(xì)胞和LMH細(xì)胞。每隔24 h于顯微鏡下觀察。

1.6.1 激光共聚焦檢測(cè)p15蛋白表達(dá)

LMH細(xì)胞接種于細(xì)胞飛片上，達(dá)到90%密度用于慢病毒感染，感染后培養(yǎng)至綠色熒光細(xì)胞數(shù)目達(dá)30%～40%。取出細(xì)胞飛片用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，0.25%的Triton X-100破膜作用約5 min，再使用1% BSA(含有1%～2%的山羊血清)于37 ℃下封閉30 min，PBS洗3遍。一抗使用兔源抗Flag多克隆抗體(1∶100稀釋)37 ℃下作用45 min，二抗使用山羊抗兔IgG Alexa 594熒光二抗(1∶1 000稀釋)37 ℃孵育35 min，染核使用1 μg /mL的Hoechst 33342，室溫下作用5～8 min，用適量50%甘油封片，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.6.2 Western blot檢測(cè)p15蛋白的表達(dá)

向感染細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol/L 蛋白酶抑制劑)，置于冰上裂解，每10 min渦旋1次，共30 min，裂解后13 000 r/min離心15 min 收取細(xì)胞蛋白，經(jīng)BCA定量后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白分析。轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)入Western blot反應(yīng)，一抗使用1 ∶2 000稀釋的兔源抗Flag多克隆抗體，二抗使用1∶30 000稀釋的HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記山羊抗兔IgG。最終使用ECL顯色液進(jìn)行顯色分析。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒感染細(xì)胞中p15基因表達(dá)情況

將慢病毒感染293T、LMH細(xì)胞，待感染出現(xiàn)特異性熒光時(shí)，采用Axygen試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為10 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，模板RNA 1 μg，42 ℃ 2 min；之后再每管加入PrimerScript RT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5× PrimerScript Buffer2緩沖液4 μL，RNase free dH2O 4 μL，總體系20 μL，混勻后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存。以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，利用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中p15表達(dá)水平，相關(guān)引物序列見表1。反應(yīng)體系如下：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer和Reverse Primer(10 μmol/L)各0.8 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，添加RNase free dH2O至總體積20 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；最后階段為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣本獨(dú)立做3個(gè)重復(fù)孔。

表1 qRT-PCR檢測(cè)引物序列

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)試驗(yàn)樣本做3次獨(dú)立重復(fù)，所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析不同試驗(yàn)樣本的顯著性差異變化。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行p15基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定，在372 bp處可見目的條帶(圖1A)。p15雙酶切后連接于載體質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中，從單菌落培養(yǎng)物中抽提質(zhì)粒，雙酶切后用于核酸電泳鑒定，條帶大小正確(圖1B)。

2.2 慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果

接種293T細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)約為9×105個(gè)，不同稀釋倍數(shù)下病毒液感染細(xì)胞，通過(guò)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，在10-3稀釋度下綠色熒光細(xì)胞數(shù)目約為25%。計(jì)算可得慢病毒的病毒液滴度值約為9×105×25%×10-3/0.001=2.25×105TU/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)生的慢病毒具有高效的細(xì)胞感染能力。

A.p15基因PCR產(chǎn)物；B.雙酶切核酸電泳鑒定；1.Marker；2.p15基因的PCR產(chǎn)物；3.雙酶切后pLVX-IRES-ZsGreen1空載體；4.雙酶切含p15基因的骨架質(zhì)粒plvx-p15-Flag圖1 p15基因的PCR擴(kuò)增及慢病毒骨架質(zhì)粒的雙酶切鑒定

A、B、C.慢病毒稀釋倍數(shù)依次為1、101、103圖2 不同稀釋度的plvx-p15-Flag慢病毒感染293T細(xì)胞后GFP熒光表達(dá)(200×)

2.3 293T細(xì)胞中p15蛋白表達(dá)情況

慢病毒液感染細(xì)胞后，可以觀察到特異性熒光，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，孔內(nèi)特異性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多(圖3A)。收集感染0 h，48 h，72 h，96 h的293T細(xì)胞RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)p15基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，p15基因表達(dá)隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高(圖3B)；同時(shí)收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果顯示，病毒感染48 h、72 h和96 h均可檢測(cè)出p15蛋白的表達(dá)(圖3C)。

2.4 病毒感染LMH細(xì)胞中p15表達(dá)水平檢測(cè)

接種LMH細(xì)胞于12孔細(xì)胞板，培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按照1.6所述方法感染細(xì)胞，每24 h觀察一次特異性熒光，并收集細(xì)胞RNA，用于qRT-PCR檢測(cè)p15基因表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果顯示隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，p15表達(dá)量顯著上升(圖4A)?？梢娐《靖腥厩菰碙MH細(xì)胞可以高效表達(dá)外源基因。待感染組細(xì)胞自發(fā)熒光數(shù)目達(dá)到40%以上時(shí)，加入RIPA細(xì)胞裂解液，收集蛋白用于Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示病毒感染LMH細(xì)胞72和96 h可以檢測(cè)出p15蛋白目的條帶(圖4B)，病毒感染后96 h的共聚焦熒光觀察結(jié)果也證實(shí)p15蛋白主要在病毒感染胞漿中表達(dá)(圖4C)。

A.不同感染時(shí)間點(diǎn)特異性熒光細(xì)胞數(shù)目觀察；B.qRT-PCR檢測(cè)不同感染時(shí)間點(diǎn)p15基因表達(dá)情況；C.蛋白免疫印跡檢測(cè)病毒感染后p15蛋白表達(dá)水平;*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001。下同圖3 plvx-p15-Flag感染293T細(xì)胞中的基因和蛋白的表達(dá)

A.qRT-PCR檢測(cè)慢病毒感染LMH細(xì)胞后不同感染時(shí)間點(diǎn)p15基因表達(dá)(*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001)；B.蛋白免疫印跡檢測(cè)p15的蛋白表達(dá)情況；C.慢病毒感染LMH細(xì)胞中p15蛋白表達(dá)及定位(紅色熒光為Flag蛋白，綠色熒光為ZsGreen蛋白，雙色熒光重合細(xì)胞為感染成功的LMH細(xì)胞)圖4 plvx-p15-Flag感染LMH細(xì)胞中目的基因和蛋白的表達(dá)

3 討論

在ALV的多個(gè)亞群中，不同亞群致病力有顯著性差異[14]，其中J亞群既可水平傳播又可垂直傳播，致病力最強(qiáng)，對(duì)肉雞和蛋雞危害嚴(yán)重[15-16]，主要體現(xiàn)在致腫瘤和免疫抑制兩個(gè)方面，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家對(duì)于禽白血病致病機(jī)理開展了大量研究工作，但對(duì)于病毒的致病機(jī)制仍知之甚少。

ALV-J基因組的編碼區(qū)形成3個(gè)大的開放閱讀框[17]，其gag片段編碼的衣殼蛋白p27是主要的群特異性抗原，現(xiàn)在已經(jīng)作為疾病檢測(cè)抗原被廣泛認(rèn)可[18]。對(duì)同為衣殼蛋白的p15蛋白酶的研究鮮有報(bào)道，通過(guò)比對(duì)A、B、E、J、K等多個(gè)亞群不同來(lái)源毒株的p15基因序列，發(fā)現(xiàn)其同源性在95%以上，其發(fā)揮怎樣的生物學(xué)功能還未知。HIV作為典型的反轉(zhuǎn)錄病毒，其結(jié)構(gòu)蛋白中也有類似p15蛋白酶的p6蛋白酶，僅有52個(gè)氨基酸，且Schmalen等[19]研究表明，HIV-1 p6對(duì)胰島素降解酶(IDE)介導(dǎo)的降解的敏感性與p6的N端氨基酸有關(guān)，可通過(guò)N端的脯氨酸殘基來(lái)阻止HIV-1 p6蛋白被IDE降解，p6穩(wěn)定表達(dá)后可明顯發(fā)現(xiàn)HIV-1復(fù)制能力降低且依賴于Env[20]，而且其N端氨基酸的突變很大程度上決定了HIV在人和猩猩之間的傳播[21]。從HIV-1 p6蛋白酶研究中獲得啟示，成熟的ALV-J p15蛋白在病毒復(fù)制、疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定的作用與功能，但目前關(guān)于p15的研究工具十分匱乏，故本研究利用慢病毒載體可以高效表達(dá)外源基因的特點(diǎn)，首次構(gòu)建ALV-J p15基因的慢病毒表達(dá)載體，并按照比例包裝成為慢病毒感染系統(tǒng)，共聚焦免疫熒光、qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，該系統(tǒng)可有效地介導(dǎo)p15基因在LMH細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。經(jīng)蛋白定位的共聚焦熒光觀察可明顯發(fā)現(xiàn)p15蛋白主要在胞漿中表達(dá)，使用qRT-PCR可在48 h檢測(cè)到LMH細(xì)胞中表達(dá)的p15基因，但在48 h的Western blot檢測(cè)結(jié)果中卻未見p15蛋白條帶，這可能是由于人源啟動(dòng)子在禽源細(xì)胞中識(shí)別、表達(dá)緩慢造成的。下一步研究中，計(jì)劃構(gòu)建一株可穩(wěn)定表達(dá)p15蛋白的LMH細(xì)胞系，在這種細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，研究p15蛋白的生物學(xué)功能，將十分便捷和高效。

綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)p15基因的慢病毒表達(dá)載體，這一工具將有助于揭示p15蛋白在ALV感染復(fù)制、免疫抑制以及相關(guān)免疫學(xué)信號(hào)通路中發(fā)揮的重要作用及其機(jī)制。