黃欣愛，王潔，陳明，劉海霞，姚曉磊，李曉丹

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

雌性動(dòng)物的排卵是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，涉及到機(jī)體卵巢卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟等功能。已證實(shí)，孕酮(progesterone，P4)是排卵過程中一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[1]。P4可通過基因組與非基因組兩個(gè)層面發(fā)揮其生理學(xué)功能。其中，基因組層面生物學(xué)功能的發(fā)揮需通過與孕酮受體(progesterone receptor，PGR)結(jié)合得以實(shí)現(xiàn)。研究表明，PGR是參與調(diào)控排卵的重要調(diào)節(jié)因子，在卵泡破裂和卵母細(xì)胞釋放中起介導(dǎo)作用[2-3]。因此，在雌性動(dòng)物生殖研究中探討PGR調(diào)控卵泡發(fā)育的作用機(jī)理顯得尤為重要。為揭示PGR在卵泡發(fā)育及排卵發(fā)生過程中的作用，前期研究者圍繞人[4]、小鼠[5-6]、豬[7-8]、恒河猴[2]的卵巢開展部分工作，發(fā)現(xiàn)PGR蛋白主要定位于卵巢卵泡顆粒細(xì)胞中。同時(shí)，研究者在敲除小鼠[5]、斑馬魚[9]、大鼠[10]和恒河猴[2]PGR基因后，發(fā)現(xiàn)它們均不能正常排卵。研究人員在敲除PGR的小鼠模型中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PGR能夠調(diào)控其下游排卵相關(guān)基因(ADAMTS1、PPAR-γ和CTSL)的表達(dá)[ 5-6,11-12]，從而影響優(yōu)勢卵泡的破裂和卵母細(xì)胞的釋放。前期的研究還發(fā)現(xiàn)，PGR基因在不同大小卵泡中差異表達(dá)[7]，提示PGR可能參與卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)。目前關(guān)于PGR基因的研究主要集中在嚙齒類和哺乳動(dòng)物上，但PGR在反芻動(dòng)物(尤其是湖羊)中是如何發(fā)揮作用的鮮有報(bào)道。因此，為進(jìn)一步探究PGR基因影響湖羊顆粒細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究在克隆并分析湖羊PGR基因的編碼區(qū)序列 (coding sequence，CDS) 的基礎(chǔ)上，探究PGR對湖羊顆粒細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，明晰PGR基因在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育中的作用，旨在為挖掘湖羊多胎候選基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集主要試劑和儀器

從江蘇省丹陽市珥陵屠宰場采集非妊娠湖羊卵巢，采集時(shí)間為每年11月份至次年2月份，樣品用于分離顆粒細(xì)胞。

兔抗PCNA(Ab15497)，購自Abcam,Cambridge,英國，1∶1 000；兔抗BAX(50599-2-lg)，購自ProteinTech,Chicago,IL,美國，1∶1 000；羊抗IgG(SA00001-2)，購自ProteinTech,Chicago,IL,美國,1∶4 000；兔抗β-actin(bs-0061R)，購自Bioss,中國北京，1∶2 000；Trizol Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen,美國；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa，中國大連；核酸蛋白測定儀ND-2000購自NanoDrop Technologies,美國)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

引物序列及其產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列

根據(jù)GenBank中綿羊PGR基因的序列(登錄號：XM_015100878.2)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增引物，湖羊PGR基因CDS區(qū)的引物和相關(guān)基因的定量引物序列。

1.3 cDNA片段擴(kuò)增

使用實(shí)驗(yàn)室前期保存(-80 ℃)的湖羊卵巢RNA，進(jìn)行PGR基因的擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收嚴(yán)格按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。將擴(kuò)增的基因片段連接到pMD19-T載體上，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測后，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。

1.4 序列分析

利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得目的基因CDS區(qū)序列。通過ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) 在線軟件，找到該序列的起始和終止密碼子。采用DNAMAN軟件中的蛋白質(zhì)翻譯程序，得到湖羊PGR基因編碼氨基酸的序列。通過BLAST方法在NCBI中搜索同源序列，并與其他物種的編碼氨基酸的序列進(jìn)行同源性分析。

依據(jù)上述獲得的湖羊PGR基因CDS區(qū)序列，由上海吉瑪生物制藥有限公司合成過表達(dá)載體和干擾siRNA，其序列見表2。

表2 PGR的干擾序列

1.5 卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將卵巢保存于含有雙抗的37 ℃生理鹽水中，3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用含有雙抗的生理鹽水沖洗卵巢3～5次后去除卵巢系膜；用5 mL注射器預(yù)先吸入1 mL含有1% 胎牛血清(Fetal Calf Serum，F(xiàn)BS)的杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，DPBS)，在超凈臺內(nèi)抽取2～5 mm健康卵泡的卵泡液，并將卵泡液收集置于15 mL無菌離心管中；1 500g離心5 min，用DPBS清洗1次，加入500 μL透明質(zhì)酸酶(0.3%)，輕輕吹打混勻，再加入5 mL完全培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM/F12)，1 500g離心5 min，最后用6 mL完全培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將分離的湖羊顆粒細(xì)胞以適宜密度接種于6孔板中，細(xì)胞密度長到60%～70%時(shí)，將PGR基因的干擾siRNA和過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置基礎(chǔ)對照組(BC)，-80 ℃保存。

1.7 細(xì)胞活力檢測

將分離的湖羊顆粒細(xì)胞以適宜密度接種于96孔板中，將構(gòu)建好的PGR基因干擾siRNA和過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，同時(shí)設(shè)置基礎(chǔ)對照組(BC)。

1.8 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按照TRIzol Reagent試劑盒說明書提取上述顆粒細(xì)胞的總RNA，核酸蛋白測定儀ND-2000測定總RNA的濃度和純度；按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA置于-20 ℃保存。

1.9 qRT-PCR檢測

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行周期和凋亡相關(guān)基因的qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL。SYBR Green Master mix (Roche，德國)10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件和操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 Western blot檢測

從-80 ℃冰箱取出樣品，用添加有蛋白酶抑制劑(PMSF)的裂解液(RIPA)提取蛋白，按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒和蛋白變性試劑盒操作說明進(jìn)行蛋白濃度的測定和變性。蛋白變性條件為70 ℃作用10 min，蛋白上樣量為30 μg。SDS-PAGE電泳采用10%預(yù)制膠，200 V，30 min。轉(zhuǎn)膜條件為100 V，1 h。5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，孵育兔抗PCNA、兔抗BAX和兔抗β-actin多克隆一抗，4 ℃過夜。TBST搖床上洗3次，每次10 min；羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST搖床上洗3次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影并觀察。用Image J軟件對其灰度值進(jìn)行分析。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)至少3次。使用SPSS 24.0(SPSS Inc.Chicago，IL，USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用單因素方差(one-way ANOVA)檢驗(yàn)其差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。應(yīng)用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 湖羊PGR基因CDS區(qū)序列分析

湖羊PGR基因CDS區(qū)全長為2 736 bp，編碼911個(gè)氨基酸。

進(jìn)一步采用DNAMAN軟件與其他物種編碼氨基酸的同源性進(jìn)行分析，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，湖羊PGR基因編碼氨基酸序列與山羊、牛、人、小鼠、大鼠、豬、雞的同源性分別為：95.44%、89.18%、78.37%、39.66%、73.91%、81.44%和52.49%(圖1)。

圖1 不同物種PGR編碼氨基酸序列比對

2.2 PGR基因?qū)蝾w粒細(xì)胞體外增殖的影響

在湖羊顆粒細(xì)胞中，干擾和過表達(dá)PGR基因后，CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見圖2。

柱形圖上小寫字母不同，表示基因表達(dá)水平差異顯著，P<0.05。下同圖2 PGR基因?qū)蝾w粒細(xì)胞體外增殖的影響

由圖2可看出，干擾PGR基因能夠顯著抑制顆粒細(xì)胞的增殖(P<0.05)。相反，過表達(dá)PGR基因則能顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖(P<0.05)。

2.3 PGR基因?qū)蝾w粒細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

干擾PGR基因可顯著下調(diào)顆粒細(xì)胞中CDK4、Bcl-2基因mRNA的表達(dá)，見圖3A和圖3E(P<0.05)，上調(diào)顆粒細(xì)胞中Caspas3、Caspase8和BAX基因mRNA的表達(dá)見圖3C、圖3D和圖3F(P<0.05)，但對CyclinD1未產(chǎn)生影響(圖3B，P>0.05)；相反，過表達(dá)PGR可顯著上調(diào)CDK4、CyclinD1和Bcl-2基因mRNA的表達(dá)見圖3A、圖3B和圖3E(P<0.05)，而顯著下調(diào)Caspase3、Caspase8、BAX基因mRNA的表達(dá)，見圖3C和圖3D(P<0.05)。同時(shí)，干擾PGR基因分別顯著下調(diào)和上調(diào)顆粒細(xì)胞中PCNA和BAX蛋白表達(dá)水平，見圖4A(P<0.05)；相反，過表達(dá)PGR基因則分別顯著上調(diào)和下調(diào)顆粒細(xì)胞中PCNA和BAX的蛋白表達(dá)水平，見圖4B、圖4C、圖4D(P<0.05)。

A.CDK4;B.CyclinD1;C.Caspase8;D.Caspase3;E.Bcl-2;F.BAX圖3 PGR基因?qū)χ芷诤偷蛲鱿嚓P(guān)基因表達(dá)的影響

A.干擾PGR基因；B、C、D.過表達(dá)PGR基因圖4 PGR對BAX和PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

為揭示PGR基因在湖羊卵泡發(fā)育中的作用機(jī)制，本研究首先克隆了湖羊PGR基因的CDS區(qū)序列，序列長度為2 736 bp，編碼911個(gè)氨基酸，與NCBI上預(yù)測的序列一致，這為本研究后續(xù)構(gòu)建PGR基因過表達(dá)載體和干擾siRNA奠定基礎(chǔ)。已有研究發(fā)現(xiàn)鯉魚PGR基因編碼628個(gè)氨基酸[12]。經(jīng)同源性比對，發(fā)現(xiàn)與山羊、牛具有較高的同源性，相似度達(dá)到89%以上，表明PGR基因在反芻動(dòng)物中高度保守。提示PGR基因可能在反芻動(dòng)物中具有相似的功能。

在對豬[6-7]、小鼠[4-5]、人[3]和恒河猴[2]的研究中，發(fā)現(xiàn)PGR在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。在牛不同大小卵泡中均檢測到PGR基因的表達(dá)，且表達(dá)有差異[6]。在湖羊中也證實(shí)了這一點(diǎn)，即PGR基因在湖羊不同大小卵泡中表達(dá)存在差異性。提示PGR可能參與湖羊卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)，但具體機(jī)制尚不清楚。

顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡與卵泡發(fā)育密切相關(guān)[13-14]。為揭示PGR基因在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育中的作用，研究者通過采用PGR拮抗劑處理人和大鼠排卵前顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PGR拮抗劑能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[15-18]。Friberg等[19]在大鼠上也證實(shí)，PGR能夠介導(dǎo)排卵前顆粒細(xì)胞的凋亡。Cheng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PGR基因能夠促進(jìn)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的活力。本研究發(fā)現(xiàn)干擾PGR基因能夠抑制湖羊顆粒細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)則促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，這與前期研究一致。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)干擾PGR基因能夠促進(jìn)永生化子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖[21]。這提示，造成這種差異的產(chǎn)生的原因，可能與細(xì)胞類型及細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。

細(xì)胞增殖和凋亡是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，其中細(xì)胞周期和凋亡基因在其中扮演著重要角色[22-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，PGR基因?qū)φ{(diào)控顆粒細(xì)胞增殖與凋亡有一定的作用，干擾PGR基因能夠上調(diào)Caspase3、Caspase8、BAX和下調(diào)CDK4、Bcl-2、PCNA基因或蛋白的表達(dá)水平；過表達(dá)PGR基因能夠下調(diào)Caspase3、Caspase8、BAX和上調(diào)CDK4、CyclinD1、Bcl-2、PCNA基因或蛋白的表達(dá)水平。對牛排卵前顆粒細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PGR能夠通過下調(diào)CyclinD2和下調(diào)P27基因的表達(dá)水平，促進(jìn)牛顆粒細(xì)胞的凋亡[24，26]。Friberg等[18]也報(bào)道，PGR拮抗劑通過增強(qiáng)Caspase3的活力，進(jìn)而促進(jìn)大鼠顆粒細(xì)胞的凋亡。在人和小鼠顆粒細(xì)胞中也證實(shí)了這一點(diǎn)[15,27]。以上研究結(jié)果表明，PGR基因通過調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡。

4 結(jié)論

湖羊PGR基因CDS區(qū)序列長度為2 736 bp，編碼911個(gè)氨基酸，與山羊和牛的同源性較高。PGR基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響湖羊顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育。