吳昊妍 詹琰靜 張士文，2

0 引言

機(jī)體由不同的組織和器官構(gòu)成，并借由器官間的互相協(xié)作來完成生命活動(dòng)。因此，了解器官和組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)對(duì)于進(jìn)一步明確生命代謝機(jī)制及疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用。此外，發(fā)育生物學(xué)需要研究者在三維空間下理解組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，隨著顯微成像技術(shù)的應(yīng)用，組織器官的三維成像受到了廣泛的關(guān)注。

目前顯微成像技術(shù)雖然極大地增加了成像深度，但對(duì)于較厚組織深部結(jié)構(gòu)的觀測(cè)仍舊有限。如電子計(jì)算機(jī)斷層掃描，雖然其可以對(duì)體積較大的組織進(jìn)行完整成像，但它們空間分辨率較低，無法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的成像，且成像深度有限。除此之外，組織中的色素會(huì)吸收可見光進(jìn)而阻擋入射光和激發(fā)光，組織的內(nèi)源性熒光或在樣本操作過程中所產(chǎn)生的熒光信號(hào)會(huì)干擾組織觀測(cè)，半透明或乳白色的生物組織外觀也會(huì)使圖像信噪比降低而影響深部成像。為解決成像深度的問題，組織透明化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它可在一定程度上降低組織的散射率并緩解組織光吸收。

目前，許多科研工作者致力于探索和改進(jìn)各種透明化方法，如iDISCO、uDISCO、PEGASOS及CUBIC、PACT、ScalsS(2015)、Ce3D等，以期獲得一套全組織高分辨率(至少細(xì)胞級(jí)分辨率)成像的解決方案。組織透明化技術(shù)有多種分類方法，本文按照主流分類方法將其分為油性透明化技術(shù)和水性透明化技術(shù)，并對(duì)水性透明化技術(shù)的被動(dòng)浸潤(rùn)法、水化法和水凝膠嵌入法三類方法進(jìn)行綜述。

1 被動(dòng)浸潤(rùn)法水性透明化技術(shù)

被動(dòng)浸潤(rùn)法水性透明化技術(shù)是指將組織浸泡在高折射率(>1.45)溶液中并置于適宜的溫度下孵育，利用滲透壓使組織逐漸透明化。該方法不去除脂質(zhì)，利用高折射率溶液替換組織內(nèi)外的液體，以平衡折射率。此法常應(yīng)用于較小樣本的透明化處理。目前報(bào)道的被動(dòng)浸潤(rùn)法水性透明化技術(shù)主要有以下幾種。

1.1 ClearT/ClearT2、ReagentTF

ClearT/ClearT2是Kuwajima 等[5]為了更好地觀察小鼠的神經(jīng)元及非神經(jīng)元組織，發(fā)明的基于甲酰胺的組織透明化方法，通過組織透明化技術(shù)結(jié)合光學(xué)成像來觀察腦部結(jié)構(gòu)及全腦的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是研究腦組織的重要手段。此技術(shù)結(jié)合組織標(biāo)記技術(shù)可成功地對(duì)小鼠胚胎及幼鼠的大腦進(jìn)行成像。

ClearT成像效果好，速度快，并能與脂溶性示蹤劑和熒光示蹤劑兼容。但該法會(huì)使樣本略微膨脹，且會(huì)使樣本熒光信號(hào)淬滅。聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，繼而發(fā)展了可保留免疫組化和基因編碼的熒光蛋白的ClearT2技術(shù)，但其組織透明度比ClearT低，透明化能力受限，無法處理幼鼠全腦或成年鼠腦組織。

ReagentTF是汪建茹等[6]在ClearT基礎(chǔ)上引入三乙醇胺試劑，發(fā)展的能與多種標(biāo)記方法兼容的技術(shù)。其操作更簡(jiǎn)便，成像更好，對(duì)樣本結(jié)構(gòu)的保護(hù)效果更優(yōu)，解決了ClearT2處理樣本后熒光信號(hào)隨著時(shí)間減弱的缺點(diǎn)，更好地保持了樣本熒光信號(hào)甚至有所提升。通過ReagentTF技術(shù)，可清晰觀測(cè)到樹突棘和軸突等精細(xì)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路的可視化，并進(jìn)行神經(jīng)元的長(zhǎng)程投射追蹤。

1.2 SeeDB、UbasM、FRUIT

Ke等[7]發(fā)明了SeeDB(see deep brain)技術(shù)，它以果糖和0.5%α-硫代甘油飽和溶液為主要成分，能在幾天內(nèi)將樣本透明化。經(jīng)SeeDB處理的腦切片樣本能有效透明化大腦灰質(zhì)和白質(zhì)，且樣本完整性好，體積變化小。其可以與免疫組織化學(xué)結(jié)合，并與親脂性示蹤劑細(xì)胞膜紅色熒光探針(DiI)兼容，有助于腦部神經(jīng)回路的研究。SeeDB因高濃度果糖黏度大導(dǎo)致其在組織內(nèi)的滲透性較低。即使動(dòng)脈灌注可以促進(jìn)SeeDB在腦部的擴(kuò)散，但其極高的黏度使其很難應(yīng)用于較大的哺乳動(dòng)物。通過加熱至50℃可以增加其滲透性，但由于美拉德效應(yīng)導(dǎo)致褐變和自熒光積聚，熒光蛋白淬滅，從而影響樣本的透明化。

SeeDB用于研究腦部神經(jīng)回路，因此可以利用其研究死后大腦樣本中的神經(jīng)元連接。目前也有學(xué)者利用SeeDB實(shí)現(xiàn)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的可視化[8]，對(duì)眼睛進(jìn)行定性定量研究。

Chen等[9]發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)具有很好的化學(xué)促滲功能，在SeeDB的基礎(chǔ)上加入DMSO加速試劑進(jìn)入組織，以提高透明化效率。該技術(shù)被命名為UbasM，可在1 h內(nèi)處理1 mm腦切片，7 d內(nèi)實(shí)現(xiàn)小鼠半腦透明化，還可使心臟、肝臟等透明化，其中對(duì)腸的透明化速率是最快的。在疾病研究方面，UbasM不僅可以結(jié)合免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于老年癡呆的研究，還可以結(jié)合共聚焦顯微鏡對(duì)帶有熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞及組織器官進(jìn)行觀察。

由于SeeDB黏度極高，Hou等[10]在SeeDB基礎(chǔ)上衍生了一種透明化方法FRUIT。該法選擇尿素作為試劑中另一主要成分，降低了果糖黏度，大大提高試劑流動(dòng)性和滲透性，加速了試劑在組織中的擴(kuò)散速率，可結(jié)合動(dòng)脈灌注實(shí)現(xiàn)較大哺乳動(dòng)物的全腦透明化。

1.3 TDE

TDE是Staudt等[11]開發(fā)出的一種可改變折射率以適用所有油鏡鏡頭的低成本、低毒性的透明化技術(shù)，此技術(shù)可解決成像組織與油鏡的折射率不匹配導(dǎo)致成像效果降低的問題。TDE在腦組織中的擴(kuò)散速度快，可在數(shù)月內(nèi)保存熒光蛋白，而且不會(huì)引起組織變形。其不僅實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦和人腦組織的透明化，還實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物組織擬南芥生殖細(xì)胞的透明化。

由于TDE在高濃度時(shí)會(huì)降低熒光強(qiáng)度，限制成像深度，將來的發(fā)展方向主要是針對(duì)于增加樣本透明化深度，并擴(kuò)大除腦組織外對(duì)于其他組織器官的應(yīng)用。

1.4 FocusClear

FocusClear 是Liu等[12]發(fā)明的透明化技術(shù)。其以昆蟲蟑螂大腦為實(shí)驗(yàn)樣本，采用二乙酰胺基三碘苯甲酸作為主要透明化試劑，提高了組織結(jié)構(gòu)的圖像分辨率，輔助共聚焦顯微鏡可觀察細(xì)胞間的相互作用，并且能與熒光染色劑和基因綠色熒光蛋白兼容。除此之外，F(xiàn)ocusClear的透明化過程可逆，操作時(shí)可以將樣本置于PBS中保存或繼續(xù)處理。FocusClear目前用于昆蟲腦的研究，但對(duì)于較大的樣本來說，成本昂貴，且不能針對(duì)不同的生物樣本進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。

2 水化法水性透明化技術(shù)

水化法水性透明化技術(shù)是指在透明化過程中被動(dòng)去除脂質(zhì)后，利用水合作用降低樣本折射率進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組織透明化。此方法中，透明化試劑中的尿素或甲酰胺可滲透進(jìn)入高折射率的蛋白質(zhì)并使整體折射率降低。

2.1 Scale / ScaleS

Hama等[13]研發(fā)了Scale透明化技術(shù)。在尿素中混合甘油和Triton X-100制成Sclae A2試劑，在加快滲透速度的同時(shí)可完整保留標(biāo)記細(xì)胞的熒光信號(hào)，對(duì)于重建組織細(xì)胞群有重要意義。將試劑成分改性得到Scale U2可減少組織擴(kuò)張及脆性，但其操作時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)較大樣本的透明化效率較差。

Scale試劑不會(huì)導(dǎo)致熒光蛋白的淬滅，其材料易獲得且成本較低，可應(yīng)用于嚙齒類、小型哺乳類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物及人體活組織樣本的成像。但此法操作時(shí)間較長(zhǎng)，且易導(dǎo)致組織破碎，研究人員也根據(jù)這些特性對(duì)試劑成分比例進(jìn)行不斷調(diào)整改進(jìn)[14-15]。

Hama等[16]在Scale A2基礎(chǔ)上添加山梨醇制成改良試劑ScaleS，山梨醇可以使組織脫水收縮以中和由于尿素水化作用導(dǎo)致的樣本體積膨脹。目前研究者們利用ScaleS對(duì)患阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)或患AD死亡后的小鼠模型的大腦組織樣本進(jìn)行透明化，并對(duì)神經(jīng)環(huán)路、淀粉樣斑塊、小膠質(zhì)細(xì)胞等進(jìn)行三維重建等研究。

2.2 CUBIC

CUBIC是Susaki團(tuán)隊(duì)[17]研發(fā)的一種新型水性透明化方法，其簡(jiǎn)單、有效，能完好保存熒光信號(hào)，并與腦組織的免疫染色兼容，結(jié)合顯微成像技術(shù)能以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行全腦成像。其試劑基于Scale之上添加了氨基醇，它可以清除血紅素使組織脫色，因此能通過灌注來加速組織滲透和脫色。

目前可利用CUBIC結(jié)合熒光蛋白觀察神經(jīng)細(xì)胞的軸突或突觸連接，從而研究神經(jīng)元連接，隨著技術(shù)發(fā)展，其觀察范圍會(huì)從亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)擴(kuò)展到靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦組織。此外，Kubota等[18]利用CUBIC在單細(xì)胞水平上描繪了癌癥的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)umoto等[19]則利用CUBIC結(jié)合轉(zhuǎn)基因表達(dá)ZsGreen熒光蛋白完成了對(duì)肝臟及其他組織的觀察，并成功觀察了小鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA。

2.3 OPTIClear

人腦與嚙齒動(dòng)物大腦在理化性質(zhì)、神經(jīng)元組織等方面存在較大差異，并且不同人腦組織由于患者死前狀態(tài)不同，在死后發(fā)生變化的不同從而導(dǎo)致不同人腦組織也存在差異，這些阻礙了人腦組織的透明化技術(shù)發(fā)展[20-21]。Lai等[22]研發(fā)了OPTIClear，先將腦標(biāo)本用福爾馬林液浸透，然后將腦標(biāo)本在特定的溫度下進(jìn)行螢光漂染，再用OPTIClear 把腦組織透明化。OPTIClear選擇性地調(diào)整組織的光學(xué)特性而不損壞或改變其結(jié)構(gòu)成分。另外，他們發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定組織可以被甲酚紫和凝集素染色，幫助顯示大腦神經(jīng)元及血管的三維排布，從而不需要經(jīng)過十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)脫脂處理就可以進(jìn)一步利用OPTIClear進(jìn)行透明化。

2.4 Ce3D

為了解在復(fù)雜生理病理環(huán)境下不同器官細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，Gerner團(tuán)隊(duì)發(fā)明了Ce3D技術(shù)[23-24]。Ce3D處理的樣本體積縮小但細(xì)胞形態(tài)完整，能與多種熒光蛋白和免疫標(biāo)記兼容，可結(jié)合三維組織細(xì)胞術(shù)對(duì)不同類型的、高度混合的細(xì)胞群進(jìn)行定量分析。

通過實(shí)驗(yàn)，可觀察到Ce3D能對(duì)小鼠肺、腸、肝等組織及整段股骨進(jìn)行有效透明化。除此之外，Gerner團(tuán)隊(duì)利用Ce3D成功透明化成像人體組織的活檢樣本。最近研究發(fā)現(xiàn)Ce3D與RNA轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)兼容，通過RNAscope檢測(cè)方法結(jié)合Ce3D抗體染色，可以進(jìn)行細(xì)胞表型分析及對(duì)厚組織中的RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行高質(zhì)量檢測(cè)。Bossolani等[25]認(rèn)為Ce3D是實(shí)現(xiàn)小鼠腸段快速3D成像的最有效方法，其能幫助顯示胃腸壁內(nèi)神經(jīng)-免疫-血管交互網(wǎng)絡(luò)中的不同細(xì)胞亞群。

3 水凝膠嵌入法水性透明化技術(shù)

水凝膠嵌入法水性透明化技術(shù)是將樣本包埋在水凝膠中，使水凝膠與樣本中的蛋白質(zhì)和核酸分子形成共價(jià)連接以便固定和保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，再將樣本置于透明化試劑透明化試劑中，通過被動(dòng)擴(kuò)散或者電泳快速去除脂質(zhì)，最后將樣本置于高折射率溶液中進(jìn)行透明化。

3.1 CLARITY

CLARITY是Chung等[26]發(fā)明的與傳統(tǒng)水性透明化方法不同的組織透明技術(shù)。該技術(shù)通過將配置好的水凝膠溶液灌注入小鼠體內(nèi)，使樣本轉(zhuǎn)變?yōu)閯傂运z狀態(tài)，然后通過SDS對(duì)組織樣本進(jìn)行洗滌，最后采用電泳的方式將緩沖液中包裹脂質(zhì)的SDS膠束從組織樣本中去除。CLARITY在光學(xué)透明的基礎(chǔ)上減少了熒光蛋白的淬滅，并且兼容大體積組織樣本的免疫熒光標(biāo)記。Zheng等[27]對(duì)水凝膠的配置進(jìn)行了改進(jìn)，添加了丙烯醛以提高組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Tomer等[28]、Yang等[29]和Zhang[30]團(tuán)隊(duì)都認(rèn)為CLARITY的電泳步驟需要改進(jìn)，他們將電泳改進(jìn)為恒溫?fù)u床操作被動(dòng)除脂，但透明速率的削弱可能會(huì)降低成像深度，所以即使電泳步驟會(huì)導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)損傷及膨脹，但對(duì)于提高透明效率是必需的。

目前已有研究者將CLARITY應(yīng)用于多種神經(jīng)疾病的研究上，如自閉癥患者的神經(jīng)元細(xì)胞變化，灰質(zhì)萎縮癥的病因機(jī)制[31]， AD患者病變腦部Aβ、tau和神經(jīng)絲的三維結(jié)構(gòu)重建[32]，帕金森患者腦部死后病理狀態(tài)，線粒體疾病中神經(jīng)退行性變的機(jī)制[33]等。也有研究者將該技術(shù)應(yīng)用于各種器官組織。Lee等[34]改良了CLARITY技術(shù)，將其應(yīng)用于胰腺、肝等組織；Saritas等[35]借助其觀察到飲食中鉀元素缺乏會(huì)導(dǎo)致腎小管發(fā)生適應(yīng)性變化； Cronan等[36]借助其揭示了分枝桿菌引起腫瘤病變的病理機(jī)制，還獲得了肉芽腫瘤的三維可視化結(jié)構(gòu)； Font-Burgada等[37]借助其成功發(fā)現(xiàn)并定位轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的HybHP； Greenbaum等[38]研發(fā)了Bone CLARITY技術(shù)，實(shí)現(xiàn)小鼠椎體和長(zhǎng)骨骨干的三維重建，為骨骼疾病病理基礎(chǔ)研究提供了新的思路。

3.2 PACT-PARS

為溫和快速地使整個(gè)生物體透明化， Treweek團(tuán)隊(duì)[29，39]提出了PACT-PARS技術(shù)，他們使用了一種折射率耦合試劑，這種被動(dòng)透明技術(shù)稱為PACT，運(yùn)用于全身細(xì)胞的技術(shù)稱為PARS。Treweek團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了試劑，去除雙丙烯酰胺，配置8% SDS透明化試劑，用持續(xù)心臟壓力灌注取代ETC驅(qū)動(dòng)，促進(jìn)組織透明化并保存了熒光信號(hào)。

PACT-PARS技術(shù)可以應(yīng)用于嚙齒類動(dòng)物的大多數(shù)器官及人體病理性活檢組織，結(jié)合細(xì)胞免疫組化技術(shù)和熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞甚至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Dabrowska團(tuán)隊(duì)[40]利用PACT-PARS技術(shù)研究了在癲癇發(fā)作時(shí)海馬體到雙側(cè)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)通路狀況，并探究了癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)傳播路徑及逆行性遺忘的病理機(jī)制。但PACT-PARS技術(shù)是利用生物體體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)將試劑擴(kuò)散到整個(gè)組織，由于各個(gè)組織血管網(wǎng)分布不均勻，所以不同器官透明化的程度和速度也不盡相同。

3.3 SHIELD

為實(shí)現(xiàn)組織的透明化，學(xué)者們往往會(huì)選擇生物酶、化學(xué)物質(zhì)、高溫等方法，即使采用水凝膠保護(hù)生物大分子，也無法避免結(jié)構(gòu)損傷。因此，Chung團(tuán)隊(duì)[41-42]發(fā)明了SHIELD透明化技術(shù)，通過環(huán)氧化物PP3E(polyglycerol-3-polyglycidyl ether)固定組織實(shí)現(xiàn)保護(hù)蛋白的作用，之后未采取丙烯酰胺凝膠包埋組織，而是使用SDS進(jìn)行被動(dòng)或主動(dòng)除脂，最后對(duì)組織進(jìn)行透明化，解決了組織結(jié)構(gòu)和熒光蛋白的保護(hù)問題。借助SHIELD透明化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的人腦組織塊的透明化及對(duì)臨床腦穿刺組織和單個(gè)神經(jīng)元以及其周圍突觸簇的成像。

3.4 SWTICH

SWITCH是Murray等[43]研究的一種基于戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)的新型透明化技術(shù)，GA不需要進(jìn)行灌注即可滲透組織并形成均勻的組織凝膠，可應(yīng)用于動(dòng)物及人體的大型組織，且步驟簡(jiǎn)單。GA組織凝膠便于多輪免疫標(biāo)記，在應(yīng)用SDS高溫脫脂后可實(shí)現(xiàn)組織樣本的快速透明，并且可以高度保護(hù)內(nèi)源性生物分子及其抗原性，保證結(jié)構(gòu)完整性，使組織損傷達(dá)到最小化。Murray 團(tuán)隊(duì)利用SWTICH技術(shù)分析了人類皮質(zhì)組合蛋白譜，并成功實(shí)現(xiàn)小鼠脊髓髓鞘的可視化。然而該技術(shù)仍存在一些問題，如用GA固定組織會(huì)導(dǎo)致廣譜自發(fā)熒光的增加，由于mRNA在高溫下不穩(wěn)定，因此其與需要保留mRNA的方法不兼容，高溫可能會(huì)導(dǎo)致組織褐變等。盡管SWITCH可以處理大樣本，但標(biāo)記速度仍然從根本上受到被動(dòng)擴(kuò)散的限制。

3.5 ACT-PRESTO

Lee等[44]開發(fā)了ACT-PRESTO技術(shù)來實(shí)現(xiàn)大型組織樣本的快速處理，并與免疫標(biāo)記兼容，可標(biāo)記深層結(jié)構(gòu)，操作簡(jiǎn)單易行，有利于增加臨床上一些疾病的診斷速度。ACT-PRESTO技術(shù)分為兩個(gè)部分，即ACT主動(dòng)透明化技術(shù)及PRESTO促進(jìn)大分子滲透的步驟，能于數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)完成組織透明化。Dai等[45]利用皮神經(jīng)活檢技術(shù)結(jié)合ACT-PRESTO實(shí)現(xiàn)了周圍神經(jīng)纖維的三維成像。

4 總結(jié)與展望

與傳統(tǒng)的組織切片及二維成像技術(shù)相比，組織透明化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了完整的組織或器官透明化，避免了組織切片對(duì)樣本的扭曲，提高了成像效率，因此具有良好的應(yīng)用前景。也可將此技術(shù)作為輔助方法用于疾病模型的診斷和建立。油性透明化技術(shù)由于需要脫水去脂，因此容易導(dǎo)致熒光蛋白的淬滅，而水性技術(shù)則可有效解決這一問題。

目前大多數(shù)水性透明化技術(shù)多應(yīng)用于軟組織的成像，對(duì)于硬組織的透明化研究及效果并不理想。除此之外，盡管透明化技術(shù)進(jìn)一步加深了組織成像深度，但仍無法完美地應(yīng)用于大體積樣本，如人體組織器官的完整成像。因此針對(duì)大體積樣本的透明化仍是一個(gè)需要攻克的難題。在未來，水性透明化技術(shù)應(yīng)著重研究更先進(jìn)的透明化試劑及方案以提高靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人類組織器官的透明化效果，提升透明化速度的同時(shí)保留熒光蛋白，與脂溶性示蹤劑和免疫標(biāo)記技術(shù)兼容，增加抗體滲透速率和深度，從而完善免疫標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)器官組織亞細(xì)胞分辨程度上的快速成像。未來水性透明化技術(shù)可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為基礎(chǔ)科學(xué)的疾病機(jī)制的研究提供思路，為疾病的診斷提供精準(zhǔn)的病理學(xué)依據(jù)，為需要靶向治療器官組織的定位提供幫助。