龍曉雪 楊宏宇 薛艷麗 宋紅芳

0 引言

青光眼作為世界第一位不可逆致盲眼病，以視神經(jīng)萎縮、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡、視盤凹陷為主要標志性病變[1]。眼壓升高一直是青光眼最危險的因素之一，眼壓升高可導致RGCs的凋亡[2]。RGCs屬于高度分化的細胞，一旦凋亡便無法補充，因此阻止RGCs在高眼壓影響下的凋亡對于防治青光眼尤為重要。細胞凋亡與細胞自噬功能相關。細胞自噬，可以將細胞內(nèi)多余或受損細胞器包裹并送到溶酶體降解，實現(xiàn)蛋白質的再利用，通過大分子的分解代謝，產(chǎn)生代謝底物，滿足饑餓細胞的生物能量需求，從而允許適應性蛋白質的合成[3]。自噬可以與凋亡合作、協(xié)助或對抗，從而影響細胞的不同命運，細胞環(huán)境的穩(wěn)定需要這兩種細胞死亡模式之間的相互平衡[4]。研究證明，在慢性高眼壓動物模型中，細胞自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達增加，神經(jīng)節(jié)細胞層能看到自噬體的積累，說明慢性高眼壓使RGCs中自噬被激活[5-6]，并且RGCs在壓力作用下其自噬功能會先被激活來保護細胞，直至壓力達到激活凋亡的閾值，才引起細胞凋亡[7]。這些現(xiàn)象提示細胞自噬可能成為青光眼治療干預的新靶點。

已有研究表明，運動可以影響細胞的自噬與凋亡。一方面，規(guī)律的運動鍛煉可以降低凋亡水平，對于急性高眼壓模型[8-9]、光誘導視網(wǎng)膜損傷模型[10-11]和糖尿病模型[12-13]，運動可以增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的含量水平促進其表達，還能夠改善線粒體的功能，減少氧化應激反應，從而減少RGCs的凋亡，減緩視網(wǎng)膜功能的退化。另一方面，運動會引起細胞自噬的變化，根據(jù)發(fā)揮作用的不同，自噬有兩種變化趨勢：(1) 運動可激活細胞自噬。短期運動在導致心肌細胞凋亡的同時可以激活心肌細胞的自噬，而長期運動可以降低心肌細胞凋亡，增強其自噬的激活以加強心肌的保護功能[14]。研究表明8周的抗阻訓練可以刺激外周血單個核細胞自噬，阻止炎癥小體的激活，減少老年人外周血單個核細胞的凋亡[15]。Kwon等[16]提出運動誘導的肝臟細胞自噬與細胞凋亡呈負相關，運動能提高細胞自噬和抗氧化能力，增強合成代謝信號傳導，可能是一種有效對抗多種肝臟疾病的非藥物治療策略。(2) 運動可降低細胞自噬。體育鍛煉可以減少大鼠短暫性大腦中動脈閉塞模型梗死周圍區(qū)域神經(jīng)細胞的自噬體積累、減少細胞凋亡和增強神經(jīng)功能[17]。游泳運動可改善糖尿病誘導的骨骼肌萎縮的肌肉質量，這提示糖尿病中細胞自噬的激活通過高分解代謝促進了肌肉萎縮，有氧運動通過抑制細胞自噬，可能改變或逆轉糖尿病患者的骨骼肌萎縮[18]。由上可見，運動對各部位細胞自噬的影響是多方面的。

目前運動對視網(wǎng)膜內(nèi)細胞自噬的作用還鮮有研究，尤其是慢性高眼壓環(huán)境下，運動對視網(wǎng)膜內(nèi)細胞自噬與凋亡的影響，還有待探索。因此本文對接受與不接受運動訓練的慢性高眼壓動物模型進行對比實驗，研究兩種模型視網(wǎng)膜內(nèi)細胞自噬與凋亡的發(fā)生水平，結合RGCs的存活數(shù)量，判斷細胞自噬發(fā)揮的作用，為青光眼的運動治療方法提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

選取8周齡雄性SD大鼠32只(體質量260.00 g±20.00 g)，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白對照(control，CON)組、中度運動訓練(moderate intensity training，MT)組、輕度運動訓練(low intensity training，LT)組和靜置慢性高眼壓(chronic ocular hypertension，COH)組，每組8只。采用正常飲食喂養(yǎng)，12 h循環(huán)光照飼養(yǎng)。CON組不做任何處理；MT、LT、COH組為慢性高眼壓大鼠模型。本實驗得到首都醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 運動訓練

適應性喂養(yǎng)3 d后，采用大鼠轉輪式疲勞儀(YLS-15A，上海玉研科學儀器有限公司)進行運動訓練，前3天采用由慢到快、逐漸加速訓練，最終步速達到23 m/min。訓練成功的標準是大鼠能夠以23 m/min的步速完成20 min不間斷跑步。隨后對MT、LT和COH組進行高眼壓造模。造模后MT與LT組繼續(xù)接受每日運動訓練，步速分別為23 m/min(約最大耗氧量70%)和17 m/min(約最大耗氧量58%)[19-20]，持續(xù)60 min，每日訓練1次，每周訓練5 d，持續(xù)3周。COH組不做任何運動訓練。

1.3 慢性高眼壓模型建立

采用烙閉上鞏膜靜脈并在球結膜下注射25 mg/mL氟尿嘧啶(0.05 mL/只，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)的方法[21]使右眼眼壓升高，左眼不做處理。造模成功的標準是左右眼壓差高于15 mmHg(1 mmHg=133.322 Pa)并維持3周。

1.4 檢測方法

1.4.1 Western blot檢測

采用頸椎脫臼法同時處死4組動物,每組各4只。取右眼視網(wǎng)膜，充分裂解，離心后取上清。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制15% 分離膠，濃縮膠濃度為5%。上樣8 μL，濃縮膠恒壓90 V，約120 min，分離膠恒壓120 V，約90 min。濕轉法轉膜60 min后5%BSA-TBST封閉60 min。用5%BSA-TBST稀釋一抗LC3(1∶1000，CST)， 4 ℃水平搖床孵育過夜。次日5%BSA-TBST稀釋二抗(1∶10000，Jackson)孵育。ECL反應液做發(fā)光底物，用X線膠片暗室曝光，掃描，用軟件Gel Image system ver.4.00 (tanon，中國)分析蛋白條帶灰度值。

1.4.2 免疫組化染色

每組各取4只右眼眼球進行石蠟包埋切片。切片脫蠟、水化后浸入EDTA抗原修復液(北京中科萬邦生物科技有限公司)并加熱進行抗原修復，冷卻后加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，PBS沖洗后采用3%BSA對一抗LC3(1∶1000，CST)、Beclin1(1∶100，abcam)、Bax(1∶500，abcam)、Bcl-xl(1∶500，CST)、NeuN(1∶400，CST)進行稀釋，37 ℃孵育60 min；滴加反應增強液，37℃孵育20 min；滴加PBS稀釋的增強酶標山羊抗兔IgG聚合物(1∶500，Jackson)，37 ℃孵育20 min，DAB顯色后復染、封片與觀察。采用Image-Pro Plus 6.0(MEDIA CYBERNETICS，美國)軟件進行圖像分析，以平均積分光密度值(mean of IOD)作為蛋白的陽性表達水平。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

通過IBM SPSS Statistics 25(IBM，美國)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，結果用均數(shù)±標準差表示。首先檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若符合，統(tǒng)計方法采用單因素方差(one-way ANOVA)分析；若不符合，統(tǒng)計方法采用Kruskal-Wallis H 檢驗。若P<0.05，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RGCs數(shù)量

3周高眼壓模型眼壓結果如表1所示。與CON組相比，MT組、LT組、COH組造模右眼眼壓明顯高于正常眼眼壓，有統(tǒng)計學意義，壓差在15 mmHg左右，符合高眼壓模型標準。且MT、LT、COH三組間眼壓沒有統(tǒng)計學差異，符合單一變量的原則。各組大鼠RGCs的NeuN染色結果如圖1所示，定量分析結果如圖2所示。COH組RGCs數(shù)量低于CON組，經(jīng)過運動訓練，MT與LT組RGCs數(shù)量明顯高于COH組。

表1 各組眼壓比較

圖1 RGCs的NeuN染色

圖2 RGCs計數(shù)

2.2 自噬表達結果

Western blot條帶與半定量分析結果如圖3、圖4所示。COH組LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化量明顯升高，其他3組無差異。免疫組化實驗得到的LC3、Beclin1積分光密度值分析結果如圖5、圖6所示，其中LC3免疫組化與Western blot結果相符。說明慢性高眼壓造模會提高LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化量并上調Beclin1表達，中度與輕度運動會降低LC3轉化量與Beclin1表達量，細胞自噬水平有所降低。

圖3 LC3條帶

圖4 LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化量

圖5 自噬相關蛋白表達量

圖6 視網(wǎng)膜LC3、Beclin1染色

2.3 凋亡表達結果

TUNEL染色顯示的凋亡RGCs細胞如圖7所示，COH組凋亡細胞數(shù)高于另外三組。免疫組化得到的Bax、Bcl-xl積分光密度值分析結果(圖8、圖9)，Bax蛋白表達COH組明顯高于CON、MT、LT三組，Bcl-xl蛋白表達COH組明顯低于CON、MT、LT三組。說明慢性高眼壓造模會上調Bax表達并下調Bcl-xl表達，中度與輕度運動會降低Bax表達量并提升Bcl-xl表達量，細胞凋亡水平有所降低。

圖7 TUNEL凋亡染色

圖8 凋亡相關蛋白表達量

圖9 視網(wǎng)膜Bcl-xl、Bax染色

3 討論與結論

本文通過對慢性高眼壓大鼠進行中輕度訓練，對比研究視網(wǎng)膜細胞自噬與凋亡的情況，通過檢測Beclin1、LC3、Bax、Bcl-xl四種蛋白的表達變化，發(fā)現(xiàn)中輕度運動會降低LC3轉化量與Beclin1、Bax表達量，提升Bcl-xl表達量，說明3周的中輕度訓練均可以下調慢性高眼壓造成的RGCs自噬與凋亡水平，兩種運動強度沒有明顯差異，說明中度、輕度訓練均有利于修復慢性高眼壓造成的視網(wǎng)膜損傷。

Beclin1可促進自噬體在細胞應激反應中的形成，自噬成核階段需要Beclin1[22]。LC3是自噬體膜上的標志性蛋白質，自噬激活時LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ[23]。Beclin1與LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的表達可作為自噬水平的判斷依據(jù)。Bax是典型的促凋亡基因，Bcl-xl是主要表達在視網(wǎng)膜的抗凋亡基因，二者的變化可反應凋亡的分子機制[24]。本文通過對這四種蛋白的檢測，結合RGCs染色計數(shù)及凋亡染色，說明了運動可以降低慢性高眼壓動物模型視網(wǎng)膜細胞的自噬與凋亡水平，進而減少RGCs的損失量，對視網(wǎng)膜產(chǎn)生一定的保護作用。

自噬與凋亡是兩種不同的程序性細胞死亡機制。細胞受到刺激時，一般自噬先于凋亡發(fā)生，自噬的激活在一定程度上可以抑制凋亡的發(fā)生；當刺激達到一定閾值，自噬會誘導凋亡的發(fā)生。因此，運動引起的自噬水平會有升高、降低兩種趨勢。

本文研究表明3周的持續(xù)高眼壓作用下，細胞自噬產(chǎn)生誘導細胞凋亡的作用，運動可以降低細胞自噬水平，與部分疾病模型[17-18]研究結果相符；與其他研究中運動提升細胞自噬水平的結果[14-16]相異。分析原因，一方面可能是疾病模型與正常模型的區(qū)別，正常模型中運動提升基礎自噬水平產(chǎn)生保護作用，疾病模型中自噬被過度激活，運動通過下降過度的細胞自噬產(chǎn)生保護作用；另一方面可能與運動時間和強度相關。本文中設計了兩種運動強度，但產(chǎn)生效果相似，均可以降低細胞自噬與凋亡的水平，提示MT與LT均屬于適度運動，運動的其他作用仍需要進一步細化運動分級來驗證，比如考慮不同的運動方式[25]。本文就運動影響視網(wǎng)膜細胞自噬的表現(xiàn)進行了說明，但運動信號如何傳遞至視網(wǎng)膜細胞引起自噬反應，是通過代謝系統(tǒng)還是血液循環(huán)系統(tǒng)等原因仍未可知。此外，關于細胞自噬受外界刺激由抗凋亡作用到促凋亡作用轉變的臨界點仍不明確，可結合自噬發(fā)生的分子機制進一步探究。