張曉輝 劉紅芳 席麗艷,2,3

[1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣州 510091；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣州 510120；3.廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)，廣州 510013]

固有免疫是宿主抵御真菌感染的第一道防線，它主要是依靠免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞等)對病原菌的吞噬和清除作用來抵抗病原菌的入侵。中性粒細(xì)胞作為一種重要的天然免疫細(xì)胞，是宿主抵抗致病微生物的第一道防線，通過吞噬或分泌細(xì)胞外細(xì)胞毒性物質(zhì)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的釋放引發(fā)氧化殺傷，阻止入侵的真菌進一步的增殖、播散[1-3]。中性粒細(xì)胞除了吞噬清除病原體外，還可形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng) (neutrophil extracellular trap，NET)，這些纖維由染色質(zhì)組成，這些染色質(zhì)嵌有抗菌蛋白以捕獲和殺死真菌這類難以吞噬的大型病原體[4]。NET自十余年前發(fā)現(xiàn)以來，一直是研究的熱點，大量研究表明這種中性粒細(xì)胞功能與控制多種真菌感染有顯著相關(guān)性。

1 NET的形成機制

NETs于2004年被發(fā)現(xiàn)[5]，最早的機制研究認(rèn)為它的形成是一種新型細(xì)胞死亡途徑，其形成過程是激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和Raf/MEK/ERK通路使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)致密顆粒溶解，從而發(fā)生自噬，進一步生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)，導(dǎo)致抗菌蛋白鑲嵌在核染色質(zhì)上，隨后中性粒細(xì)胞將這些混合物釋放到細(xì)胞外[6]。這一過程常持續(xù)數(shù)小時，并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡，又稱為“NETosis”[7]，在此過程中通過NADPH氧化酶產(chǎn)生大量ROS是觸發(fā)NET形成的關(guān)鍵因素，NETs結(jié)構(gòu)中的MPO、組蛋白等抗菌蛋白捕獲致病微生物后，可將其殺滅并降解，防止進一步擴散[6]。而后，Yousefi等[8]研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞NET的形成并不需要中性粒細(xì)胞的死亡，由活細(xì)胞形成的NET包含線粒體，但沒有核DNA。這種NET的形成與ROS有關(guān)，可能是依賴NADPH氧化酶的。但當(dāng)使用某些細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌)刺激時，NET的釋放可不依賴于ROS。研究中的中性粒細(xì)胞核DNA被包裝成囊泡后與質(zhì)膜融合，將其DNA釋放到外部。整個過程非常獨特和快速(5～60 min)[9]。近期研究顯示，與酚溶性調(diào)節(jié)蛋白α(PSMα)相互作用后，嗜中性粒細(xì)胞也可以形成NET樣結(jié)構(gòu)。PSMα誘導(dǎo)的NETs包含典型的蛋白質(zhì)標(biāo)記，且能夠捕獲微生物。但與經(jīng)典NETosis相反，PSMα觸發(fā)的NET形成非常迅速，獨立于ROS或MPO發(fā)生[10]，類似通過激活鈣通道誘導(dǎo)NETs。在缺乏功能性NADPH氧化酶的情況下，連續(xù)的鈣流入激活其相關(guān)的鉀通道亦可誘發(fā)NETs[11]。由此可見，NETosis的觸發(fā)及表現(xiàn)形式多種多樣，這對于中性粒細(xì)胞的多功能性及抵抗各種病原體具有重要意義。

2 NET與念珠菌

2.1 白念珠菌

白念珠菌(C.albicans)的主要毒力之一是其可逆性從單芽發(fā)芽細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀菌絲的能力。研究表明它可誘導(dǎo)NET形成，其菌絲和酵母孢子的細(xì)胞外殺傷依賴于NET，20%～30%的白念珠菌殺滅是細(xì)胞外的[4,12]。Metzler等[13]在一些MPO完全缺乏的患者中觀察到嚴(yán)重的微生物感染，尤其是念珠菌感染。在完全缺乏MPO的機體，中性粒細(xì)胞不能形成NETs，白念珠菌的生長也無法受到抑制，表明MPO是NET形成所必需的。NET的釋放在控制微生物感染的同時，對局部組織亦有破壞作用，這與中性粒細(xì)胞蛋白酶[如彈性蛋白酶(NE)和蛋白酶3]的蛋白水解活性以及MPO的氧化特性有關(guān)。在真菌感染過程中，嗜中性粒細(xì)胞主要通過NET的脫?；蛐纬蓪E釋放到環(huán)境中。這個過程均受α1-蛋白酶抑制劑(A1PI)控制。使用天冬氨酸蛋白酶滅活A(yù)1PI，可影響NET依賴性的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進而導(dǎo)致白念珠菌局部定植的增加[14]。Byrd等[15]研究細(xì)胞間基質(zhì)(ECM)中的纖連蛋白(Fn)在NETs形成中的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)人中性粒細(xì)胞識別純化的白念珠菌β-葡聚糖后，將NET釋放到Fn的作用很強。這種釋放取決于補體受體3(CR3)對β-葡聚糖的識別，而不取決于Dectin-1或ROS，且需要Fn和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號。

近期研究還表明白念珠菌除了主要的細(xì)胞壁構(gòu)建多糖(甘露聚糖和β-葡聚糖)以外，其分泌的天冬氨酸蛋白酶(Saps)也可以觸發(fā)強度可變的NET，其中引起NET釋放最有效的是由真菌菌絲分泌的Sap4和Sap6。這個過程涉及ROS依賴性和ROS非依賴性兩種信號傳導(dǎo)途徑，主要通過與CD11b受體的相互作用實現(xiàn)。而中性粒細(xì)胞與細(xì)胞壁上的Sap9和Sap10接觸后，則是利用CD16和CD18受體識別蛋白酶并依賴ROS作出反應(yīng)。除了Saps外，作者還發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖通過與Dectin-1以及CD11b和CD18受體結(jié)合觸發(fā)ROS依賴的NET產(chǎn)生；而甘露聚糖被TLRs、CD14和Dectin-1受體識別后則主要通過ROS非依賴性途徑觸發(fā)NET釋放[16]。此外，最新研究鑒定出Dectin-2亦可識別白念珠菌并介導(dǎo)NET的形成。Dectin-2激活下游Syk-Ca2+-PKCδ-蛋白精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)信號通路，該信號通路可調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞NE、組蛋白瓜氨酸化和NETosis的核易位。這種NETosis是NADPH氧化酶非依賴性的，有助于抑制真菌的播散[17]。

2.2 其他念珠菌

耳念珠菌(C.auris)是一種新發(fā)現(xiàn)的真菌病原體，引起醫(yī)院侵襲性念珠菌病暴發(fā)，目前對耳念珠菌的發(fā)病機理知之甚少[18-19]。Johnson等[20]發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞不能有效殺死耳念珠菌，而耳念珠菌感染中也未發(fā)現(xiàn)NETs。近平滑念珠菌(C.parapsilosis)感染內(nèi)皮細(xì)胞的研究中，作者發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞會在內(nèi)皮細(xì)胞表面巡邏，并殺死大多數(shù)黏附的真菌細(xì)胞，但對于內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞的近平滑念珠菌卻沒有殺傷作用，研究中亦檢測不到NETs的形成，說明NETs的釋放有賴于中性粒細(xì)胞與近平滑念珠菌的直接接觸[21]。有趣的是缺乏纖絲能力的光滑念珠菌(C.glabrata)能通過吞噬作用依賴性途徑引發(fā)NETs，其浮游及生物膜兩種生長模式均可觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放NETs，但光滑念珠菌形成生物膜后，中性粒細(xì)胞針對其產(chǎn)生的ROS水平明顯較低，所釋放的NETs也明顯少于對浮游形態(tài)細(xì)胞的反應(yīng)[22]。

3 NET與曲霉

3.1 煙曲霉

曲霉菌是無處不在的環(huán)境真菌，免疫力受損的患者如吸入其孢子則可能發(fā)生侵襲性曲霉病并危及生命，其中煙曲霉(A.fumigatus)是最常見的病原體[23]。McCormick等[24]發(fā)現(xiàn)煙曲霉的分生孢子和胚芽管都能觸發(fā)NET的形成，但中性粒細(xì)胞不會殺死胚芽管，而是降低其極性生長。這種抑制作用取決于NETs，且可以通過添加DNase-1降解NET來消除。Zn2+螯合鈣衛(wèi)蛋白也與煙曲霉菌誘導(dǎo)的NETs相關(guān)，主要機制是鈣衛(wèi)蛋白對鋅的消耗。添加Zn2+即可消除NET介導(dǎo)的生長抑制。另一些研究也支持了NET不能直接殺滅煙曲霉的菌絲和孢子這一觀點[25-26]。更進一步的研究顯示針對煙曲霉感染的NET形成需要PAD4和CR3(CD11b/CD18)介導(dǎo)的ROS生成。PAD4是染色質(zhì)縮聚的關(guān)鍵介質(zhì)，用于催化組蛋白瓜氨酸化。但作者觀察到角膜感染煙曲霉的C57BL/6和PAD4基因缺陷(Pad4-/-)小鼠在菌絲生長和角膜渾濁度方面沒有差異，這說明在體外或感染的過程中，機體并不需要PAD4依賴的NETosis來控制菌絲生長或真菌感染[27]。

Alflen等[28]建立侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)的小鼠模型，用瓜氨酸化組蛋白H3(citH3)的量來衡量NET的形成。研究發(fā)現(xiàn)PAD4-/-小鼠感染煙曲霉的分生孢子后，肺中的真菌負(fù)荷降低；與野生型對照相比，其急性肺損傷減輕，且TNF-α和citH3的濃度也較低。這些結(jié)果表明NETs的釋放雖可限制真菌生長，但PAD4的存在也會降低IPA小鼠中煙曲霉的清除率，并導(dǎo)致急性肺損傷。在最新關(guān)于NET形成的信號通路研究中發(fā)現(xiàn)煙曲霉誘導(dǎo)的NET釋放需要NADPH氧化酶2(NOX2)復(fù)合物產(chǎn)生活性氧，在下游中還需要CD11b/CD18、Src激酶家族、酪氨酸激酶Syk和IA級PI3激酶δ(磷脂酰肌醇3激酶)[29]。盡管Dectin-1與煙曲霉的免疫識別有關(guān)[30]，但對于煙曲霉誘導(dǎo)的NET釋放卻是可有可無的；而CD11b/CD18對于煙曲霉病的NET釋放則至關(guān)重要，其中CD11b I結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的識別是關(guān)鍵，研究中阻斷其CD11b凝集素結(jié)構(gòu)域并不影響煙曲霉誘導(dǎo)的NET釋放[29]。

3.2 構(gòu)巢曲霉

在患有慢性肉芽腫性疾病(chronic granulomatous disease,CGD)的患者中，構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)易發(fā)生侵襲性感染，是CGD患者死亡的主要原因[31]。CGD患者的NADPH氧化酶功能受損，導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞的抗菌活性較差，無法產(chǎn)生NETs。通過基因治療，CGD患者重建NET的形成可恢復(fù)機體中性粒細(xì)胞清除構(gòu)巢曲霉分生孢子和菌絲的能力，使難治性侵襲性肺曲霉病快速治愈，證實了功能性NADPH氧化酶在NET形成中的作用和抗真菌活性[32]。作者進一步的研究表明基因治療后CGD患者的NET恢復(fù)抗構(gòu)巢曲霉防御能力具有鈣蛋白依賴性；強調(diào)了鈣衛(wèi)蛋白(S100A8/A9)是NETs的關(guān)鍵抗真菌成分，亦具有抗構(gòu)巢曲霉活性。通過螯合Zn2+，鈣衛(wèi)蛋白可抑制構(gòu)巢曲霉的生長，并在較高濃度下可誘導(dǎo)不可逆的鋅饑餓，結(jié)果證明鈣衛(wèi)蛋白在人先天抵抗曲霉菌感染的免疫防御中具有關(guān)鍵作用[24,33]。

3.3 黃曲霉

Kandhavelu等[34]對黃曲霉(A.flavus)引起的角膜炎患者眼淚中嗜中性粒細(xì)胞初級顆粒蛋白、核定位的組蛋白和其他NET特異性蛋白進行鑒定，發(fā)現(xiàn)患者眼淚中胞質(zhì)蛋白和鈣衛(wèi)蛋白的水平增加了5倍，這表明NETosis可能在清除黃曲霉菌絲中發(fā)揮了作用，但關(guān)于其具體機制有待進一步研究。

4 NET與其他真菌

4.1 巴西副球菌

巴西副球菌(P.brasiliensis)引起的巴西芽生菌病是一種系統(tǒng)性真菌病，在大多數(shù)拉丁美洲國家特別是巴西流行。有研究已證實巴西副球菌的分生孢子和酵母形式可誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET[35-37]，且NET的形成可依賴或獨立于ROS產(chǎn)生，而是否產(chǎn)生ROS與刺激中性粒細(xì)胞的真菌形態(tài)有關(guān)[37]。Dectin-1受體是巴西副球菌結(jié)合并誘導(dǎo)NETs釋放的主要模式識別受體[37]。

值得一提的是，NETs對巴西副球菌是否有殺滅作用仍有待商榷。Mejia等[36]在實驗中分別在人中性粒細(xì)胞與巴西副球菌(Pb60855菌株)的共培養(yǎng)體系中加入DPI、DNAse I或細(xì)胞松弛素D處理。當(dāng)比較不同組之間的菌落形成單位(CFU)數(shù)時，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，因而得出NETs對巴西副球菌沒有殺滅作用的結(jié)論。但Bachiega等[37]使用巴西副球菌強毒力株(Pb18菌株)進行研究卻發(fā)現(xiàn)加入DNAse共培養(yǎng)會顯著抑制中性粒細(xì)胞的殺菌活性，顯示了NETs對巴西副球菌的殺滅作用；說明人中性粒細(xì)胞殺死巴西副球菌既依賴吞噬作用又依賴于NET的細(xì)胞外機制。由于已發(fā)表的研究成果有限，尚不明確為何兩個研究結(jié)論截然相反，可能與使用不同的菌株進行研究有關(guān)，也可能存在其他機制，仍待后續(xù)研究探討。

4.2 新生隱球菌

這種致病菌以酵母菌的形式在宿主中傳播，主要感染肺部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[38]。研究證實NET對新生隱球菌(C.neoformans)有殺滅作用，盡管新生隱球菌和莢膜成分GXM可抑制人類嗜中性粒細(xì)胞中NET的產(chǎn)生，是一種潛在的新的重要調(diào)控因子。中性粒細(xì)胞NE、MPO、膠原酶和組蛋白是誘導(dǎo)NET殺菌活性的關(guān)鍵成分，其相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑取決于ROS和PAD4[39]。另格特隱球菌(C.gattii)亦可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放NETs，但它可形成細(xì)胞外纖維結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)增強了其對中性粒細(xì)胞殺傷的抵抗力[40]。

4.3 疣狀毛癬菌

國內(nèi)張秀軍等[41]率先在疣狀毛癬菌(T.verucosum)感染患者中研究了NET的抗感染作用。研究發(fā)現(xiàn)小鼠組織中可見明顯的NETs結(jié)構(gòu)，體外實驗亦證實NETs對疣狀毛癬菌有殺滅作用。

5 結(jié) 語

綜上所述，研究表明NET具有多種刺激因子、信號傳導(dǎo)途徑及釋放機制。鑒于報道的多樣性，NETs釋放不再只是殺菌，而是有更多樣化的功能，如誘捕真菌以防止其傳播和阻止進一步感染?，F(xiàn)有關(guān)于NET和真菌的免疫研究主要集中在念珠菌屬和曲霉菌屬，有少量關(guān)于巴西副球菌和隱球菌的報道，但在其他深部真菌病病原體如暗色真菌、孢子絲菌和馬爾尼菲青霉(籃狀)菌等的研究暫未見報道。隨著研究的不斷深入，在其他病原真菌開展NETs的進一步研究將補充其誘導(dǎo)條件、釋放機制及其抑/殺菌作用的具體環(huán)境等。