付容 張振穎 侯彬彬

(1.大連醫(yī)科大學,大連 116044； 2.香港大學深圳醫(yī)院皮膚科,深圳 518053； 3.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，大連 116021)

雙相型真菌是一類特殊類型的致病真菌，在不同環(huán)境下具有不同的形態(tài)，其中溫度是誘發(fā)其發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)換的一個中心因素，在室溫條件下為以腐生方式生長的菌絲相，在37℃或人體中轉(zhuǎn)化為具有致病能力的酵母相[1]。這種形態(tài)轉(zhuǎn)換極有可能是其致病機制的關鍵。因此對雙相型真菌致病機制的研究有利于這一類疾病的進一步防治。由菌絲相轉(zhuǎn)換為酵母相的形態(tài)轉(zhuǎn)化是雙相型真菌具有致病能力的必備條件[2]。若人體通過吸入途徑感染雙相型真菌，可表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀甚至發(fā)展為威脅生命的全身性疾病，有報道每年世界范圍內(nèi)約150萬人因感染雙相型真菌而死亡[3]。雙相型真菌主要包括皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesimmitis)、馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei)和申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)[4]。研究發(fā)現(xiàn)雙相型真菌的致病機制是治療和預防雙相真菌病的關鍵，本文就雙相型真菌致病機制進展的關鍵問題進行系統(tǒng)分析和綜述。

1 雙相性轉(zhuǎn)化及其機制

雙相型真菌的菌絲相生長在自然界中，生長溫度在22～25℃之間，之后可產(chǎn)生霧化的分生孢子，大多數(shù)主要通過呼吸道侵入人體，在體溫(37℃)的誘導下，其形態(tài)會發(fā)生變化，毒性增加，變?yōu)榫哂兄虏⌒缘慕湍赶郲1,5-6]。雙相型真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化是其致病的必備條件，該轉(zhuǎn)化是一個復雜的過程，受信號轉(zhuǎn)導和多種物質(zhì)調(diào)控。

1.1 信號轉(zhuǎn)導

在雙相型真菌中，目前確定的與誘導37℃形態(tài)轉(zhuǎn)化和酵母生長相關的信號傳導途徑主要是：①雙組分信號傳導；②異三聚體G蛋白和Ras信號傳導。

雙組分信號系統(tǒng)通過DRK1(二態(tài)性調(diào)節(jié)組氨酸激酶1)進行調(diào)節(jié)。DRK1基因是真菌由菌絲相轉(zhuǎn)化為酵母相所必需的基因，首先在皮炎芽生菌中發(fā)現(xiàn)，其同源基因也存在于莢膜組織胞漿菌、巴西副球孢子菌和申克孢子絲菌內(nèi)，在申克孢子絲菌中被命名為SsDRK1。DRK1基因編碼一種混合組氨酸激酶，起著全面調(diào)節(jié)雙相型真菌的二態(tài)性和毒力的作用，在感染的小鼠模型中，DRK1缺乏的雙相型菌株在37℃仍然是菌絲體，不能轉(zhuǎn)化為酵母相細胞，不具有毒性，這些菌株還表現(xiàn)出細胞壁完整性的缺陷，并且不能上調(diào)真菌酵母相特異性毒力因子[2,7]。目前研究已證明SsDRK1是申克孢子絲菌酵母相細胞形成、細胞壁完整性、黑色素的合成、形態(tài)發(fā)生相關基因Ste20的轉(zhuǎn)錄所必需的，是申克孢子絲菌致病所必需的物質(zhì)，干擾DRK1基因的mRNA表達會導致真菌的菌絲和酵母相細胞生長延遲[8]。

Ras GTP酶控制多個過程，包括cAMP信號傳導，形態(tài)發(fā)生、分化、細胞周期進程和真菌的致病基因表達。異三聚體G蛋白和Ras信號通路影響巴西副球孢子菌中的形態(tài)轉(zhuǎn)化，菌絲體-酵母轉(zhuǎn)換過程中誘導了異源三聚體G蛋白的α和β亞基，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitor)可抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶活性，使Ras蛋白不能被法尼基化修飾而不能結(jié)合于細胞膜，阻礙膜之間的信息交流，從而破壞了Ras蛋白的功能，促進了酵母菌向菌絲體的形成，逆轉(zhuǎn)正常的形態(tài)轉(zhuǎn)化。

1.2 熱休克蛋白的調(diào)控

熱休克蛋白(Hsp)是一類高度保守的蛋白質(zhì)，具有多種調(diào)節(jié)功能，部分已經(jīng)明確與雙相型真菌的致病性有關，如真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化、毒力等。熱休克蛋白在真菌的致病性中起著主要作用，它參與調(diào)控真菌從土壤到宿主溫度改變誘導的適應性反應。

Hsp60：具有強免疫原性，被認為是莢膜組織胞漿菌的抗原。在人體，Hsp60已被證明能夠誘導莢膜組織胞漿菌素(從莢膜組織胞漿菌的細胞壁中提取出來的物質(zhì)，具有豐富的免疫原性)反應的個體中的淋巴細胞增生[4]。其次，Hsp60是莢膜組織胞漿菌的酵母相細胞與宿主吞噬細胞表面CD11b/CD18(CR3)分子之間的主要細胞識別配體，凸顯出它在真菌致病機制中的重要性[4]。

Hsp70：雙相型真菌菌絲相向酵母菌相過渡的早期，在最初的1 h中，莢膜組織胞漿菌的Hsp70 mRNA和Hsp70的含量迅速升高，隨后大約6h又恢復到原水平，這意味著Hsp70可能與溫度變化引起的熱應激反應和細胞分化有關，可能只在該真菌對高溫生長的最初適應階段被需要[4]。

由于Hsp60和Hsp70具有強免疫原性，有研究者提出，它們是真菌致病時表達的重要蛋白質(zhì)，是感染期宿主免疫反應的靶向目標，因此可作為真菌免疫療法的潛在目標[4]。

Hsp90：存在于大多數(shù)雙相型真菌的菌絲相細胞表面上，在巴西副球孢子菌中，Hsp90可以調(diào)節(jié)真菌的增殖和調(diào)節(jié)真菌體內(nèi)活性氧(ROS)水平，并且可能協(xié)助酵母細胞適應各種生理壓力，包括溫度，宿主相互作用和氧化損傷。這樣的機制通過鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)。研究顯示，封閉Hsp90能抑制真菌酵母相細胞的生長，但是并不影響菌絲相細胞的發(fā)育。雖然Hsp90能調(diào)節(jié)巴西副球孢子菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化，但不是必需的調(diào)控物質(zhì)[4]。

1.3 雌激素的作用

巴西副球孢子菌感染患者男性多于女性，研究證明雌激素能抑制真菌的形態(tài)學轉(zhuǎn)換，也能調(diào)節(jié)宿主的細胞免疫，確切的機制尚不清楚[9]。使用微陣列技術(shù)對該現(xiàn)象進一步分析顯示，在菌絲體向酵母相的轉(zhuǎn)化過程中，雌二醇(E2)、細胞壁重塑、能量代謝和細胞信號傳導之間存在相關性，當E2出現(xiàn)時，巴西副球孢子菌菌絲相細胞會改變高溫誘發(fā)的正常細胞應答反應，改變隨后的形態(tài)轉(zhuǎn)化和致病機制[2]。

1.4 其他物質(zhì)調(diào)控

除了以上的信號轉(zhuǎn)導途徑以外，還有多種物質(zhì)參與調(diào)控真菌的生長、形態(tài)轉(zhuǎn)化，糖鞘脂類物(glycosphingolipids，GSLs)是細胞膜的重要成分，分為中性和酸性GSLs，中性GSLs是合成真菌葡萄糖基神經(jīng)酰胺(GlcCer)和半乳糖基神經(jīng)酰胺(GalCer)的原料之一 ，破壞GlcCer合成能降低真菌的生長分化和毒力，干擾GlcCer合成的小分子物質(zhì)有望成為抗真菌的新藥；菌絲相真菌一個重要特點是極性生長，GSLs在真菌的極性生長中起著重要作用[3]。黏附素14-3-3是宿主與真菌抗原相互作用的基本物質(zhì)，也參與了真菌的形態(tài)學轉(zhuǎn)化，具體機制不清[2]。在馬爾尼菲籃狀菌中，rrtA基因編碼了組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)，這個酶與真菌的生長特別是菌絲相有關，參與DNA的修復，此基因的表達對真菌在應激反應時生命力的維持很重要。研究表明rrtA突變的真菌毒力下降，同時也干擾了真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換[10]。多胺的合成與巴西副球孢子菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化有關，多胺是真核系統(tǒng)中細胞生長和分化所需的微分子，來源于鳥氨酸脫羧酶(ODC)使鳥氨酸脫羧的反應，在巴西副球孢子菌形態(tài)轉(zhuǎn)換期間ODC的活性大大提高，促進多胺的合成，從而促使巴西副球孢子菌發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)換。ODC抑制劑1,4-二氨基-2-丁酮(DAB)能抑制其形態(tài)轉(zhuǎn)換[7]。巴西副球孢子菌形態(tài)轉(zhuǎn)換后，其細胞壁成分發(fā)生了變化，α-glucan是莢膜組織胞漿菌酵母相毒力相關的基本物質(zhì)，它掩蓋了真菌細胞壁的β-glucan層，阻礙了宿主受體PPR(dectin-1)對真菌的識別，從而逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)[2,10]。粗球孢子菌在轉(zhuǎn)化時，基因研究顯示一些與細胞周期、細胞壁和應激反應相關中的蛋白激酶基因下調(diào)，這些基因的下調(diào)與粗球孢子菌小球形成之間的關系尚不清楚[6]。CPS1基因?qū)Υ智蜴咦泳亩玖σ埠苤匾攧h除此基因后，粗球孢子菌球體生長減慢，變?yōu)闊o毒體[6]。在雙相真菌中，4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(4-HPPD)基因表達均上調(diào)，該酶基因是酪氨酸分解代謝的基因復合體的一部分，4-HPPD酶降解有毒的羥基苯酮酸，破壞4-HPPD基因后，粗球孢子菌在巨噬細胞內(nèi)不能生長和分化[6]。

2 免疫調(diào)控機制

雙相真菌菌絲通過吸入途徑進入終末細支氣管和肺泡內(nèi)，在此場所轉(zhuǎn)換為酵母相，激活宿主的免疫反應，酵母相細胞被肺泡巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)吞噬，酵母相細胞能適應巨噬細胞內(nèi)惡劣的環(huán)境而繁殖，在感染急性期，酵母相細胞破壞巨噬細胞進入周圍環(huán)境，播散至淋巴結(jié)和宿主其他器官，造成彌漫性的感染[11]。感染真菌后，機體的免疫防御特別是細胞免疫被啟動，但由于真菌藏匿在巨噬細胞內(nèi)，細胞免疫不能直接發(fā)揮細胞毒性作用將其殺滅，而巨噬細胞殺傷力不足以將其消滅，從而發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應，真菌酵母相細胞被巨噬細胞包裹形成肉芽腫。肉芽腫的形成限制了真菌的復制和繁殖，IFN-γ、TNF-α能促進它的形成。在HIV患者和免疫被抑制的個體，由于真菌不能局限于肉芽腫內(nèi)而發(fā)生播散，病情更加嚴重，更容易發(fā)生彌漫性的全身反應[11-12]。感染雙相型真菌的臨床表現(xiàn)嚴重程度取決于宿主的免疫力和真菌毒力的相互作用，當宿主免疫力強時，雙相型真菌潛伏在體內(nèi)，僅出現(xiàn)輕中度癥狀；當宿主免疫力弱時如免疫缺陷，真菌活躍，容易播散，侵襲呼吸道，甚至播散至全身導致多器官功能受損[4,9-10,13]。

2.1 黏附和入侵

雙相型真菌進入呼吸系統(tǒng)后，表面的黏附素分子表達上調(diào)，有利于真菌定植在宿主細胞表面和播散至其他器官。在皮炎芽生菌的雙相轉(zhuǎn)化階段，BAD1(芽生菌黏附素-1)基因是最常見的上調(diào)基因，促進組織黏附和逃避宿主免疫。在小鼠實驗中觀察到，真菌表面結(jié)合的BAD1通過與硫酸肝素和補體受體CR3結(jié)合而促進皮炎芽生菌酵母相細胞黏附到宿主細胞。除了促進黏附外，BAD1還能抑制細胞因子(TNF-α、 IL-17 、 INF-γ 等)產(chǎn)生和CD4+T淋巴細胞的激活而逃避宿主免疫系統(tǒng)損傷[7]。巴西副球孢子菌入侵宿主細胞時，表達了gp43、黏附素14-3-3和烯醇化酶等主要的黏附素，黏附在上皮細胞和內(nèi)皮細胞等非吞噬細胞表面，誘導這些細胞攝取真菌和凋亡。gp43是巴西副球孢子菌表面的糖蛋白，是第一個被報道的黏附素，能誘導肺上皮細胞角蛋白降解，導致細胞凋亡，此外還能抑制宿主吞噬細胞的吞噬作用，促使真菌誘導宿主細胞骨架發(fā)生改變；黏附素14-3-3能增強巴西副球孢子菌的毒力，研究表明黏附素14-3-3缺乏的真菌毒力顯著下降[2,10]。用蛋白質(zhì)組分析已經(jīng)確定了3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作是馬爾尼菲籃狀菌分生孢子表達的黏附因子[14]。

2.2 適應和抵御巨噬細胞的惡劣環(huán)境

進入宿主體內(nèi)的雙相型真菌的清除以細胞免疫為主，先天性固有免疫為輔。先天免疫系統(tǒng)細胞通過模式識別受體(PRR)如Toll樣受體(TLR)、 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD-)樣蛋白和C型凝集素受體(CLR)識別真菌抗原，遞呈給T淋巴細胞，使T淋巴細胞增殖活化為效應T細胞，產(chǎn)生Th1細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)，導致巨噬細胞活化吞噬真菌，產(chǎn)生活性氧(ROS)和活性氮物質(zhì)(RNS)殺死真菌或抑制生長。

巨噬細胞內(nèi)是一個葡萄糖和氨基酸耗盡且缺氧的場所，且會產(chǎn)生許多ROS和RNS殺滅或抑制真菌的生長，然而許多雙相型真菌已進化出在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中生存的防御機制。研究數(shù)據(jù)表明，在碳缺乏的惡劣環(huán)境下，巴西副球孢子菌酵母細胞利用β-氧化，三羧酸(TCA)和乙醛酸循環(huán)代謝提供的前提物質(zhì)乙酰-CoA、丙酮酸、草酰乙酸和琥珀酸進入糖異生途徑和合成乙醇，以此適應巨噬細胞內(nèi)惡劣的環(huán)境[4]。真菌在巨噬細胞內(nèi)化后，轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在碳饑餓壓力下(碳饑餓6 h)，真菌運輸生存所必需的營養(yǎng)物質(zhì)(例如銅-己糖和單糖)的轉(zhuǎn)運蛋白增加[2]。鐵是真菌必需的微量元素，是生命活動所需的輔酶，巨噬細胞通過限制真菌攝取鐵而抑制其增殖，然而在此環(huán)境下，真菌會改變能量代謝模式，變?yōu)榉氰F依賴的途徑，降低磷酸戊糖途徑中需鐵酶的表達，抑制氧化磷酸化途徑，提高糖酵解途徑來代償有氧途徑的下降[14]。鋅的攝取也很重要，在宿主體內(nèi)，皮炎芽生菌的酵母相細胞會上調(diào)與外源性鋅攝取有關的重要基因，包括PRA1、ZRT1、ZRT2，分別編碼編碼鋅基團、高親和力鋅轉(zhuǎn)運蛋白和低親和力鋅轉(zhuǎn)運蛋白[7]。 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)破壞皮炎芽生菌的PRA1和ZRT1基因后，其適應宿主惡劣環(huán)境的能力下降[15]。鋅的攝取已被證明對另一種人類致病真菌白念珠菌的發(fā)病機制很重要，在白念珠菌中，PRA1結(jié)合被宿主隔離的細胞外鋅，隨后與高親和力鋅轉(zhuǎn)運蛋白ZRT1相互作用，促進鋅被攝入到真菌細胞內(nèi)。

在宿主吞噬細胞內(nèi)或在血管內(nèi)，氧供是有限的，真菌必須要適應低氧和ROS環(huán)境。在巨噬細胞內(nèi)H2O2強氧化劑下，雙相型真菌能產(chǎn)生抗氧化劑如過氧化氫酶(CAT)、催化酶、細胞色素c過氧化物酶、硫氧還蛋白和超氧化物歧化酶等，并誘導新陳代謝轉(zhuǎn)移至磷酸戊糖途徑，細胞質(zhì)中NADPH產(chǎn)量增加，為谷胱甘肽過氧化物酶系統(tǒng)提供電子來源，以恢復細胞氧化還原電位，隨后酵母細胞在厭氧條件下將其用于生產(chǎn)ATP[2,16]。

聚酮化合物是一類由微生物合成的次級代謝產(chǎn)物，包括抗生素、真菌毒素和色素等，雖然這些次級代謝產(chǎn)物不是必需的，但具有生物活性，可以給微生物提供生存優(yōu)勢。黑色素屬于聚酮化合物，在經(jīng)歷宿主酶的消化和嚴酷的酸性環(huán)境后，巴西副球孢子菌和馬爾尼菲籃狀菌等會產(chǎn)生大量黑色素，有助于酵母細胞的恢復，其次還能抑制巨噬細胞的作用，中和清除宿主效應細胞產(chǎn)生的氧自由基，從而增加真菌的毒力[2,7]。Mp1p是馬爾尼菲籃狀菌表面一種具有免疫原性的分泌甘露糖蛋白，在小鼠實驗中證明，Mp1p在馬爾尼菲籃狀菌毒力中起著重要作用，它通過提高真菌在巨噬細胞中的存活而介導真菌的毒力，具體機制需進一步研究[14,17]。

除了巨噬細胞外，宿主的樹突狀細胞和中性粒細胞也參與對真菌的殺傷和清除。特別是在皮炎芽生菌感染個體中，中性粒細胞是引起膿性肉芽腫性炎癥反應的主要細胞，需通過趨化因子募集到感染部位而發(fā)揮生理功能。最近研究報道，皮炎芽生菌酵母相細胞分泌的二肽基肽酶IVA(DPPIVA)能使趨化因子失活而調(diào)節(jié)宿主中性粒細胞的功能。DPPIVA是一種絲氨酸蛋白酶，能切割C趨化因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的N末端，從而使趨化因子失活，阻礙先天性免疫細胞的募集[7,18]。

2.3 真菌的播散

在感染的最后階段就是真菌的播散，最近研究表明，真菌通過形成表面具有黏附素和水解酶的生物膜，黏附、侵襲和破壞宿主細胞和組織，這或許是真菌在宿主持續(xù)存在的重要原因。caspase-2、caspase-3、caspase-8能調(diào)節(jié)巨噬細胞和肺上皮細胞程序化死亡，便于真菌在體內(nèi)的播散，此過程深受黏附素14-3-3和gp43的影響。

2.4 真菌細胞外囊泡的作用

真菌的細胞外囊泡(EV)類似哺乳動物的外泌體，是真菌分泌物質(zhì)的途徑，目前，EV已被認為是毒性因子跨細胞壁轉(zhuǎn)運的重要結(jié)構(gòu)，它能跨越真菌細胞壁，實現(xiàn)分子轉(zhuǎn)運，這對真菌的營養(yǎng)獲取、細胞防御有重要意義，甚至還能調(diào)節(jié)宿主的免疫防御。EV運載具有強免疫原性的α-Gal表位到細胞外，在莢膜組織胞漿菌和申克孢子絲菌中，這些細胞外的囊泡就像“毒力袋”一樣。

從功能上講，巨噬細胞分為兩類，促進炎癥的巨噬細胞被稱為經(jīng)典活化巨噬細胞(M1)，而抑制炎癥和促進組織修復的巨噬細胞被稱為交替活化巨噬細胞(M2)[19-21]。EV能促進巨噬細胞向“經(jīng)典” M1表型分化，甚至能刺激巨噬細胞由M2表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型，被EV刺激過的巨噬細胞比IFN-γ激活的巨噬細胞具有更強的殺真菌活性[7]。另外，EV還參與從信號轉(zhuǎn)導到細胞各種應激導致細胞分裂的各種復雜的生理功能。

2.5 其他影響真菌毒力的因素

基因?qū)W研究顯示，粗球孢子菌中的9URA5基因失活能破壞嘧啶生物合成途徑，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型酵母在巨噬細胞中失去毒力[10]。真菌氨代謝有關的酶對真菌毒力也很重要，在小鼠實驗中證明，被感染組織是堿性的，粗球孢子菌合成脲酶和脲基乙醇酸水解酶，可將脲基乙醇酸酯降解為氨和乙醛酸(UGH)[6]。 脲酶和UGH基因敲除后的突變體產(chǎn)生的氨很少，即使在遺傳易感的BALB/c小鼠中毒力也很弱，這表明真菌堿化環(huán)境的能力對其致病性很重要。

小結(jié)和展望

雙相型真菌在自然環(huán)境中為菌絲相，吸入宿主后，在溫度等多種因素作用下，變?yōu)榻湍赶?，此過程稱為雙相型真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化。雙相型真菌致病機制是復雜多樣的，其中雙相型真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化是其致病的重要條件，吸入宿主后酵母相細胞與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，通過各種復雜調(diào)節(jié)機制展現(xiàn)其致病的過程，涉及到致病過程的多種分子物質(zhì)有望成為抗雙相型真菌的藥物靶向目標，為其治療提供了新思路。其次，雙相型真菌細胞壁和細胞質(zhì)中的具有強免疫原性的成分可以用于制備雙相型真菌的疫苗，從而有效預防此病。