牛曉雨 李大彪 麗 麗 解湧芳 朱壽謙 王敬堯

(內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，呼和浩特010018)

原蟲在反芻動物瘤胃發(fā)酵過程中具有十分重要的作用，每毫升瘤胃內容物中有105～107個原蟲[1]。瘤胃原蟲有吞噬細菌、降低細菌對飼糧中淀粉消化率的作用，同時也可以將飼糧中纖維物質和淀粉等轉化成揮發(fā)性脂肪酸，減緩碳水化合物在瘤胃內的發(fā)酵速度，穩(wěn)定瘤胃pH。除此之外，原蟲也有增加甲烷產量的負面作用[2]。植物單寧也叫鞣酸、鞣質或植物多酚，在植物體內含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素[3]。根據(jù)結構及性質不同，將單寧分為縮合單寧(CT)和可水解單寧(HT)。CT又名原花青素，分子質量大，可以被氧化，但不易被水解[4]。HT是兒茶酚和沒食子兒茶酚單體的多聚物[5]，以多糖為中心結構，其具有的羥基能與酸發(fā)生酯化反應，在熱刺激或者弱酸條件下易被分解，是一種能夠改善畜禽健康的優(yōu)質天然植物提取物[6]，也是一種天然的反芻動物瘤胃發(fā)酵調控劑。Cieslak等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼糧中添加越橘單寧，瘤胃原蟲總數(shù)顯著降低。體外培養(yǎng)試驗中，向培養(yǎng)液中混合添加HT和CT或者單獨添加HT時，發(fā)現(xiàn)纖毛蟲數(shù)量均有所下降，分別下降36.2%和12.3%[8]。李大彪等[9]發(fā)現(xiàn)，在綿羊和絨山羊飼糧中添加6%的CT，絨山羊的瘤胃原蟲數(shù)量顯著低于對照組，綿羊瘤胃原蟲數(shù)量與對照組相比有下降趨勢。但是，也有研究表明，在奶牛飼糧中添加的單寧含量達105 g時，對原蟲數(shù)量無顯著影響[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中含2%和4%的單寧可顯著降低綿羊單位干物質采食量的甲烷排放量[11]，這是否與單寧影響了瘤胃原蟲種群數(shù)量和區(qū)系有關？為此，本試驗應用顯微鏡計數(shù)方法結合高通量測序技術，檢測了單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量和種群多樣性的影響，旨在為富含單寧粗飼料資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧

本試驗選取體況良好、體重45 kg左右的杜蒙雜交羯羊15只，隨機分為3組，分別為Ⅰ組(對照組，不含單寧)、Ⅱ組(含2%單寧)和Ⅲ組(含4%單寧)，每組5只羊。飼糧中單寧來自結莢期的檸條，檸條購自內蒙古百瑞草業(yè)有限公司。飼糧的精粗比為4∶6，3組飼糧根據(jù)等能等氮的原則加工成全混合日糧顆粒。檸條的營養(yǎng)成分和縮合單寧含量見表1[11]。試驗動物于每天09：00和17：00分別飼喂1次，自由飲水。試驗動物在預試期統(tǒng)一驅蟲處理。試驗預試期14 d，正試期20 d，采用單因素完全隨機試驗設計。飼糧營養(yǎng)水平參考《動物營養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)標準》[12]，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 檸條中的營養(yǎng)成分和縮合單寧含量(風干基礎)

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.2 樣品采集

在正試期的第18天和第19天晨飼前和晨飼后6 h通過口腔采樣器采集瘤胃液，迅速經4層紗布過濾后，將一部分瘤胃液用2倍體積的甲基綠福爾馬林(MFS)染色液進行固定，用于計數(shù)原蟲。另外，將晨飼后6 h瘤胃液分裝于凍存管中液氮速凍后-80 ℃保存，用于高通量測序分析。

1.3 瘤胃液中原蟲計數(shù)

1.3.1 固定原蟲用染色液的配制方法

MFS染色液：100 mL 35%福爾馬林、8.0 g氯化鈉、0.6 g甲基綠加入到900 mL蒸餾水中混合均勻。

瘤胃液混勻，過濾，將10 mL濾液和20 mL固定用MFS染色液混勻，輕搖，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原蟲計數(shù)方法

計數(shù)原蟲數(shù)量選用血球計數(shù)板，深0.5 mm，25個中格，16個小格，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中方格和中央1個中方格的菌數(shù)，共為80個小格，每個樣品計數(shù)3次，取平均值。

計數(shù)前，輕輕搖均混合溶液，用移液槍吸取0.5 mL混合溶液，從蓋上蓋玻片的計數(shù)板一側緩慢添加使之不產生氣泡，“H”型玻璃槽被填滿溶液后靜置10～15 min。

1.3.3 計算公式

X=A/5×25×B×0.5×2×1 000。

式中：X為每毫升瘤胃液樣品中所含原蟲數(shù)；A為5個中方格內的原蟲數(shù)；B為稀釋倍數(shù)。因每個計數(shù)室體積為0.5 mm3，將其換算成1 cm3(1 mL)時需乘以2×1 000。

1.4 瘤胃液中微生物總DNA提取、擴增和測序

表3 PCR反應體系

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)經Excel 2013整理，采用SAS 9.2軟件包中的mixed程序進行方差分析，多重比較采用Duncan氏法，結果用平均值和標準誤表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 綿羊瘤胃原蟲測序深度

本試驗各組測序覆蓋度均達到了0.99，表示覆蓋度足夠，滿足后續(xù)分析要求。本試驗的15個樣品中共得到941 190條高質量序列，每個樣品為62 746條序列。以97%的一致性聚類為40個OTU。綿羊瘤胃原蟲Shannon稀釋曲線(圖1)最終趨于平緩，說明本試驗的測序深度已經覆蓋了瘤胃液中絕大部分的原蟲樣品，可進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 原蟲Shannon稀釋曲線

2.2 不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲種群alpha多樣性的影響

由表4可知，Ⅱ組和Ⅲ組綿羊瘤胃原蟲Chao 1指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Ace指數(shù)隨著飼糧單寧水平增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但3組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲alpha多樣性的影響

2.3 不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量和屬水平物種組成的影響

由表5可知，在晨飼前和晨飼后6 h，Ⅲ組原蟲數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，Ⅱ組有低于對照組的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

由表5可知，綿羊瘤胃液中主要原蟲屬為頭毛蟲科下的未分類的屬、內毛蟲屬、前毛蟲屬、厚毛蟲屬、兩腰纖毛蟲屬和均毛蟲屬。3個組的優(yōu)勢原蟲屬均為頭毛蟲科下未分類的屬。Ⅲ組的均毛蟲屬相對豐度顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，對照組和Ⅱ組間無顯著差異(P>0.05)。Ⅱ組和Ⅲ組內毛蟲屬相對豐度有低于對照組的趨勢(P=0.06)；Ⅱ組和Ⅲ組前毛蟲屬相對豐度有低于對照組的趨勢(P=0.07)；頭毛蟲科下的未分類的屬、厚毛蟲屬和兩腰纖毛蟲屬相對豐度各組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼糧不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量和屬水平物種組成的影響

2.4 綿羊瘤胃原蟲種群韋恩(Venn)圖分析

由圖2可知，3組綿羊瘤胃共享的核心原蟲OTU數(shù)為29個，占各組OTU數(shù)的比例均為82.9%。對照組和Ⅱ組共享的OTU數(shù)為31個，各自特有的OTU數(shù)分別為1和2個。對照組和Ⅲ組共享的OTU數(shù)為32個，各自特有的OTU數(shù)均為1個。Ⅱ組和Ⅲ組共享的OTU數(shù)為31個，各自特有的OTU數(shù)分別為2和1個。

Ⅰ：對照組；Ⅱ：Ⅱ組；Ⅲ：Ⅲ組。

2.5 綿羊瘤胃原蟲OTU水平主坐標分析(PCoA)

由圖3可知，Ⅱ組和Ⅲ組瘤胃原蟲組成明顯單獨聚集成簇(R=0.4760;P=0.0190)(圖3-C)；對照組和Ⅱ組瘤胃原蟲的相似性也較小(R=0.276 0;P=0.096 0)(圖3-A)，而對照組和Ⅲ組之間瘤胃原蟲組成相似性較高(R=-0.064 0;P=0.616 0)(圖3-B)。

3 討 論

3.1 單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量的影響

原蟲是反芻動物瘤胃微生物的重要組成部分，而且原蟲在眾多的瘤胃微生物中所占體積最大，占總微生物體積的30%～80%[13]。本試驗中研究得出，飼糧中含4%檸條來源的單寧顯著降低了晨飼前和晨飼后6 h瘤胃原蟲數(shù)量，飼糧中含2%單寧也有降低瘤胃原蟲數(shù)量的趨勢。Jolazadeh等[14]在荷斯坦公牛飼糧中添加從開心果提取的縮合單寧，結果發(fā)現(xiàn)其降低了瘤胃原蟲總量。丁學智[15]研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃體外發(fā)酵試驗中，隨著單寧濃度的增加原蟲數(shù)量顯著減低。楊凱[16]發(fā)現(xiàn)肉牛飼糧中添加6.5、13.0和26.0 g/kg單寧時，瘤胃原蟲數(shù)量均顯著降低。上述研究結果均與本試驗結果一致，分析其原因可能是單寧降低了瘤胃細菌的數(shù)量，間接影響了原蟲氮的供給，進而抑制了原蟲的生長[5，17]。但是，也有試驗結果表明，單寧對瘤胃原蟲的相對豐度無顯著影響[18]。不同的研究得出的單寧對瘤胃原蟲數(shù)量影響的結果不一致，這可能與不同的試驗單寧來源、單寧添加量、采樣時間、動物品種不同有關。

圖3 綿羊瘤胃原蟲種群主坐標分析圖

3.2 單寧對綿羊瘤胃原蟲多樣性的影響

瘤胃原蟲在反芻動物瘤胃發(fā)酵過程中扮演十分重要的作用，原蟲的豐度與多樣性受飼糧、動物品種等多種因素的影響。近年來，植物提取物影響反芻動物瘤胃原蟲多樣性與豐度的研究受到廣泛關注。王彩蝶等[19]研究發(fā)現(xiàn)，醋酸棉酚對綿羊瘤胃液原蟲多樣性無顯著影響。有研究報道，存在于印度田菁葉中的單寧對原蟲多樣性沒有顯著影響[20]。本試驗結果顯示，綿羊飼糧中含2%和4%檸條來源的單寧對綿羊瘤胃原蟲Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)無顯著影響，但會降低瘤胃原蟲相對豐度。從Venn圖的試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，對照組與2個試驗組的共享原蟲占總原蟲比例達到82.9%，這表明單寧對瘤胃液原蟲多樣性沒有產生顯著影響。從主坐標分析的試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，對照組和2個試驗組原蟲組成均具有一定的相似性，這也表明單寧對瘤胃液原蟲多樣性沒有產生顯著影響。本研究得出，在屬水平上，動物瘤胃內原蟲各屬的數(shù)量隨著飼糧中單寧含量的變化而有所變化,2個試驗組的內毛蟲屬和前毛蟲屬相對豐度都顯示有低于對照組的趨勢，與多樣性指數(shù)中的Chao1指數(shù)得出的結論一致，這表明在屬水平上，單寧可以降低部分原蟲屬的相對豐度，內毛蟲屬在瘤胃蛋白質降解和微生物氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，這說明單寧可能會通過降低瘤胃內毛蟲屬的數(shù)量對瘤胃蛋白質的利用起到負面效果。除此，有研究發(fā)現(xiàn)，一些植物提取物對反芻動物瘤胃原蟲多樣性會造成影響，趙士萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛每天飼喂30或40 g茶皂素均可顯著降低瘤胃原蟲的多樣性，其原因可能是單寧有抑制瘤胃細菌增殖的作用[22]，瘤胃原蟲可以吞噬細菌，細菌數(shù)量和多樣性的改變進而導致原蟲多樣性的降低，這還有待通過體外細菌和原蟲共培養(yǎng)試驗來進一步驗證。

4 結 論

飼糧含2%和4%來源于檸條的單寧顯著降低綿羊瘤胃原蟲數(shù)量，但對原蟲種群多樣性無顯著影響；飼糧含4%來源于檸條的單寧顯著增加了均毛蟲屬的相對豐度，飼糧含2%和4%來源于檸條的單寧有降低前毛蟲屬和內毛蟲屬相對豐度的趨勢。