徐子萱 李冬芳 于春微 李松建 高 民 胡紅蓮 劉大程*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)研究所，呼和浩特010031)

反芻動物獨特的瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)能夠分解飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)并合成自身所需的營養(yǎng)，如菌體蛋白(BCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等。微生物發(fā)酵飼料是以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，通過微生物的代謝作用，降解部分多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，生成有機酸和可溶性小肽等小分子物質(zhì)，其營養(yǎng)豐富、適口性好、活菌數(shù)量高[1]。大量研究表明，微生物發(fā)酵飼料可有效減少棉籽粕等原料的抗營養(yǎng)因子含量，還能產(chǎn)生如活性肽、多糖、有機酸等活性物質(zhì)[2]，這類物質(zhì)能增強機體的免疫功能[3-4]，提高抗氧化功能[5-6]，改善動物的腸道微生態(tài)平衡[7]，同時可提高動物采食量和飼料利用率[8]。微生物發(fā)酵飼料的菌種與制備工藝不同，作用效果有很大差異，本課題組前期研究的一種微生物類發(fā)酵制劑，由高活性酵母菌和枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵而成，其主效成分包括甘露聚糖、葡聚糖、氨基酸、多肽和有機酸5種營養(yǎng)活性物質(zhì)[9]，能為瘤胃微生物生長提供特殊的營養(yǎng)底物，刺激瘤胃微生物的生長，調(diào)控瘤胃功能。實際生產(chǎn)中盲目飼喂微生物發(fā)酵飼料的現(xiàn)象也較為常見，缺乏配套的使用技術(shù)，效果不佳還會增加養(yǎng)殖成本[10]。目前，不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對體外瘤胃發(fā)酵的影響鮮見報道。因此，本研究通過體外發(fā)酵試驗評價不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對奶牛的瘤胃發(fā)酵功能及飼糧營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響，為今后微生物發(fā)酵飼料在奶牛養(yǎng)殖中的應用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 微生物發(fā)酵飼料

以麩皮、米糠、棉籽粕、玉米皮等9種農(nóng)副產(chǎn)品為主要發(fā)酵原料，將課題組菌種庫的釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，SC)2株，編號分別為XR4和BC；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1株，編號為A15，以XR4∶BC∶A15按菌液體積2∶2∶1混合，8%接種量接入250 kg的固態(tài)發(fā)酵飼料中，加水使最終含水量為45%，于車間中30 ℃好氧堆積發(fā)酵48 h。根據(jù)本課題組前期成果[11-12]，其主效指標為：酵母菌數(shù)量≥5×108CFU/g，β-葡聚糖含量≥5.484 g/kg，甘露聚糖含量≥3.438 mg/kg，多肽含量≥1.36 mg/g，有機酸含量≥1.48 mg/g。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選擇5頭體態(tài)狀況較好、體重相近，帶有永久瘤胃瘺管的奶牛，單欄飼養(yǎng)，自由飲水。飼糧營養(yǎng)水平參照NRC(2001)奶牛飼養(yǎng)標準，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗設計

體外發(fā)酵試驗中，將玉米秸青貯、羊草、苜蓿干草3種粗料與玉米、豆粕2種精料配成精粗比為5∶5的全混合日糧作為培養(yǎng)底物，對照組全混合日糧中添加奶牛濃縮料(粗蛋白質(zhì)34.60%、鈣2.05%、磷1.40%、食鹽1.20%、賴氨酸1.44%、蛋氨酸0.59%)，4個試驗組全混合日糧中分別添加3%、5%、7%和9%微生物發(fā)酵飼料。全混合日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.4 試驗方法

體外發(fā)酵裝置：恒溫水浴搖床。培養(yǎng)管為100 mL的玻璃注射器，針頭的上端連接三通閥橡膠管，試驗過程中三通閥關(guān)閉以確保嚴格的厭氧環(huán)境。涂抹凡士林在注射器活塞的四周，防止漏氣，還能使活塞向上移動的阻力減小。

瘤胃液采集和人工瘤胃培養(yǎng)液配制：在晨飼前采集奶牛瘤胃液，裝入保溫瓶迅速返回實驗室，緩慢通入二氧化碳(CO2)條件下，瘤胃液4層紗布過濾待用。人工瘤胃培養(yǎng)液參照Menke等[13]的方法進行配制。

體外人工瘤胃接種：0.2 g樣品放入培養(yǎng)管，加人工瘤胃培養(yǎng)液(瘤胃液∶培養(yǎng)液=1∶2)30 mL，推出氣泡。樣品做5個平行，無培養(yǎng)底物的瘤胃液作5個空白對照。記錄初始的刻度，放置于搖床中39 ℃條件下培養(yǎng)24 h。再稱取0.2 g發(fā)酵底物放入150 mL廣口培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶中加入120 mL培養(yǎng)液，持續(xù)通入CO2；蓋上帶有氣閥的橡皮塞；放入39 ℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)，用于測定干物質(zhì)體外消化率(IVDMD)。

分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h時取樣，對培養(yǎng)液的產(chǎn)氣量、pH及氨態(tài)氮(NH3-N)、VFA、BCP濃度進行測定。

1.5 測定指標及方法

瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定：產(chǎn)氣量在發(fā)酵管上直接讀取刻數(shù)進行記錄；pH采用pHs-3c型高精度酸度計(梅特勒-托利多公司)進行測定；VFA濃度按秦為琳[14]的方法通過Varian氣相色譜儀(GC-450，德國)進行測定；NH3-N濃度按馮宗慈等[15]的比色法，使用T6系列紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)進行測定；BCP濃度采用考馬斯亮藍比色法，使用T6系列紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)進行測定[16]。

表2 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

體外24 h培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用尼龍袋(尺寸為110 mm×80 mm，孔徑為400目)過濾，殘渣105 ℃烘干后，稱重并計算樣品IVDMD。對消化后樣品中的粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量進行測定，CP含量采用全自動凱氏定氮儀(K9860，濟南海能儀器有限公司)進行測定，NDF、ADF含量采用濾袋法(ANKOM A200i型半自動纖維分析儀，美國Ankom公司)進行測定[17]，并按公式計算粗蛋白質(zhì)體外消化率(IVCPD)、中性洗滌纖維體外消化率(IVNDFD)、酸性洗滌纖維體外消化率(IVADFD)：

營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率(%)=100×{[樣品重(%)×
樣品中該營養(yǎng)物質(zhì)含量(%)]-[殘渣重(%)×
殘渣中該營養(yǎng)物質(zhì)含量(%)]}/[樣
品重(%)×樣品中該營養(yǎng)物質(zhì)含量(%)]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

在Excel 2010中對數(shù)據(jù)進行處理，制作圖表；使用SAS 9.0軟件中的GLM過程對數(shù)據(jù)進行方差分析；用DPS 14.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中Topsis法對數(shù)據(jù)進行綜合評價。

2 結(jié) 果

2.1 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液產(chǎn)氣量的影響

由表3可知，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液產(chǎn)氣量逐漸升高。在培養(yǎng)3、6 h時，5%、7%和9%組的產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)；在培養(yǎng)9 h時，7%組的產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)，在培養(yǎng)12和24 h時，7%和9%組的產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的產(chǎn)氣量平均值最高，顯著高于對照組和3%組(P<0.05)。

通過組織的崗位定位分流后，在大學二年級開啟“見習生”計劃，即建立校企合作崗位培訓基地，利用周末、寒暑假的社會實踐機會，在固定企業(yè)進行見習生計劃，主要進行工作學習分享和社會實踐，即類似于現(xiàn)代學徒制，跟隨師傅教授職場要訣。

2.2 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液pH的影響

由表4可知，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液pH逐漸降低。在培養(yǎng)0、3、6、9 h時，各組的pH無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)12 h時，9%組的pH顯著高于3%組(P<0.05)，但與其他各組無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)24 h時，7%組的pH最低且顯著低于對照組(P<0.05)。3%組的pH平均值顯著低于對照組和9%組(P<0.05)。

2.3 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度的影響

由表5可知，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液TVFA含量逐漸增加。在培養(yǎng)3 h時，7%組的TVFA濃度顯著高于對照組和3%組(P<0.05)；在培養(yǎng)9 h時，5%、7%和9%組的TVFA濃度顯著高于對照組(P<0.05)；在培養(yǎng)24 h時，3%、5%、7%和9%組的TVFA濃度均顯著高于對照組(P<0.05)，且以7%組最高。7%組的TVFA濃度平均值最高，顯著高于對照組和3%組(P<0.05)。

表3 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液產(chǎn)氣量的影響

表4 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液pH的影響

表5 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液TVFA濃度的影響

2.4 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸的影響

由表6可知，在培養(yǎng)0、3、6、12 h時，各組乙酸濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)9 h時，7%組的乙酸濃度顯著高于對照組和3%組(P<0.05)；在培養(yǎng)24 h時，7%組的乙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的乙酸濃度平均值最高，顯著高于對照組和3%組(P<0.05)。

在培養(yǎng)0、3、6、9、12 h時，各組丙酸濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)24 h時，3%、5%、7%和9%組的丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的丙酸濃度平均值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。

在培養(yǎng)0 h時，對照組的丁酸濃度顯著高于3%、9%組(P<0.05)；在培養(yǎng)3 h時，7%組的丁酸濃度顯著高于3%、5%組(P<0.05)；在培養(yǎng)9 h時，7%組的丁酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，但與其他各組差異不顯著(P>0.05)。7%組的丁酸濃度平均值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。

表6 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸的影響

2.5 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

由表7可知，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液NH3-N濃度在培養(yǎng)0、3 h時下降，之后又逐漸上升，在培養(yǎng)12 h時達到最高值又大幅度下降。在培養(yǎng)0、3、6h時，各組NH3-N濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)9 h時，3%、5%、7%組的NH3-N濃度都顯著高于對照組(P<0.05)；在培養(yǎng)12、24 h時，各組NH3-N濃度無顯著差異(P>0.05)。7%組的NH3-N濃度平均值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。

表7 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

2.6 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液BCP濃度的影響

由表8可知，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液BCP濃度在培養(yǎng)0、3 h時呈增加的趨勢，在培養(yǎng)6 h時逐漸下降，在培養(yǎng)9、12 h時逐漸升高趨勢，在培養(yǎng)24 h時BCP濃度最高。在培養(yǎng)0、3、6 h時，各組BCP濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養(yǎng)9、12、24 h時，5%、7%組的BCP濃度顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的BCP濃度平均值最高，顯著高于對照組及3%、9%組(P<0.05)。

表8 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液BCP濃度的影響

2.7 Topsis綜合分析結(jié)果

由表9可知，使用DPS軟件Topsis法對多試驗和多指標綜合分析，微生物發(fā)酵飼料適宜添加水平為7%。

2.8 微生物發(fā)酵飼料對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響

按7%的微生物發(fā)酵飼料適宜添加水平，采用一級離體消化試驗來測定飼糧營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率。由表10可知，試驗組的IVDMD、IVCPD、IVNDFD、IVADFD均高于對照組，分別比對照組提高了0.80%、1.43%、3.76%和1.98%(P>0.05)。

表9 各瘤胃發(fā)酵參數(shù)Topsis綜合分析結(jié)果

表10 微生物發(fā)酵飼料對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響

3 討 論

3.1 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量可反映瘤胃微生物對發(fā)酵底物的利用能力，通過試驗中產(chǎn)氣量的測定，能估測出培養(yǎng)底物的消化水平、消化速率[18-21]。本試驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)3、6 h時，5%、7%和9%組的產(chǎn)氣量顯著高于對照組；在培養(yǎng)12、24 h時，7%和9%組的產(chǎn)氣量顯著高于對照組。本課題組使用高活性的3株菌株和特殊工藝的發(fā)酵飼料，其中含有大量活性物質(zhì)，如β-葡聚糖、甘露聚糖、有機酸、多肽等，微生物發(fā)酵飼料的添加水平增加，進入培養(yǎng)液中的有機酸、多肽等營養(yǎng)活性物質(zhì)含量也隨之增多，能有效提高瘤胃微生物的活性[22]，從而增加了培養(yǎng)液的產(chǎn)氣量。

3.2 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液VFA濃度的影響

瘤胃在發(fā)酵的過程中可以產(chǎn)生的大量VFA，供給動物機體70%左右的能量[23]。多項研究證實，瘤胃內(nèi)進行乙酸和丙酸發(fā)酵，乙酸參與了三羧酸循環(huán)，進行氧化供能或用于脂肪酸合成，丙酸是糖異生的前體物質(zhì)，也是反芻動物所需葡萄糖的主要來源[24]。本試驗中，7%組的乙酸濃度高于對照組，各組TVFA濃度均逐漸升高，說明微生物發(fā)酵飼料能夠加強瘤胃的發(fā)酵功能，促進了底物的發(fā)酵，產(chǎn)生更多的VFA。在發(fā)酵9、24 h時，5%、7%、9%組的TVFA濃度顯著高于對照組。培養(yǎng)24 h時與培養(yǎng)0 h相比，各組乙酸/丙酸均降低，說明添加微生物發(fā)酵飼料能改變瘤胃的發(fā)酵類型，使其趨于丙酸發(fā)酵型，從而提高了瘤胃發(fā)酵的能量利用率。

3.3 不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對培養(yǎng)液NH3-N和BCP濃度的影響

微生物發(fā)酵飼料中的氮被瘤胃內(nèi)的微生物分解，最終轉(zhuǎn)化成為NH3-N和BCP。BCP合成效率為有機物用于合成微生物的效率[25]，所以瘤胃內(nèi)合適的NH3-N濃度更有利于BCP合成效率的最大化，又可以防止氮浪費。本試驗中，在培養(yǎng)6、9、12 h時，NH3-N和BCP濃度在逐漸增加，表明此時間段微生物發(fā)酵飼料能夠使飼料利用率增加，還可以使飼糧中的氮被瘤胃內(nèi)的微生物逐漸分解，微生物發(fā)酵飼料也使瘤胃微生物利用NH3-N合成BCP的能力有所提高。3%、5%、7%和9%組培養(yǎng)液中NH3-N和BCP濃度平均值均高于對照組，表明添加微生物發(fā)酵飼料既能使飼糧中氮轉(zhuǎn)化為NH3-N的效率提高，又能為合成BCP提供充足底物，促進了瘤胃內(nèi)BCP的合成。

3.4 微生物發(fā)酵飼料對營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響

干物質(zhì)、CP、NDF、ADF等降解率的大小是飼糧中衡量質(zhì)量的重要指標，數(shù)值越高表明飼糧在瘤胃中的降解程度越高[26]。因此，飼糧在瘤胃內(nèi)的降解能力可以客觀的表明微生物發(fā)酵飼料的作用效果和作用方式。本試驗中，添加7%微生物發(fā)酵飼料后，試驗組的IVDMD、IVCPD、IVNDFD、IVADFD均高于對照組，這說明微生物發(fā)酵飼料能夠刺激瘤胃微生物更好地發(fā)酵底物，提高了飼糧中的氮轉(zhuǎn)化為NH3-N等物質(zhì)的效率，合成了大量的BCP，與植物蛋白質(zhì)相比，BCP更容易被機體消化利用。

4 結(jié) 論

飼糧添加7%微生物發(fā)酵飼料可提高瘤胃發(fā)酵功能，提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率。