高玉廣 黃德慶 劉 泰 何乾超 劉永輝 莫窮澤 張?jiān)?鄧海霞 黃樹(shù)武

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

血腦屏障，主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，存在于腦組織和血液之間的屏障結(jié)構(gòu)。腦出血患者發(fā)生血腦屏障功能異常，內(nèi)環(huán)境紊亂，血液中的多種物質(zhì)進(jìn)入大腦，侵襲大腦組織，血腫周圍水腫在3小時(shí)到7天內(nèi)可持續(xù)增加，是腦出血后的重要病理改變[1-3]。因此，保護(hù)血腦屏障功能在腦出血治療中尤為重要。水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是疏水性蛋白，其中水通道蛋白4(AQP-4)是腦組織內(nèi)最重要的水通道蛋白，可維持腦內(nèi)水平衡。腦組織里的AQP-4大多數(shù)存在于血腦屏障的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面，其介導(dǎo)水進(jìn)出腦組織。血腦屏障破壞后，AQP-4表達(dá)異常，腦組織水代謝障礙，引起腦水腫[4-5]。研究[6]表明caveolin-1在腦出血后的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)，認(rèn)為caveolin-1在腦出血早期的腦損傷中發(fā)揮的是破壞性的角色，前期研究表明，健神利水方可以減少實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠caveolin-1表達(dá)[7-8]，可以減少腦出血大鼠神經(jīng)功能損害及腦含水量[9]，為了深入研究，本課題擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用膠原酶制作腦出血大鼠模型，模擬腦出血發(fā)展過(guò)程，觀察腦含水量和AQP-4表達(dá)水平，同時(shí)觀察健神利水方對(duì)腦出血大鼠AQP-4表達(dá)的影響，探討健神利水方治療腦出血分子機(jī)制；為腦出血的治療靶點(diǎn)提供證據(jù)，為中醫(yī)藥治療腦出血提供科學(xué)依據(jù)，具體匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康20月齡雌性SPF級(jí)大鼠160只，采購(gòu)來(lái)源于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK湘2019-001)。主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物：AQP-4抗體(Abcam，lot:ab128906),Western blotting 一抗稀釋液(biosharp，lot:70015829)，膠原蛋白酶(美國(guó)Sigma公司，lot#50190619)，內(nèi)參Anti(biosharp，lot:69070015)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(biosharp，lot:69070015，BL523A)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5X(biosharp，lot:69078121c)。健神利水方組方(丹參15 g、茯苓15 g、三七粉3 g、豬苓15 g、澤瀉10 g、白術(shù)10 g、桂枝6 g)[一方藥業(yè)有限公司]。實(shí)驗(yàn)器械：腦立體定位儀(成都儀器廠，ST-4ND)，5 μL、100 μL微量注射器，電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司，型號(hào)AR224CN)，組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)：KZ-III-F)，發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó) Alpha公司，型號(hào)：fluorChem E)

1.2 研究方法

1.2.1 腦出血大鼠模型 腦出血模型：大鼠術(shù)前4 h禁水、禁食，采用10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠放置于立體定位儀上，保證前囟和后囟在同一水平面，按照Gary等[10]的造模方法，于前囟后1 mm，右側(cè) 3 mm 處(即為右側(cè)尾狀核的位置)鉆一直徑約1 mm 的小孔，使用立體定位儀上的微量注射器進(jìn)針6 mm，在 10 min 內(nèi)注射膠原酶Ⅶ0.5 U，注射結(jié)束后停針 5 min，緩慢退針。

腦出血模型建立成功的評(píng)價(jià)：參照Matsushita等的研究[11]，對(duì)蘇醒后的大鼠進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)評(píng)定(4分——不能行走；3分——偏向?qū)?cè)傾倒；2分——向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；1分——不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；0分——無(wú)神經(jīng)損傷癥狀)，功能≥2 分的動(dòng)物表示造模成功，入選本實(shí)驗(yàn)，<2分的被剔除，并補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，達(dá)到各組所需的總數(shù)量。

假手術(shù)模型：以等量生理鹽水代替膠原酶，建立方法同膠原酶腦出血模型。

1.2.2 分組及造模 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：以人60歲為老年年齡，大鼠對(duì)應(yīng)鼠齡則為20個(gè)月，取160只取20～22月齡成年雄性SD大鼠，體重300±35 g，分別兩次采用SPSS18.0產(chǎn)生隨機(jī)序列。第一次隨機(jī)分出空白組(n=40，不予任何處理)、假手術(shù)組(n=40，注射等劑量生理鹽水)以及腦出血組(n=80，注射膠原酶制備腦出血模型)，在腦出血模型建立后再次分別進(jìn)行隨機(jī)分組：A：模型組，B：健神利水組，每組40只，以避免分組后再進(jìn)行造模，從而增加偏倚的風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.3 干預(yù)方法 造模后，空白組仍不予任何處理，假手術(shù)組予生理鹽水灌胃，模型組予生理鹽水灌胃，健神利水組給予健神利水方灌胃，臨用按《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》進(jìn)行換算，每次按380 mg/kg配成新鮮灌胃液，每日2次，持續(xù)7 d。

1.2.4 取材及處理 取相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)6 h、24 h、3 d、7 d的大鼠，麻醉后，開(kāi)胸，將鈍頭灌注針沿心尖插入主動(dòng)脈，用止血鉗固定針頭，剪開(kāi)心耳后，用生理鹽水快速灌注沖洗，持續(xù)到流出沒(méi)有血水的液體、大鼠上肢蒼白為止，隨后換4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注固定，固定時(shí)多聚甲醛溶液的速度先快后慢，直至大鼠僵硬如板狀，打開(kāi)顱腔迅速取腦，再根據(jù)免疫印跡法檢測(cè)要求而制作相應(yīng)標(biāo)本以供保存。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 腦組織含水量測(cè)定 麻醉大鼠，斷頭處死，迅速取出腦組織，立即稱濕重。將組織放入烘干箱100烘烤24 h再稱干重。按Elliot公式計(jì)算腦組織水含量：腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.2 免疫印跡(Western blot)檢測(cè)AQP-4的表達(dá)水平 腦組織置 0.5 mL 印跡緩沖液。超聲波勻漿，置于1.5 mL離心管中，電動(dòng)組織研磨棒進(jìn)行組織研磨，進(jìn)入蛋白裂解液，裂解5分鐘后于4 ℃，1000 rpm，離心10 min，去沉淀組織，留取上清液。測(cè)出各樣本的蛋白質(zhì)濃度。然后電泳，分離膠濃度8%，每泳道加入50 μg蛋白樣品。待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜后置于含5%脫脂奶封閉液室溫封閉1小時(shí)，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用WB洗滌液洗PVDF膜3次后，加入二抗，室溫孵育1 h。WB洗滌液洗PVDF膜3次后加入3 mL化學(xué)發(fā)光溶液(ECL)，隨即進(jìn)行光敏膠片顯像。用Imag J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白信號(hào)的灰度值，β-Actin作為內(nèi)參蛋白并對(duì)蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)一處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件MedCalc15.2.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組組間比較，采用t檢驗(yàn)，三組組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用非參數(shù)法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 各組腦組織含水量比較 空白組、假手術(shù)組未出現(xiàn)腦組織含水量變化，其余各組腦組織含水量從6 h時(shí)起均逐漸增多；模型組和健神利水組于3 d時(shí)腦組織含水量達(dá)到頂峰。健神利水組6 h、24 h、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均低于模型組(P<0.05)。詳細(xì)見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠腦組織含水量比較

圖1 各組大鼠腦組織含水量比較

2.2 各組AQP-4的表達(dá)水平比較 空白組、假手術(shù)組未出現(xiàn)AQP-4上調(diào)，其余各組AQP-4從6 h時(shí)均逐漸增高上調(diào)；模型組和健神利水組于3 d時(shí)AQP-4表達(dá)值達(dá)到頂峰。健神利水組6 h、24 h、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)AQP-4表達(dá)低于模型組(P<0.05)。詳細(xì)見(jiàn)表2、圖2、圖3。

表2 各組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)AQP-4表達(dá)

圖2 各組AQP-4不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)趨勢(shì)圖 圖3 各組AQP-4各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)圖

3 討論

腦出血是常見(jiàn)的腦血管疾病，常由高血壓所致，腦出血常伴隨出現(xiàn)原發(fā)性血腫，預(yù)后的康復(fù)治療往往與血腫大小及位置相關(guān)，同時(shí)腦出血并有腦水腫出現(xiàn)[12]。腦出血屬于中醫(yī)領(lǐng)域的“中風(fēng)”范疇，F(xiàn)ront Pharmacol以及Chin J Integr Med雜志刊登的兩項(xiàng)研究[13-14]表明，中藥通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑的方式治療腦出血，改善腦出血的癥狀。廣西名中醫(yī)劉泰教授等基于祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床研究結(jié)論，認(rèn)為腦出血主要機(jī)制關(guān)鍵為 “腦內(nèi)蓄血”及“瘀水內(nèi)阻”引起腦失其司知覺(jué)，出現(xiàn)偏癱、失語(yǔ)，健神利水方是由經(jīng)方五苓散加三七、丹參化裁而成，該方以君藥澤瀉之甘淡直達(dá)腎與膀胱之所，利水滲濕；臣藥茯苓、豬苓之淡滲助澤瀉增強(qiáng)利水滲濕之功；佐藥白術(shù)、茯苓健脾利水；加三七通脈行瘀，止血不留瘀，丹參養(yǎng)血活血，改善腦循環(huán)，具有溫陽(yáng)化氣、利水行瘀的作用，適用于腦出血伴腦水腫患者[7，9]。

AQP-4的表達(dá)在腦部水腫區(qū)的明顯增多，因此Previch LE等[4-5]認(rèn)為上調(diào)的AQP-4參與了腦水腫的形成。本項(xiàng)目研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)性大鼠在腦出血后腦含水量不斷升高(6 h至3 d時(shí)間段)，而此時(shí)間段的AQP-4的表達(dá)也隨著腦含水量的升高而升高，AQP-4表達(dá)值與腦含水量成正相關(guān)的關(guān)系，也與Previch LE的研究結(jié)果相一致，腦水腫發(fā)生與AQP-4密切相關(guān)。健神利水方可以減少腦出血大鼠神經(jīng)功能損害及腦含水量，在本實(shí)驗(yàn)研究中，健神利水組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織含水量低于模型組，與此同時(shí)，健神利水組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AQP-4表達(dá)低于模型組，可以得出結(jié)論：健神利水方可以減少腦出血大鼠腦組織含水量，可抑制AQP-4表達(dá)。

AQP-4表達(dá)值與腦含水量關(guān)系密切，原因在于腦組織的AQP-4主要分布于血腦屏障，當(dāng)腦出血發(fā)生后，血腦屏障受損，內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂，血腫AQP-4大量聚集，周圍產(chǎn)生炎性水液，水通道異常，引起腦水腫，是腦出血后的重要病理基礎(chǔ)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)研究表明：腦出血后，腦組織含水量增多，AQP-4表達(dá)增多；健神利水方可以減少腦出血大鼠腦組織含水量，可抑制AQP-4表達(dá)，一方面揭示了腦出血相關(guān)的分子機(jī)制，另一方面也為健神利水方治療腦出血提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。