呂國(guó)利 雷又鳴 李 楊 施云飛 段 晉 劉寅強(qiáng) 趙 煒 陳 楠

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1 老年胸外科，2 內(nèi)分泌二科，云南省昆明市 650031，電子郵箱：lvguoli2009@163.com；3 云南省腫瘤醫(yī)院胸外二科，昆明市 650118)

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率均極高的一種惡性腫瘤，而中國(guó)云南省宣威市肺癌的發(fā)病率及死亡率在國(guó)內(nèi)乃至全球均位居前列[1]，其中該地區(qū)男性和女性的肺癌死亡率分別為全國(guó)平均水平的4倍和8倍[2]，現(xiàn)已證實(shí)燃煤引起的室內(nèi)空氣污染為該地區(qū)肺癌發(fā)生的主要誘因[3]。既往研究表明，在宣威同一地區(qū)甚至同家族中，個(gè)體患肺癌風(fēng)險(xiǎn)存在巨大差別，推測(cè)可能與某種基因多態(tài)性有關(guān)[4]。近十年來，炎癥小體與腫瘤之間的關(guān)系是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，其中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)與肺癌有關(guān)[5]。目前，國(guó)內(nèi)暫無炎癥小體NLRP3基因多態(tài)性與宣威地區(qū)肺癌的相關(guān)研究。故本研究通過TaqMan探針法對(duì)NLRP3炎癥小體進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型，旨在探討炎癥小體NLRP3基因多態(tài)性與云南省宣威市居民肺癌遺傳易感性的相關(guān)性，以期為該地區(qū)肺癌的早期篩查、早期干預(yù)提供可靠的指導(dǎo)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2017年6月到2019年10月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的來自云南省宣威地區(qū)的80例肺癌患者(觀察組)為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均來自云南省宣威地區(qū)，并在該地區(qū)居住18年以上；(2)病理明確為肺癌；(3)采血前未接受任何放化療或抗腫瘤治療；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并如糖尿病、強(qiáng)直性脊柱炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等與基因突變有關(guān)的疾??；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病或傳染性疾病；(4)與已納入者有血緣關(guān)系。同時(shí)選取100例健康體檢者作為對(duì)照組，均來自云南省宣威地區(qū)并在該地區(qū)居住18年以上，且與已納入者無血緣關(guān)系。本研究遵循世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言。

1.2 資料收集 收集所有研究對(duì)象的性別、年齡、民族、職業(yè)、吸煙史、居住情況、生活習(xí)慣、燃煤使用或接觸史等基本資料。無煙煤接觸定義為5年內(nèi)未用煙煤作為家庭燃料或生產(chǎn)燃料，職業(yè)接觸定義為從事下井挖煤工作或煤礦工作[6]。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法：使用抗凝管采集所有研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血約3 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18表達(dá)水平。所有操作按試劑盒說明書(賽默飛世爾科技有限公司，IL-1β、IL-18檢測(cè)試劑的批號(hào)分別為BMS224-2、A35613)嚴(yán)格執(zhí)行。

1.3.2 DNA提?。菏褂每鼓懿杉醒芯繉?duì)象清晨空腹外周靜脈血約3 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清。使用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒(RTG2402)，嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟提取DNA；將樣本DNA稀釋至50 ng/μL，并存于-80℃冷庫(kù)備用。

1.3.3 TaqMan探針法檢測(cè)SNP分型：檢測(cè)儀器為ABI公司QuantStudioTM6型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀；通用型PCR預(yù)混液(批號(hào)：4401857)、孔板(批號(hào)：4483343)、探針(批號(hào)：4333760F)等均由ABI公司提供。rs4612666上游引物為5′-AGATGGTGGTGGTGATGGTT-3′，下游引物為5′-ACCTGCCACTGCCTCTACTC-3′。具體操作步驟：(1)每孔反應(yīng)液體系為10 μL通用型PCR預(yù)混液配1 μL探針，配置時(shí)實(shí)際試劑量比理論試劑量多10%～15%，混勻預(yù)混液。(2)把預(yù)混液分裝到光學(xué)96孔板中(避光環(huán)境下)，每孔11 μL，每孔加基因組DNA 11 μL。(3)加樣后使用光學(xué)封板膜封板，離心(4℃，2 000 r/min)60 s，將96孔板放置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上，擴(kuò)增條件為60℃ 30 s、95℃ 10 min；95℃ 15 s、 60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用 Chromas 軟件讀取結(jié)果并分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用非條件Logistic回歸分析NLRP3 炎癥小體基因位點(diǎn)rs4612666與肺癌遺傳易感性的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料及血清炎癥指標(biāo)的比較 兩組一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；觀察組血清IL-1β、IL-18表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料及血清炎癥指標(biāo)的比較

2.2 NLRP3 rs4612666位點(diǎn)基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 兩組NLRP3位點(diǎn)rs4612666基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05) ，提示選擇的樣本具有群體代表性。見表2。

表2 NLRP3基因位點(diǎn)rs4612666 基因型分布Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)(n)

2.3 兩組rs4612666基因型和等位基因頻率分布比較 兩組rs4612666位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組T等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組NLRP3基因位點(diǎn)rs4612666基因型和等位基因頻率分布的比較[n(%)]

2.4 NLRP3 rs4612666位點(diǎn)基因型及等位基因與肺癌易感性的相關(guān)性 采用Logistic回歸模型，校正性別、年齡等因素后，結(jié)果顯示TT 基因型為肺癌的易感基因型[OR(95%CI)=1.294(0.675～2.479)，P=0.015]，攜帶T等位基因是發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)因素[OR(95%CI)=1.612(1.060～2.451)，P<0.001]。

3 討 論

目前，腫瘤相關(guān)性炎癥已成為學(xué)術(shù)界公認(rèn)的腫瘤第7種生物學(xué)特性，長(zhǎng)期反復(fù)的慢性炎癥是引起細(xì)胞惡變最終導(dǎo)致腫瘤形成的重要原因。炎癥反應(yīng)可破壞組織的基因穩(wěn)定性，造成基因突變，激活原癌基因，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展；同時(shí)，腫瘤發(fā)生后又可加劇其生長(zhǎng)微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)[7]，造成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清IL-1β、IL-18水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，提示IL-1β、IL-18參與的炎癥反應(yīng)在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮重要作用，有學(xué)者推測(cè)炎癥小體可能在其中扮演了重要角色[8]。炎癥小體是由多種蛋白參與組裝形成的一種大分子復(fù)合體，在固有免疫系統(tǒng)中扮演重要角色。研究證實(shí)，NLRP3是在肺癌組織中主要表達(dá)的炎癥小體亞型之一[9]。在感染或組織損傷早期，炎癥小體對(duì)炎癥反應(yīng)的平衡和穩(wěn)態(tài)有調(diào)節(jié)作用[10]。在微環(huán)境中各種因素的長(zhǎng)期刺激下，炎癥小體的組成蛋白如胱天蛋白酶原-1、IL-1β前體及IL-18前體等啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄翻譯；同時(shí)在外界微環(huán)境中的另一些因素刺激下， 胱天蛋白酶原-1被剪切成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，進(jìn)一步剪切IL-1β前體、IL-18前體，使炎癥因子 IL-1β、IL-18被釋放[11]。大量研究結(jié)果提示，燃煤造成的空氣污染很可能為云南省宣威地區(qū)肺癌高發(fā)的主要環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素，該地區(qū)煤炭燃燒后可產(chǎn)生較高濃度的二氧化硅、多環(huán)芳烴和苯并(α)芘等致癌物，且該地區(qū)室內(nèi)PM10具有較強(qiáng)的氧化損傷能力[12-13]，而二氧化硅晶體、多環(huán)芳烴可誘導(dǎo) NLRP3 炎癥小體活化[14]。此外，多環(huán)芳烴在人體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物可與DNA共價(jià)形成多環(huán)芳烴-DNA，導(dǎo)致DNA損傷，引起基因突變，增強(qiáng) NLRP3的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤[15-16]。但是，在相同的暴露環(huán)境中不同個(gè)體間的患病風(fēng)險(xiǎn)差異很大，部分人罹患肺癌，而部分人卻安然無恙，有學(xué)者指出這可能與個(gè)體的易感性有關(guān)[17]。

NLRP3炎癥小體基因rs4612666位點(diǎn)位于1號(hào)染色體，T>C為第 7 號(hào)內(nèi)含子變異；而堿基T突變會(huì)增強(qiáng)NLRP3的表達(dá)，激活被剪切成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，引起細(xì)胞凋亡[18]。檀潤(rùn)先[19]發(fā)現(xiàn)，NLRP3位點(diǎn)rs4612666 等位基因頻率與胃癌的遺傳易感性相關(guān)，野生堿基T的攜帶者更容易罹患胃癌。國(guó)外研究表明，rs4612666的T等位基因與大動(dòng)脈粥樣硬化引起的腦梗死及微栓子的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，兩組rs4612666位點(diǎn)基因型分布比例、等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且進(jìn)一步行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TT基因型屬于宣威肺癌的易感基因型(P<0.05)，T 等位基因的攜帶者更容易患上肺癌(P<0.05)。筆者推測(cè)，NLRP3基因位點(diǎn)rs4612666的突變可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致組織化生及肺癌的發(fā)生。

綜上所述，云南省宣威地區(qū)肺癌患者的T等位基因頻率高于健康人群，炎癥小體NLRP3的基因多態(tài)性可能與該地區(qū)居民肺癌遺傳易感性密切相關(guān)。因此，可通過基因水平篩查和外周血相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)控，對(duì)攜帶T等位基因的群體進(jìn)行重點(diǎn)追蹤和及早干預(yù)，減少該群體的患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究的樣本量小，結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生一定偏倚，因此仍需更深入的研究予進(jìn)一步證實(shí)所得結(jié)論。