鐘小妹 尹輝明 周康仕 邱飛 高丹 雷建明

湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科（湖南懷化418000）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distresssyndrome，ARDS）是由多種病因引起的一種綜合征，主要表現(xiàn)為進行性呼吸衰竭，臨床死亡率高達30%～60%［1-2］。膿毒癥、肺炎、創(chuàng)傷等多種病因均可引起ARDS，其中膿毒癥占40%，是ARDS 最常見的病因［3］。研究表明，膿毒癥可導(dǎo)致膈肌功能障礙出現(xiàn)收縮力下降［4-5］。

鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ（Calcium∕calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）是一種分布廣泛的絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶，存在于多種動物的細胞內(nèi)，其中神經(jīng)組織中含量最為豐富，是目前為止研究比較廣泛且功能最多的一種鈣調(diào)蛋白依賴性激酶，其生物學(xué)多樣且機制復(fù)雜［6］。脊柱動物的CaMKⅡ基因型非常保守，具有2a、2b、2d、2g四種基因型，其中2a 亞型僅在神經(jīng)組織中表達［7］，2b、2d、2g 則在骨骼肌、心肌等組織中均有表達［8］。CaMKⅡ是鈣離子調(diào)節(jié)蛋白及轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重要效應(yīng)器，其可通過激活一些靶蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等，從而介導(dǎo)細胞的萎縮、凋亡等多種生物過程［9-10］。

目前研究表明，CaMKⅡ在膿毒癥導(dǎo)致的骨骼肌功能障礙中表達是下調(diào)的［11］，其可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致骨骼肌損傷，最終出現(xiàn)功能障礙［12］。同時，也有研究表明，CaMKⅡ的高表達在心肌功能障礙中占有重要作用［13］。因此，就目前研究來說，對于CaMKⅡ在心肌及骨骼肌中的表達仍存在爭議。膈肌作為一種特殊類型的骨骼肌，同樣有著收縮功能，為呼吸提供主要動力，占總動力的60% ～80%［14］，在正常及心衰時維持一定的呼吸功能均占有非常重要的作用［15-16］。

目前對于CaMKⅡ在膈肌中有表達鮮有報道，且對于其在ARDS 導(dǎo)致的膈肌功能障礙中的研究則更少。因此，對CaMKⅡ在ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙中的研究具有非常重要的意義。

本研究通過構(gòu)建大鼠ARDS 致膈肌功能障礙模型，研究CaMKⅡ基因在膈肌組織中的表達，并通過建立不同時間梯度的ARDS 動物模型，對正常組CaMKⅡ不同亞型表達情況及ARDS 組表達的分析，為膿毒癥誘導(dǎo)ARDS 膈肌功能障礙致呼吸衰竭的治療提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備和試劑主要實驗設(shè)備：XP基因擴增儀（TC-XP-E），實時熒光定量PCR 儀（ABI 7500）。微量紫外分析儀（NANO DROP 2000）。主要實驗試劑：脂多糖（Lipopolysaccharides LPS Sigma 公司，032M4082V），異丙醇，固相RNA 酶清除劑（湖南醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)實驗室），氯仿，10%水合氯醛，Trison（TaKaRa 公司，Code No. 9108∕9109），細胞分散器（IKA T10 basic，ULTRA-TURRAX），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A），PCR 試 劑 盒（TaKaRa 公司，SYBR?Premix Ex TaqTMII，RR820A）；

1.2 動物健康成年SD（Sprague-Dawley）32 只（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），雄性，月齡（2 個月± 1 周），體質(zhì)量（250 ± 20）g。將SD大鼠隨機分成對照組和ARDS 實驗組，并將ARDS實驗組進一步隨機分為ARDS 24 h 組、48 h 組及7 d 組。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備動物模型隨機分組后，對照組腹腔注射生理鹽水（10 mL∕d），ARDS 24 h 組腹腔注射LPS 8 mg∕（kg·d），觀察24 h；ARDS 48 h 組先注射一次LPS 8 mg∕（kg·d），24 h 后再次注射LPS，持續(xù)觀察48 h；ARDS 7 d 組先注射一次LPS 8 mg∕（kg·d），24 h 后再次注射LPS，持續(xù)觀察7 d。觀察內(nèi)容包括大鼠的生命體征、體質(zhì)量、進食、活動。

1.3.2 獲取標本結(jié)束觀察后，將大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，取出膈肌組織，分裝至EP管（50 ～100 mg∕管），用液氮轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 提取RNA取出標本，冰上操作，剪碎組織，勻漿，離心分層數(shù)次，棄上清，取得RNA。用微量紫外分析儀對RNA 濃度及純度進行測定，選用純度為2.0 ～2.1 的RNA。

1.3.4 Real-time PCR從GenBank 查 出SD 大 鼠β-actin 和CaMKⅡ三種基因型的基因mRNA 序列，利用Primer-BLSAT設(shè)計專一引物，并由上海生工生物工程公司合成。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，得20 μL cDNA，稀釋1倍，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明擴增，擴增反應(yīng)條件：95 ℃5 min；循環(huán)時95 ℃30 s、56 ℃60 s、72 ℃20 s 共40 個循環(huán)。擴增過程中觀察記錄熒光曲線及溶解曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法以均數(shù)±標準差表示各組數(shù)據(jù)，通過SPSS 25 軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。采用單因素方差分析的方法對CaMKⅡ各亞型mRNA的表達進行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ2b、2d、2g 在正常組織中mRNA 的Ct 值CaMKⅡ2b、2d、2g 在正常膈肌中均有表達，其中2b 表達最少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 各組CaMKII 3 亞型的Ct 值Tab.1 Ct value of CaMKII 3 subtype in each group ±s

表1 各組CaMKII 3 亞型的Ct 值Tab.1 Ct value of CaMKII 3 subtype in each group ±s

組別（n=8）Ct Normal 2b Normal 2d Normal 2g 33.11±0.72*28.57±0.58 27.69±0.59

2.2 鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ2b、2d、2g 在對照組及膿毒癥致急性呼吸窘迫綜合征不同時間（24、48 h、7 d）組中的mRNA 相對表達量CaMKⅡ2b、2d、2g 三種亞型在ARDS 組（24、48 h、7 d）中表達均比對照組高，且同時均在ARDS 48 h 組表達最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ARDS 48 h組內(nèi)三種亞型進行比較，其中CaMKⅡ2b 亞型表達水平較CaMKⅡ2d、2g 明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

ARDS 病死率高，臨床治療效果差，且目前尚無有效治療靶點。膈肌不同于骨骼肌及心肌，且目前對于CaMKⅡ在膈肌中的表達情況，及其在LPS 誘導(dǎo)的ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙中的研究尚不清楚。

表2 各組camki2b、2d、2 g mRNA 的表達水平Tab.2 The expression level of CaMKII 2b、2d、2g mRNA in each group ±s

表2 各組camki2b、2d、2 g mRNA 的表達水平Tab.2 The expression level of CaMKII 2b、2d、2g mRNA in each group ±s

注：與ARDS 組比較，*P ＜0.05；與ARDS 24 h、7 d 組比較，#P ＜0.05；（ARDS 48 h 組中）與CaMKII2d、2g 亞型比較，△P ＜0.05

CaMKII 2b mRNA（AU）CaMKII 2d mRNA（AU）CaMKII 2g mRNA（AU）1*1*1*組別（n=8）對照組ARDS 24 h ARDS 48 h ARDS 7 d 4.94±1.08 15.07±5.02#△4.18±1.23 2.23±0.44 4.43±1.96#2.11±0.49 2.06±0.38 3.65±1.54#2.04±0.72

研究表明，CaMKⅡ的過量表達在心肌功能障礙中占有重要作用［17］，其可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣離子水平從而影響肌肉興奮收縮偶連、調(diào)節(jié)細胞程序性死亡等參與心肌收縮力下降［18］，而抑制CaMKⅡ的表達則可抑制心肌凋亡，從而進一步改善心臟功能，達到保護心臟的作用［19］。同時CaMKⅡ還可以通過參與介導(dǎo)細胞自噬調(diào)節(jié)心肌肥大最終導(dǎo)致心臟功能障礙的發(fā)生［20］。

本研究表明，CaMKⅡ不同亞型2b、2d、2g 在正常膈肌組織中均有表達，其中2b 表達最少。ARDS各組膈肌細胞內(nèi)CaMKⅡ的不同亞型（2b 2d 2g）mRNA 表達水平均比對照組顯著上調(diào)，表明CaMKⅡ參與了LPS 誘導(dǎo)ARDS 導(dǎo)致的膈肌功能障礙。我們前期研究表明，作為CaMKⅡ的上游調(diào)節(jié)因子-鈣調(diào)蛋白（camodulin，CaM）的高表達在膿毒癥致ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙中占有重要作用［21］。因此推測膿毒癥致ARDS 時，導(dǎo)致上游因子CaM 表達增高，其作為細胞內(nèi)最主要的Ca2+結(jié)合蛋白，通過與Ca2+結(jié)合后形成Ca2+-CaM 復(fù)合物，從而激活CaMKⅡ使其表達上調(diào)，最終再進一步通過激活下游因子如血清應(yīng)答因子（surum factor）等最終導(dǎo)致肌肉收縮功能障礙［22］。本研究表明在ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙的大鼠模型中，CaMKⅡ2b、2d、2g均在ARDS 48 h 組中表達最高，且2b 亞型較2d、2g表達水平明顯升高，但正常膈肌組織中CaMKⅡ2b 亞型表達最少。結(jié)合筆者前期的研究，膈肌在ARDS 48 h 組損傷最重［23］，因此，在膈肌損傷最重時，CaMKⅡ三種亞型表達均顯著升高，進一步表明其參與LPS 誘導(dǎo)的ARDS 致膈肌功能障礙。同時，CaMKⅡ2b 亞型在正常膈肌組織中表達最少，但是在膈肌損傷最重時（ARDS 48 h 組）表達水平卻最高，推測其可能是導(dǎo)致膈肌功能障礙最主要的基因型。因此，當膿毒癥發(fā)生時，膈肌組織通過上調(diào)CaM 的表達從而激活下游CaMKⅡ2b，使其表達上調(diào)，并進一步激活下游因子如血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）等，從而導(dǎo)致膈肌功能障礙［24］或通過介導(dǎo)細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子水平、細胞程序性死亡等過程導(dǎo)致肌肉功能障礙。

本研究首次在膈肌中發(fā)現(xiàn)了CaMKⅡ的表達，明確其在膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙中的作用，探索了其作用機制。理論上可以通過靶向性抑制CaMKⅡ2b 亞型的表達，從而改善膈肌功能，增加膈肌收縮力，最終改善呼吸衰竭情況，為臨床ARDS 導(dǎo)致呼吸衰竭的治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

但本研究仍存在一些不足，缺乏對下游信號因子基因及蛋白水平的進一步研究，從而導(dǎo)致信號通路研究的不完整性。關(guān)于這些不足，一方面，目前正在對其下游因子，血漿應(yīng)答因子等的表達進行研究，在蛋白水平、基因水平、酶活性等方面對該通路進行進一步探索，進一步更全面詮釋該通路在ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙中的作用。另一方面，同時在對CaMKⅡ其介導(dǎo)的炎癥因子通路、及細胞死亡等信號通路進行研究，從而進一步明確CaMKⅡ在ARDS 導(dǎo)致膈肌功能障礙中作用的研究。