趙 倩,高 霖,王長謙,張俊峰,張繪莉,卓 楊
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,上海200011
2010 年,國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Union of Immunological Societies,IUIS)命名委員會(huì)根據(jù)單核細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14 和CD16 表達(dá)的差異,將人類單核細(xì)胞分為3 個(gè)亞群[1]:①CD14+CD16-(簡稱為Mon1),為經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群,占總單核細(xì)胞的80%~85%。②CD14+CD16+(簡稱為Mon2),為中間型單核細(xì)胞亞群,占比約5%。③CD14-CD16+(簡稱為Mon3),為非經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群,占比5%~10%。目前,有關(guān)單核細(xì)胞亞群的比例及其功能變化的研究越來越多,如與心血管疾病之間的關(guān)系研究等,但具體的作用機(jī)制尚未被闡明。本研究通過觀察不同類型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease,CHD)患者外周血單核細(xì)胞亞群趨化因子CCL2(C-C motif chemokine ligand 2)、CX3CL1 (C-X3-C motif chemokine ligand 1)及 其 受 體CCR2 (C-C motif chemokine receptors 2)、CX3CR1(C-X3-C motif chemokine receptor 1)表達(dá)水平的變化,探討這些單核細(xì)胞亞群的趨化因子受體、亞群比例與CHD遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系以及可能的臨床應(yīng)用價(jià)值。
選擇2014 年1—6 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的CHD 患者63 例。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18~25歲。②以胸悶、胸痛癥狀就診。③冠狀動(dòng)脈造影(coronary angiography,CAG)結(jié)果為陽性。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有各類感染性疾病。②患有擴(kuò)張性心肌病、瓣膜性心臟病、慢性心力衰竭、缺血性心肌病、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病。③長期服用免疫抑制劑。
本研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批(審批號(hào):2015117)。所有入組患者均簽署了知情同意書。
對(duì)患者的如下資料進(jìn)行收集。①一般資料,包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)。②臨床資料,包括心血管危險(xiǎn)因素,如冠心病家族史、吸煙史、合并高血壓或糖尿病,心血管藥物的應(yīng)用,藥物包括抗血小板藥物、他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI/angiotensin Ⅱreceptor antagonist,ARB)及β受體阻滯劑,心電圖,CAG結(jié)果和Gensini冠脈評(píng)分。③檢測指標(biāo),包括外周血單核細(xì)胞趨化因子及其受體、心肌損傷標(biāo)志物[肌鈣蛋白I(Troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)]、白細(xì)胞(white blood cell,WBC)總數(shù)、WBC 分類計(jì)數(shù)(包括中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù))、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-Ch)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-Ch)、三酰甘油(triacylglycerol,TAG)、肌酐、空腹血糖、同型半胱氨酸、超敏C 反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)及舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)。
1.3.1 CCR2、CX3CR1 表達(dá)水平及單核細(xì)胞亞群分析 入院24 h內(nèi)采集患者的靜脈全血,注入乙二胺四乙酸抗凝管中,于2 h 內(nèi)進(jìn)行檢測。參照相關(guān)說明書,通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀對(duì)CCR2和CX3CR1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)所用抗體單克隆小鼠抗人CD14(PE-CyTM5.5標(biāo)記)、CCR2(PE 標(biāo)記)和CX3CR1(FITC 標(biāo)記)均購于美國BioLegend公司。在觀察分析時(shí),通過側(cè)向散射光和根據(jù)CD14的表達(dá),圈定需要觀察的單核細(xì)胞亞群;收集CCR2 和CX3CR1 的熒光信號(hào),分析其表達(dá)水平,并結(jié)合IUIS的單核細(xì)胞亞群命名規(guī)則,將單核細(xì)胞分為3個(gè)亞群,即CCR2+CX3CR1-(Mon1)、CCR2+CX3CR1+(Mon2)和CCR2-CX3CR1+(Mon3),對(duì)亞群比例進(jìn)行分析。
1.3.2 血清CCL2和CX3CL1水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對(duì)血清CCL2 和CX3CL1 水平進(jìn)行檢測,具體操作參照ELISA檢測試劑盒說明書。
綜合患者的心肌損傷標(biāo)志物水平、心電圖和CAG 結(jié)果,將其分為急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)組和穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris,SAP)組;其中,ACS 組包括3 類患者,即ST 段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者、 非ST 段抬高型心肌梗死(non-ST segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)患者和不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina pectoris,UA)患者。
通過電話、門診、再住院等方式,每3個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行1 次隨訪,內(nèi)容為是否發(fā)生主要不良心臟事件(major adverse cardiac event,MACE)。該事件包括心源性死亡、致死性和非致死性缺血性腦卒中、再發(fā)心肌梗死、心力衰竭、再次行急診或擇期血運(yùn)重建。
應(yīng)用SPSS 23.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以±s 表示,采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間比較,采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較;不符合正態(tài)分布的定量資料以M(Q1,Q3) 表示,采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用多因素Logistic 回歸模型對(duì)hs-CRP水平、WBC計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞亞群比例、趨化因子水平等與MACE 發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在63 例CHD 患 者 中,ACS 組46 例(包 括12 例STEMI、15 例NSTEMI 及19 例UA 患者),SAP 組17 例。對(duì)2 組患者的一般資料、臨床資料和檢測指標(biāo)進(jìn)行分析,結(jié)果(表1)顯示:與SAP組相比,ACS組患者的他汀類藥物的應(yīng)用比例、Gensini 冠脈評(píng)分及心肌損傷標(biāo)志物水平均較高(均P=0.000);且在ACS 組內(nèi),UA 患者的Gensini 冠脈評(píng)分、心肌損傷標(biāo)志物水平均低于STEMI 患者,NSTEMI 患者的上述該2 指標(biāo)均低于STEMI 患者,UA 患者心肌損傷標(biāo)志物水平低于NSTEMI 患者(均P<0.05)。
表1 不同類型CHD患者的一般資料、臨床資料和檢測指標(biāo)比較Tab 1 Comparison of general data,clinical data and testing indexes in different types of CHD patients
Continued Tab
在5 年的隨訪中,ACS 組共有14 例患者發(fā)生MACE;其中,STEMI 患者有1 例發(fā)生心源性死亡、2 例再次擇期血運(yùn)重建、1 例心力衰竭,NSTEMI 患者有1 例發(fā)生心源性死亡、3 例再次擇期血運(yùn)重建、1 例心力衰竭、1 例非致死性缺血性腦卒中,UA 患者有3 例發(fā)生再次擇期血運(yùn)重建、1 例非致死性缺血性腦卒中。SAP 組有1 例發(fā)生MACE(再次擇期血運(yùn)重建)。
如表2 所示,與SAP 組相比,ACS 組患者的WBC 總數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、hs-CRP 水平、CCL2水平和CX3CL1水平均較高(均P<0.05);且在ACS組內(nèi),STEMI 患者的WBC 總數(shù)、hs-CRP 水平均高于UA患者和NSTEMI 患者,單核細(xì)胞計(jì)數(shù)高于UA 患者(均P<0.05)。
表2 不同類型CHD患者的WBC總數(shù)和分類計(jì)數(shù)、hs-CRP水平、CX3CL1和CCL2水平比較Tab 2 Comparison of WBC count and differential count,and hs-CRP,CX3CL1 and CCL2 levels in different types of CHD patients
通過流式細(xì)胞術(shù)檢測及亞群比例分析,結(jié)果(表3)顯示:與SAP 組相比,ACS 組患者的CCR2+CX3CR1+、CCR2-CX3CR1+亞群比例較高,CCR2+CX3CR1-亞群比例較低(均P=0.000);且在ACS 組內(nèi),STEMI 患者的CCR2+CX3CR1-亞群比例低于NSTEMI 患者和UA 患者(P=0.004,P=0.008)。
表3 不同類型CHD患者的單核細(xì)胞亞群占比分析Tab 3 Analysis of monocyte subset proportion in different types of CHD patients
采用單因素Logistic 回歸模型對(duì)不同類型CHD 患者WBC 總數(shù)、WBC 分類計(jì)數(shù)、CCL2水平、CX3CL1水平、hs-CRP 水平及3 種單核細(xì)胞亞群占比進(jìn)行分析,結(jié)果顯示hs-CRP 水平、CCR2+CX3CR1-比例、CCR2+CX3CR1+比例為MACE 發(fā)生的影響因素(均P<0.05)。將上述3 個(gè)指標(biāo)行多因素Logistic 回歸分析,結(jié)果顯示該3 個(gè)指標(biāo)均為MACE發(fā)生的危險(xiǎn)因素。
表4 影響MACE發(fā)生的單因素和多因素Logistic回歸分析Tab 4 Univariate and multivariate Logistic regression analysis of MACE occurrence
單核細(xì)胞亞群的比例及其功能的異常是多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)之一[2]。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段,不同亞群的單核細(xì)胞在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成、斑塊破裂、心肌重構(gòu)等方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用[3]。單核細(xì)胞亞群的遷移由趨化因子受體介導(dǎo),且不同亞群表達(dá)趨化因子受體的種類也不相同,如Mon1主要表達(dá)CCR2,Mon2 和Mon3 主要表達(dá)CX3CR1[4]。本研究顯示:單核細(xì)胞亞群比例及趨化因子CX3CL1水平在ACS組和SAP組間具有明顯的差異;且在ACS患者中,單核細(xì)胞CCR2+CX3CR1-亞 群 明 顯 減 少, CCR2+CX3CR1+和CCR2-CX3CR1+亞群的比例增加,同時(shí)伴隨血清CX3CL1水平升高。單核細(xì)胞亞群表面標(biāo)志物的不同決定了其功能狀態(tài)的異質(zhì)性[1]。既往研究[5-6]表明,在CX3CL1-CX3CR1介導(dǎo)下,單核細(xì)胞可通過遷移和黏附至損傷的內(nèi)皮細(xì)胞來激活血小板,還可通過CX3CL1-CX3CR1 與血管平滑肌細(xì)胞相互作用,促進(jìn)斑塊的易損和破裂,導(dǎo)致急性冠脈事件發(fā)生。本研究所觀察到的ACS 患者CCR2+CX3CR1+和CCR2-CX3CR1+單核細(xì)胞比例增加的現(xiàn)象可能與這一機(jī)制相關(guān)。本研究中ACS 組的3 類患者的單核細(xì)胞亞群比例特點(diǎn)也略有不同,如STEMI 患者的CCR2+CX3CR1-亞群比例較NSTEMI 患者和UA 患者明顯減少,而CCR2+CX3CR1+亞群比例和CCR2-CX3CR1+亞群比例在3類患者間無明顯差異;究其原因,可能與該3類疾病的發(fā)病機(jī)制仍略有區(qū)別相關(guān)。
在本研究中,ACS 患者中CCR2+CX3CR1-(Mon1)比例較SAP 患者顯著降低,CCR2+CX3CR1+(Mon2)和CCR2-CX3CR1+(Mon3)比例顯著增加。類似地,Schlitt等[7]應(yīng)用多排螺旋CT 檢查發(fā)現(xiàn),斑塊不穩(wěn)定患者的Mon2 型單核細(xì)胞數(shù)量較斑塊穩(wěn)定者有顯著增加;分析其原因,可能與Mon2亞群能夠分泌多種促炎癥因子、表達(dá)大量趨化因子受體(如CCR2、CX3CR1 和CCR5)有關(guān)。而上述特點(diǎn)也使Mon2亞群成為了重要的促動(dòng)脈粥樣硬化類細(xì)胞,與動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),Mon2與CHD患者5年MACE的發(fā)生相關(guān)。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查研究[8]顯示,Mon2 亞群數(shù)量是高危慢性腎臟病透析患者發(fā)生心血管事件和死亡的獨(dú)立預(yù)測因子之一。鄒春霞等[9]發(fā)現(xiàn),Mon2 亞群數(shù)量與STEMI 患者住院期間的死亡事件之間存在明顯正相關(guān),提示Mon2亞群數(shù)量可能具有一定的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。因此,CCR2+CX3CR1+亞群比例或?qū)⒊蔀榕R床上評(píng)估CHD 患者遠(yuǎn)期預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。
本研究尚存在一定的局限性:①檢測的單核細(xì)胞亞群表面標(biāo)志物有限。由于不同亞群的單核細(xì)胞表面均表達(dá)有大量的趨化因子受體和細(xì)胞因子受體,且在不同疾病狀態(tài)下這些受體的表達(dá)均會(huì)發(fā)生不同程度的改變,因此僅檢測CD14、CD16、CCR2 和CX3CR1 無法全面反映各個(gè)亞群表面標(biāo)志物的變化情況。目前,最新研發(fā)的質(zhì)譜流式技術(shù)可在單細(xì)胞水平同時(shí)檢測近百種蛋白表達(dá),未來可通過這一新技術(shù)對(duì)其加以更加精準(zhǔn)的分析。②本研究為單中心、小樣本研究,未在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)隨訪單核細(xì)胞亞群趨化因子受體的變化,后續(xù)有待大規(guī)模的臨床研究對(duì)本研究結(jié)果加以證實(shí)。此外,本研究還對(duì)11例CAG 陰性的對(duì)照患者進(jìn)行了CX3CR1 和CCR2 檢測,發(fā)現(xiàn)該類患者以Mon1 亞群為主,且隨訪5 年無MACE 發(fā)生,故而未納入本研究。
綜上所述,不同類型CHD 患者的單核細(xì)胞亞群趨化因子及其受體均呈特征性變化,且不同單核細(xì)胞亞群比例可能與CHD 患者的遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)。未來可通過開展大規(guī)模的臨床研究,進(jìn)一步驗(yàn)證以CX3CR1和CCR2為特征的單核細(xì)胞亞群比例變化在CHD 患者長期預(yù)后中的意義和價(jià)值,為CHD 患者遠(yuǎn)期預(yù)后危險(xiǎn)分層的評(píng)估和治療策略的制定提供一定的幫助。