趙 倩，高 霖，王長謙，張俊峰，張繪莉，卓 楊

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200011

2010 年，國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)（International Union of Immunological Societies，IUIS）命名委員會(huì)根據(jù)單核細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14 和CD16 表達(dá)的差異，將人類單核細(xì)胞分為3 個(gè)亞群［1］：①CD14+CD16-（簡稱為Mon1），為經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群，占總單核細(xì)胞的80%～85%。②CD14+CD16+（簡稱為Mon2），為中間型單核細(xì)胞亞群，占比約5%。③CD14-CD16+（簡稱為Mon3），為非經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群，占比5%～10%。目前，有關(guān)單核細(xì)胞亞群的比例及其功能變化的研究越來越多，如與心血管疾病之間的關(guān)系研究等，但具體的作用機(jī)制尚未被闡明。本研究通過觀察不同類型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD）患者外周血單核細(xì)胞亞群趨化因子CCL2（C-C motif chemokine ligand 2）、CX3CL1 （C-X3-C motif chemokine ligand 1）及 其 受 體CCR2 （C-C motif chemokine receptors 2）、CX3CR1（C-X3-C motif chemokine receptor 1）表達(dá)水平的變化，探討這些單核細(xì)胞亞群的趨化因子受體、亞群比例與CHD遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系以及可能的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014 年1—6 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的CHD 患者63 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～25歲。②以胸悶、胸痛癥狀就診。③冠狀動(dòng)脈造影（coronary angiography，CAG）結(jié)果為陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有各類感染性疾病。②患有擴(kuò)張性心肌病、瓣膜性心臟病、慢性心力衰竭、缺血性心肌病、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病。③長期服用免疫抑制劑。

本研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批（審批號(hào)：2015117）。所有入組患者均簽署了知情同意書。

1.2 患者資料收集

對(duì)患者的如下資料進(jìn)行收集。①一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。②臨床資料，包括心血管危險(xiǎn)因素，如冠心病家族史、吸煙史、合并高血壓或糖尿病，心血管藥物的應(yīng)用，藥物包括抗血小板藥物、他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI/angiotensin Ⅱreceptor antagonist，ARB）及β受體阻滯劑，心電圖，CAG結(jié)果和Gensini冠脈評(píng)分。③檢測指標(biāo)，包括外周血單核細(xì)胞趨化因子及其受體、心肌損傷標(biāo)志物［肌鈣蛋白I（Troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）］、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）總數(shù)、WBC 分類計(jì)數(shù)（包括中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-Ch）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-Ch）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、肌酐、空腹血糖、同型半胱氨酸、超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）及舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）。

1.3 外周血單核細(xì)胞趨化因子及其受體的檢測

1.3.1 CCR2、CX3CR1 表達(dá)水平及單核細(xì)胞亞群分析 入院24 h內(nèi)采集患者的靜脈全血，注入乙二胺四乙酸抗凝管中，于2 h 內(nèi)進(jìn)行檢測。參照相關(guān)說明書，通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀對(duì)CCR2和CX3CR1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)所用抗體單克隆小鼠抗人CD14（PE-CyTM5.5標(biāo)記）、CCR2（PE 標(biāo)記）和CX3CR1（FITC 標(biāo)記）均購于美國BioLegend公司。在觀察分析時(shí)，通過側(cè)向散射光和根據(jù)CD14的表達(dá)，圈定需要觀察的單核細(xì)胞亞群；收集CCR2 和CX3CR1 的熒光信號(hào)，分析其表達(dá)水平，并結(jié)合IUIS的單核細(xì)胞亞群命名規(guī)則，將單核細(xì)胞分為3個(gè)亞群，即CCR2+CX3CR1-（Mon1）、CCR2+CX3CR1+（Mon2）和CCR2-CX3CR1+（Mon3），對(duì)亞群比例進(jìn)行分析。

1.3.2 血清CCL2和CX3CL1水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對(duì)血清CCL2 和CX3CL1 水平進(jìn)行檢測，具體操作參照ELISA檢測試劑盒說明書。

1.4 分組情況

綜合患者的心肌損傷標(biāo)志物水平、心電圖和CAG 結(jié)果，將其分為急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）組和穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）組；其中，ACS 組包括3 類患者，即ST 段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者、 非ST 段抬高型心肌梗死（non-ST segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）患者和不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UA）患者。

1.5 隨訪途徑及內(nèi)容

通過電話、門診、再住院等方式，每3個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行1 次隨訪，內(nèi)容為是否發(fā)生主要不良心臟事件（major adverse cardiac event，MACE）。該事件包括心源性死亡、致死性和非致死性缺血性腦卒中、再發(fā)心肌梗死、心力衰竭、再次行急診或擇期血運(yùn)重建。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以±s 表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間比較，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較；不符合正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3） 表示，采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用多因素Logistic 回歸模型對(duì)hs-CRP水平、WBC計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞亞群比例、趨化因子水平等與MACE 發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料、臨床資料和檢測指標(biāo)分析

在63 例CHD 患 者 中，ACS 組46 例（包 括12 例STEMI、15 例NSTEMI 及19 例UA 患者），SAP 組17 例。對(duì)2 組患者的一般資料、臨床資料和檢測指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果（表1）顯示：與SAP組相比，ACS組患者的他汀類藥物的應(yīng)用比例、Gensini 冠脈評(píng)分及心肌損傷標(biāo)志物水平均較高（均P=0.000）；且在ACS 組內(nèi)，UA 患者的Gensini 冠脈評(píng)分、心肌損傷標(biāo)志物水平均低于STEMI 患者，NSTEMI 患者的上述該2 指標(biāo)均低于STEMI 患者，UA 患者心肌損傷標(biāo)志物水平低于NSTEMI 患者（均P＜0.05）。

表1 不同類型CHD患者的一般資料、臨床資料和檢測指標(biāo)比較Tab 1 Comparison of general data，clinical data and testing indexes in different types of CHD patients

Continued Tab

2.2 隨訪分析

在5 年的隨訪中，ACS 組共有14 例患者發(fā)生MACE；其中，STEMI 患者有1 例發(fā)生心源性死亡、2 例再次擇期血運(yùn)重建、1 例心力衰竭，NSTEMI 患者有1 例發(fā)生心源性死亡、3 例再次擇期血運(yùn)重建、1 例心力衰竭、1 例非致死性缺血性腦卒中，UA 患者有3 例發(fā)生再次擇期血運(yùn)重建、1 例非致死性缺血性腦卒中。SAP 組有1 例發(fā)生MACE（再次擇期血運(yùn)重建）。

2.3 患者WBC 總數(shù)和分類計(jì)數(shù)、hs-CRP 水平、CCL2和CX3CL1水平分析

如表2 所示，與SAP 組相比，ACS 組患者的WBC 總數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、hs-CRP 水平、CCL2水平和CX3CL1水平均較高（均P＜0.05）；且在ACS組內(nèi)，STEMI 患者的WBC 總數(shù)、hs-CRP 水平均高于UA患者和NSTEMI 患者，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)高于UA 患者（均P＜0.05）。

表2 不同類型CHD患者的WBC總數(shù)和分類計(jì)數(shù)、hs-CRP水平、CX3CL1和CCL2水平比較Tab 2 Comparison of WBC count and differential count，and hs-CRP，CX3CL1 and CCL2 levels in different types of CHD patients

2.4 CCR2和CX3CR1的表達(dá)及相關(guān)亞群占比分析

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測及亞群比例分析，結(jié)果（表3）顯示：與SAP 組相比，ACS 組患者的CCR2+CX3CR1+、CCR2-CX3CR1+亞群比例較高，CCR2+CX3CR1-亞群比例較低（均P=0.000）；且在ACS 組內(nèi)，STEMI 患者的CCR2+CX3CR1-亞群比例低于NSTEMI 患者和UA 患者（P=0.004，P=0.008）。

表3 不同類型CHD患者的單核細(xì)胞亞群占比分析Tab 3 Analysis of monocyte subset proportion in different types of CHD patients

2.5 影響MACE發(fā)生的單因素和多因素Logistic回歸分析

采用單因素Logistic 回歸模型對(duì)不同類型CHD 患者WBC 總數(shù)、WBC 分類計(jì)數(shù)、CCL2水平、CX3CL1水平、hs-CRP 水平及3 種單核細(xì)胞亞群占比進(jìn)行分析，結(jié)果顯示hs-CRP 水平、CCR2+CX3CR1-比例、CCR2+CX3CR1+比例為MACE 發(fā)生的影響因素（均P＜0.05）。將上述3 個(gè)指標(biāo)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示該3 個(gè)指標(biāo)均為MACE發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

表4 影響MACE發(fā)生的單因素和多因素Logistic回歸分析Tab 4 Univariate and multivariate Logistic regression analysis of MACE occurrence

3 討論

單核細(xì)胞亞群的比例及其功能的異常是多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)之一［2］。在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段，不同亞群的單核細(xì)胞在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成、斑塊破裂、心肌重構(gòu)等方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用［3］。單核細(xì)胞亞群的遷移由趨化因子受體介導(dǎo)，且不同亞群表達(dá)趨化因子受體的種類也不相同，如Mon1主要表達(dá)CCR2，Mon2 和Mon3 主要表達(dá)CX3CR1［4］。本研究顯示：單核細(xì)胞亞群比例及趨化因子CX3CL1水平在ACS組和SAP組間具有明顯的差異；且在ACS患者中，單核細(xì)胞CCR2+CX3CR1-亞 群 明 顯 減 少， CCR2+CX3CR1+和CCR2-CX3CR1+亞群的比例增加，同時(shí)伴隨血清CX3CL1水平升高。單核細(xì)胞亞群表面標(biāo)志物的不同決定了其功能狀態(tài)的異質(zhì)性［1］。既往研究［5-6］表明，在CX3CL1-CX3CR1介導(dǎo)下，單核細(xì)胞可通過遷移和黏附至損傷的內(nèi)皮細(xì)胞來激活血小板，還可通過CX3CL1-CX3CR1 與血管平滑肌細(xì)胞相互作用，促進(jìn)斑塊的易損和破裂，導(dǎo)致急性冠脈事件發(fā)生。本研究所觀察到的ACS 患者CCR2+CX3CR1+和CCR2-CX3CR1+單核細(xì)胞比例增加的現(xiàn)象可能與這一機(jī)制相關(guān)。本研究中ACS 組的3 類患者的單核細(xì)胞亞群比例特點(diǎn)也略有不同，如STEMI 患者的CCR2+CX3CR1-亞群比例較NSTEMI 患者和UA 患者明顯減少，而CCR2+CX3CR1+亞群比例和CCR2-CX3CR1+亞群比例在3類患者間無明顯差異；究其原因，可能與該3類疾病的發(fā)病機(jī)制仍略有區(qū)別相關(guān)。

在本研究中，ACS 患者中CCR2+CX3CR1-（Mon1）比例較SAP 患者顯著降低，CCR2+CX3CR1+（Mon2）和CCR2-CX3CR1+（Mon3）比例顯著增加。類似地，Schlitt等［7］應(yīng)用多排螺旋CT 檢查發(fā)現(xiàn)，斑塊不穩(wěn)定患者的Mon2 型單核細(xì)胞數(shù)量較斑塊穩(wěn)定者有顯著增加；分析其原因，可能與Mon2亞群能夠分泌多種促炎癥因子、表達(dá)大量趨化因子受體（如CCR2、CX3CR1 和CCR5）有關(guān)。而上述特點(diǎn)也使Mon2亞群成為了重要的促動(dòng)脈粥樣硬化類細(xì)胞，與動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Mon2與CHD患者5年MACE的發(fā)生相關(guān)。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查研究［8］顯示，Mon2 亞群數(shù)量是高危慢性腎臟病透析患者發(fā)生心血管事件和死亡的獨(dú)立預(yù)測因子之一。鄒春霞等［9］發(fā)現(xiàn)，Mon2 亞群數(shù)量與STEMI 患者住院期間的死亡事件之間存在明顯正相關(guān)，提示Mon2亞群數(shù)量可能具有一定的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。因此，CCR2+CX3CR1+亞群比例或?qū)⒊蔀榕R床上評(píng)估CHD 患者遠(yuǎn)期預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。

本研究尚存在一定的局限性：①檢測的單核細(xì)胞亞群表面標(biāo)志物有限。由于不同亞群的單核細(xì)胞表面均表達(dá)有大量的趨化因子受體和細(xì)胞因子受體，且在不同疾病狀態(tài)下這些受體的表達(dá)均會(huì)發(fā)生不同程度的改變，因此僅檢測CD14、CD16、CCR2 和CX3CR1 無法全面反映各個(gè)亞群表面標(biāo)志物的變化情況。目前，最新研發(fā)的質(zhì)譜流式技術(shù)可在單細(xì)胞水平同時(shí)檢測近百種蛋白表達(dá)，未來可通過這一新技術(shù)對(duì)其加以更加精準(zhǔn)的分析。②本研究為單中心、小樣本研究，未在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)隨訪單核細(xì)胞亞群趨化因子受體的變化，后續(xù)有待大規(guī)模的臨床研究對(duì)本研究結(jié)果加以證實(shí)。此外，本研究還對(duì)11例CAG 陰性的對(duì)照患者進(jìn)行了CX3CR1 和CCR2 檢測，發(fā)現(xiàn)該類患者以Mon1 亞群為主，且隨訪5 年無MACE 發(fā)生，故而未納入本研究。

綜上所述，不同類型CHD 患者的單核細(xì)胞亞群趨化因子及其受體均呈特征性變化，且不同單核細(xì)胞亞群比例可能與CHD 患者的遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)。未來可通過開展大規(guī)模的臨床研究，進(jìn)一步驗(yàn)證以CX3CR1和CCR2為特征的單核細(xì)胞亞群比例變化在CHD 患者長期預(yù)后中的意義和價(jià)值，為CHD 患者遠(yuǎn)期預(yù)后危險(xiǎn)分層的評(píng)估和治療策略的制定提供一定的幫助。