張寶會(huì)，姚新轉(zhuǎn)，陳湖芳，張傳明，呂立堂,※

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 5500251；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025；）

刺梨具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。它富含山梨素、維生素C、多酚、多糖和-谷甾醇等物質(zhì)，其中所含維生素C為27 040 mg/kg[1]，被稱為“維生素C 之王”。前期研究發(fā)現(xiàn)，刺梨具有多種生理功能：山梨素具有消化、健脾、收斂和止瀉的作用，主要用于治療腹脹和腹瀉等疾?。稽S昌娥等[2]研究刺梨提取物可在體外抗肝癌細(xì)胞增殖，對(duì)肝癌有一定抑制作用；王輝等[3]發(fā)現(xiàn)刺梨干粉可以調(diào)節(jié)腎功能并延緩腎功能衰竭；王慧等[4]研究了刺梨中砷的吸附機(jī)理；李俊等[5]發(fā)現(xiàn)刺梨粉具有解毒作用；楊江濤等[6]發(fā)現(xiàn)刺梨花可以提高小鼠的抗氧化能力并延緩衰老。由于刺梨的各種作用，其果實(shí)的研究已經(jīng)廣泛開展。目前市場(chǎng)上有刺梨干果、刺梨酒、刺梨飲料、刺梨果粉、刺梨蜜餞和刺梨軟糖等產(chǎn)品，價(jià)格便宜，營養(yǎng)豐富，易于保存，并有良好的市場(chǎng)反應(yīng)。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.F. normalisRehd. Et Wils.）是多年生的落葉喬木薔薇科灌木[7]，廣泛分布在中國西南地區(qū)，如貴州、廣西、湖南、四川和重慶。刺梨果是可食用的，長期以來一直被用作傳統(tǒng)中草藥[8]，因此，作為貴州獨(dú)特的植物資源一直是貴州保健食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但刺梨幼葉未得到合理地應(yīng)用，主要因?yàn)槠溆兹~很難采摘，且產(chǎn)量很小。刺梨幼葉通過茶的加工工藝制成的刺梨葉茶，由于其獨(dú)特的茶香氣和保健功效，在當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上供不應(yīng)求。然而，關(guān)于刺梨葉茶研究的報(bào)道很少，因此，本實(shí)驗(yàn)以刺梨鮮葉為原料，研究不同加工工藝對(duì)刺梨葉茶的品質(zhì)、主要營養(yǎng)成分和抗氧化活性的影響，對(duì)將來在保健飲料、營養(yǎng)食品和化妝品行業(yè)中使用刺梨葉開發(fā)功能性產(chǎn)品具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

2019 年6 月15 日，在貴州省貴陽市龍里縣的“刺梨溝”種植基地采摘刺梨的新芽。它們由1 芽、1 芽1葉、1 芽2 葉和少量的1 芽3 葉組成。所用標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸（CAS號(hào)：149-91-7）、野薔薇苷（CAS號(hào)：88515-58-6）、胡蘿卜苷（CAS號(hào)：474-58-8）、蘆?。–AS號(hào)：153-18-4）及試劑1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司（中國上海），所有標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 方法

將刺梨鮮葉均勻地?cái)偡旁谥裣希捎? 種制茶加工工藝對(duì)刺梨鮮葉進(jìn)行加工，它們的投葉量都是10 kg，具體方法如下：

刺梨葉綠茶加工分為:1）微波殺青（中國格蘭仕集團(tuán)有限公司微波爐型號(hào)：WP700P21）：殺青1 min、揉捻20 min、干燥60 ℃12 h；2）滾筒殺青（浙江上洋機(jī)械有限公司型號(hào)：6CST-40）：滾筒溫度360℃，殺青45 s、揉捻15 min、干燥60 ℃12 h；3）蒸汽殺青（蘇泊爾不銹鋼蒸鍋）：殺青2.5 min、揉捻15 min、干燥60 ℃12 h。

刺梨葉紅茶加工：萎凋15 h、揉捻15 min、發(fā)酵3.5h，將發(fā)酵后的葉子（約1 cm 厚）鋪在干燥機(jī)（浙江綠峰機(jī)械有限公司，瞿州，6CZG-60）的干燥盤上，最后將發(fā)酵后的葉子用80 ℃的干燥方法處理，以得到每100 g葉子中約含5 g 水分的紅茶[9]。

刺梨葉白茶加工：采摘鮮葉用竹匾及時(shí)攤放，厚度均勻，不可翻動(dòng)。攤青后，選用室內(nèi)（24±2℃）自然萎凋,當(dāng)茶葉達(dá)七、八成干時(shí)，室內(nèi)自然萎凋刺梨葉進(jìn)行并篩。初烘烘干機(jī)溫度100～120 ℃，10 min；攤涼15 min，復(fù)烘溫度80～90 ℃；低溫長烘70 ℃左右。茶葉干茶含水分控制在5%以內(nèi)，放入冰庫，溫度1～5 ℃。

重復(fù)測(cè)試3 次。將一部分茶葉樣品保存下來，將另一部分研磨并通過孔徑為0.425 mm 的篩子進(jìn)行篩分，進(jìn)行物理化學(xué)分析。

1.3 感官評(píng)審和主要成分分析

1.3.1 感官評(píng)審 由貴州大學(xué)茶學(xué)院的5 位評(píng)茶員（2 男，3 女）對(duì)不同的刺梨葉茶的外形、湯色、香氣、滋味和葉底5 項(xiàng)因子進(jìn)行評(píng)價(jià)并打分。計(jì)算公式為：感官得分=外形（25%）+湯色（10%）+香氣（25%）+滋味（30%）＋葉底（10%）[10]。茶樣品用隨機(jī)數(shù)盲編碼，將干茶放入專門的白板中以評(píng)估干茶的外形等，用新鮮煮沸的純凈水分別向標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)審?fù)胫凶⑷胨崛〔铇悠罚? g）5 min。小組成員被要求聞及品茶水等，并在樣品之間暫停30s[11]。紅茶、綠茶和白茶的感官特性的定義和等級(jí)參考國家標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.3.2 抗壞血酸含量的測(cè)定 稱量100 g代表性樣品的可食用部分，放入組織搗碎器中，加入100 mL提取劑，然后迅速搗碎成勻漿，稱量10～40 g 漿液樣品，將樣品轉(zhuǎn)移到帶有萃取劑的100 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻并過濾，按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 6185-6186-2016）[13]測(cè)定。

1.3.3 氨基酸含量的測(cè)定 稱取10 g 過篩（100 目）粉末，吸取1 mL 樣品提取物和1 mL L-1谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到10 mL試管中，然后分別加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）和2%0.5 mL L-1的茚三酮溶液，將試管在沸水浴中放置10 min，然后立即在冰浴中冷卻至室溫，定容至25 mL，放置10 min，用分光光度計(jì)在570 nm 下測(cè)量樣品的吸光度，以試劑空白溶液做參照，用標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算方式參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 8314-2013）[14]。

1.3.4 總黃酮含量測(cè)定 精密稱取4 g 干茶過篩（100目）粉末，置于150 mL 具塞錐形瓶，加適量甲醇溶液提取，每次提取30 min，共2次，濾過，濾液置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，通過微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 20574-2006）[15]。

1.3.5 高效液相色譜檢測(cè) 刺梨葉茶中蘆丁、野薔薇苷、沒食子酸及胡蘿卜苷的含量。

（1）樣品提取方案：

（a）取樣品約0.5 g，加入色譜級(jí)甲醇2.5 mL，渦旋震蕩1 min。

（b）4 ℃，水浴超聲30 min，4 ℃，10 000 g 離心1 min，取上清液。

（c）沉淀再次加入色譜級(jí)甲醇2.5 mL，重新提取1 次。

（d）4 ℃，10 000 g 離心1 min，取上清液，合并兩次上清液。

（2）HPLC-MS/MS 方法

液相條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C8 反相色譜柱（2.1150,3.5m）。

柱溫：35 ℃。

流動(dòng)相：A：0.1%甲酸；B：乙腈。

流速：0.3 mL min-1。

表1 液相梯度參數(shù)Table 1 Gradient Parameters of HPLC

儀器所測(cè)得濃度為最終提取液的濃度，經(jīng)計(jì)算獲得原樣品中物質(zhì)含量，計(jì)算方法如下：

物質(zhì)含量（ng g-1）=檢測(cè)濃度（ng mL-1）稀釋體積（mL）/稱取質(zhì)量（g）

其中稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時(shí)所用的溶液體積，稱取質(zhì)量為提取時(shí)的取樣質(zhì)量。檢測(cè)濃度由待測(cè)物質(zhì)峰面積代入標(biāo)曲方程，由儀器自動(dòng)求得。

1.4 自由基活性清除

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由獨(dú)立的3 次重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算得出，標(biāo)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單向方差分析（ANOVA）分析結(jié)果。Fisher 最小顯著差異（LSD）檢驗(yàn)用于評(píng)估均值差異，P ＜0.05 被認(rèn)為是顯著的。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS，美國伊利諾伊州芝加哥市）進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同加工方法對(duì)刺梨葉茶感官品質(zhì)的影響

對(duì)不同的加工工藝的刺梨葉茶進(jìn)行了感官審評(píng)，結(jié)果表明，制成的刺梨葉茶的感官品質(zhì)，不同的加工方式存在較大差異，見表1。刺梨葉制成的紅茶總評(píng)分最高，顏色紅明亮，有花果香氣，沖泡的茶湯滋味醇厚鮮爽，綜合品質(zhì)分析，刺梨幼嫩鮮葉可用于制作高品質(zhì)的紅茶。微波殺青刺梨葉綠茶顏色嫩綠明亮，但沖泡茶湯的香氣稍顯不足；綠茶蒸汽殺青和綠茶滾筒殺青茶葉湯色深黃色或黃綠欠亮，香氣不足。刺梨白茶顏色尚綠明亮，湯色欠明亮，香氣清香，滋味鮮爽，葉底軟嫩欠明亮，勻整。結(jié)果分析可知，刺梨鮮葉適合制紅茶，其次是微波殺青綠茶。

圖1 刺梨葉茶樣品Fig.1leaves tea sample

表1 不同加工方法刺梨葉茶樣品的感官質(zhì)量得分Table 1 Sensory quality scores ofleaves tea samples with different processing methods

表1 不同加工方法刺梨葉茶樣品的感官質(zhì)量得分Table 1 Sensory quality scores ofleaves tea samples with different processing methods

注：括號(hào)里的數(shù)值表示該項(xiàng)評(píng)分占總分的比例，同一列中‘*’表示差異達(dá)到顯著水平（P ＜0.05）。Note:The value in brackets indicates the proportion of the score in the tatal score,‘*’in the same column means the difference has reached a significant level(P ＜0.05).

序號(hào)Code葉底（10%）Leaf bottom 總分Total score評(píng)語 得分Comments score外形（25%）Appearance香氣（25%）Aroma湯色（10%）Liquor color滋味（30%）Taste評(píng)語 得分Comments score評(píng)語 得分Comments score評(píng)語 得分Comments score評(píng)語 得分Comments score刺梨葉綠茶微波殺青Rosa roxbunghii leaves green tea microwave wrap刺梨葉綠茶滾筒殺青Rosa roxbunghii leaves green tea tumbler wrap刺梨葉綠茶蒸汽殺青Rosa roxbunghii leaves green tea steam wrap刺梨葉紅茶Rosa roxbunghii leaves black tea嫩綠90±0.5 Verdant嫩綠87±1.5 Verdant嫩綠85±1.9 Verdant烏黑油潤，緊結(jié)93±1.2*Jet black oily,tight knot尚高爽89±1.2 Still Fresh清香88±0.6 Fragrant清香82±1.5 Fragrant嫩香85±1.3 Tender fragrance綠明亮88±1.8 Bright green綠明亮84±1.3 Bright green綠明亮83±3.1 Bright green紅明亮90±2.7 Bright red鮮醇88±0.6 Fresh alcohol清爽88±0.17 Refreshing清爽86±1.8 Refreshing鮮醇91±0.3*Fresh alcohol勻齊86±0.6 Evenly 88±0.94勻齊86±0.12 Evenly 86.6±0.74勻齊87±2.0 Evenly 84.6±2.06細(xì)嫩92±0.7*Tender 90.2±1.24刺梨葉白茶Rosa roxbunghii leaves white tea尚勻整83±0.9 Still neat清香83±0.8 Fragrant尚綠黃85±2.5 Still green yellow醇厚87±2.4 Mellow尚灰綠明亮84±0.9 Grayish green and bright 84.4±1.5

2.2 不同的加工方法對(duì)刺梨葉茶中抗壞血酸、氨基酸和黃酮含量的影響

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺梨葉綠茶和刺梨葉紅茶的維生素C 含量低于刺梨葉白茶，可能是因?yàn)榫G茶殺青高溫和紅茶發(fā)酵過程中維生素C 降解速度比白茶快（圖2 A）；刺梨葉茶中不同加工方式氨基酸的含量，刺梨葉微波殺青綠茶含量最高28.8 mg/g，其次是白茶25.9 mg/g（圖2 B）。刺梨葉中含有生物活性物質(zhì)黃酮類化合物的含量，白茶＞紅茶＞蒸汽殺青綠茶（圖2 C）。

圖2 不同刺梨葉茶中抗壞血酸、氨基酸和黃酮的含量Fig.2 The contents of ascorbic acid,amino acids and flavonoids in different Rosa roxbimghi leaves tea

2.3 不同的加工方法對(duì)刺梨葉茶中野薔薇苷、沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁含量的影響

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS/MS 對(duì)刺梨葉茶中野薔薇苷、沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3，野薔薇苷含量在刺梨葉綠茶和刺梨葉白茶中比刺梨葉紅茶中高，差異極顯著，綠茶中野薔薇苷含量是紅茶的3.8倍，白茶是紅茶的3.2 倍（圖3A）；沒食子酸在紅茶中含量是54758.09ng/g，在微波殺青綠茶中是15 484.1 ng/g，在白茶中是31 045.49 ng/g（圖3 B）；胡蘿卜苷在紅茶中含量是1 104.04 ng/g，在微波殺青綠茶中是244.32 ng/g，在白茶中是804.81 ng/g（圖3 C）；蘆丁含量在紅茶中是650.3ng/g，在微波殺青綠茶中是408.38 ng/g，在白茶中是506.11 ng/g（圖3 D），分析結(jié)果可知，不同的處理方式對(duì)刺梨葉茶中化學(xué)成分含量具有一定的影響，但是化學(xué)成分在刺梨葉紅茶中的含量比刺梨葉綠茶中的含量穩(wěn)定。

圖3 不同刺梨葉茶中野薔薇苷、沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁的含量Fig.3 The content of rosamultin,gallic acid,carotin and rutin in different leaves tea

2.4 不同的加工方法對(duì)清除DPPH自由基能力的測(cè)定

分別提取刺梨葉茶中的黃酮和維生素C，黃酮和維生素C 對(duì)DPPH 均具有一定的清除能力，但是刺梨葉茶總黃酮的DPPH 清除能力小于維生素C。不同加工方式刺梨葉茶中黃酮的DPPH 清除率：紅茶（76.16%）＞微波殺青綠茶（75.86%）＞白茶（75.57%）＞蒸汽殺青綠茶（71.67%）＞滾筒殺青綠茶（71.58%）；不同加工方式刺梨葉茶中維生素C 的DPPH 清除率：紅茶（91.16%）＞微波殺青綠茶（90.19%）＞白茶（89.90%）＞蒸汽殺青綠茶（81.67%）＞滾筒殺青綠茶（81.58%）。研究表明黃酮具有較好的抗氧化性[18,19]，刺梨葉茶中的黃酮也有一定的抗氧化活性。

圖4 不同加工方式刺梨茶中的黃酮和維生素C 對(duì)清除DPPH自由基能力的測(cè)定Fig.4 Determination of the ability of flavonoids and Vc in different processing methods to scavenge DPPH free radicals

3 討論

刺梨是貴州特有植物資源，其對(duì)提高免疫功能、延緩衰老、抗氧化和降血脂等方面有明顯作用。本實(shí)驗(yàn)首次以刺梨鮮葉為原料，通過不同的加工方式加工成綠茶、紅茶和白茶，并對(duì)這些茶進(jìn)行感官評(píng)審及綜合評(píng)分，結(jié)果表明，刺梨鮮葉適制紅茶（顏色紅明亮，有花果香，沖泡的茶湯滋味醇厚鮮爽）。刺梨被稱為“維C 之王”，特別是刺梨富含的超氧化物歧化酶（簡(jiǎn)稱SOD），是具有抗衰、防癌作用的活性物質(zhì)；此外還具有抗病毒、抗輻射的作用，在心血管、消化系統(tǒng)和各種腫瘤疾病防治方面，應(yīng)用十分廣泛。結(jié)果可知刺梨葉綠茶和刺梨葉紅茶維C 含量低于刺梨葉白茶，可能是綠茶高溫殺青和紅茶發(fā)酵過程中維生素C 降解。氨基酸是刺梨葉茶中最重要的化學(xué)成分之一，是新鮮，輕快的口感的主要成分之一，是形成香氣的基礎(chǔ)[11]，刺梨葉茶中不同加工方式氨基酸的含量，刺梨葉綠茶微波殺青含量最高28.8 mg/g，其次是白茶25.9 mg/g。刺梨中含有生物活性物質(zhì)黃酮類化合物，具有消炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、影響血壓、保護(hù)心血管、清除自由基和抗腫瘤等重要生物活性[20]。刺梨葉白茶黃酮類含量最高，但DPPH 清除能力低于刺梨葉紅茶，可能是在測(cè)定黃酮過程中出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)誤差或者是紅茶中還有其他物質(zhì)也參與了自由基清除。野薔薇苷是發(fā)揮抗缺氧作用的主要活性成分[21,22]，具有肝保護(hù)作用[23]，此外野薔薇苷還具有抗HIV、抗氧化應(yīng)激等作用[24-26]，結(jié)果顯示，不同的制茶工藝對(duì)野薔薇苷含量具有一定的影響，在綠茶中野薔薇苷含量最高，其次是白茶和紅茶。同時(shí)，對(duì)刺梨葉茶中沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3 種物質(zhì)在紅茶中含量最高且差異顯著，其次是白茶和綠茶，差異不顯著，紅茶發(fā)酵很大程度上取決于葉內(nèi)氧化酶活性的強(qiáng)弱[27]，使葉內(nèi)化學(xué)成分發(fā)生了變化。綜合茶葉感官審評(píng)結(jié)果和茶葉主要品質(zhì)成分分析，刺梨鮮葉適制紅茶。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同刺梨葉茶的黃酮進(jìn)行了DPPH 清除能力測(cè)定，并以維生素C 為對(duì)照，初步評(píng)價(jià)了其抗氧化活性：紅茶（76.16%）＞綠茶微波殺青（75.86%）＞白茶（75.57%）＞綠茶蒸汽茶青（71.67%）＞綠茶滾筒殺青（71.58%），也為今后深入對(duì)其降糖、降脂和降壓等藥理研究提供了基礎(chǔ)[28]，為貴州特有野生資源刺梨葉茶的研究與開發(fā)提供了一定的科學(xué)參考依據(jù)。