劉文東，曹國璠，李金玲，趙 致，王禮科，汪佳維，張猛

（1.貴州大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點（工程）實驗室，貴州 貴陽 550025）

2020 版《中華人民共和國藥典》中收錄的白術為菊科植物白術（Atraactylodes macrocephala kiodz.）的干燥根莖[1]。白術有效成分主要為揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類和其他成分，多用于抗腫瘤、抗炎、胃腸調(diào)節(jié)功能和抗抑郁等[2,3]。白術主要分布在我國安徽、浙江、湖南和江西等省份[4]。作為大宗藥材之一的白術，需求量較大，具有很大的經(jīng)濟價值。

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎，作為地球上最大的C 固定生物化學物理過程，也受到很多因素的影響，除受自身葉綠素含量、葉片厚度和葉片成熟程度影響外，更受光照強度、氣溫、空氣濕度和土壤等因子左右[5,6]。探究弱光條件下的表觀量子效率可以描述光合機構功能運轉狀態(tài)是否正常，測定光合作用飽和點范圍可了解植物在飽和光下的光合能力[7]。CO2 作為光合作用的一種基本原料，也是影響光合速率的重要因子，測定光合作用的CO2 響應曲線更是探究植物光合作用的基礎。由于不同植物甚至不同部位有不同的光適應特性，研究植物對光的響應有助于探究其光合作用產(chǎn)物積累與環(huán)境的關系[8]。當前研究多集中于白術連作和脅迫條件下的光合作用探究，但鮮有人探究常規(guī)種植下白術光合作用特性[9-11]。本文通過人工控制溫度、CO2 濃度和光照強度等條件測定不同年限白術不同部位葉綠素含量、光響應參數(shù)和CO2 響應參數(shù)，應用直角雙曲線模型擬合曲線，進一步分析白術不同部位光合作用效率和光合作用能力，闡明白術不同部位葉片光合作用差異，為提高白術藥材產(chǎn)量闡明生理機理，也為探究白術光合作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料來源

試驗種植白術的種子和白術種術栽（1 年生白術地下塊莖）選購于安徽省亳州市銳航中藥材種苗銷售公司。種栽與種子分別于2019 年12 月30 日和2020年4 月1 日種植于貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學教學實驗基地（東經(jīng)106°67'～106°67'，北緯26°11'～26°40'），該地平均海拔1 095 m，年平均氣溫14.9 ℃，無霜期246 d，年降雨量1 178.3 mm。白術生長期間統(tǒng)一采用中藥材生產(chǎn)標準進行田間管理。

對1 年生、2 年生白術的上部、中部和下部功能葉片（部位選擇見圖1）進行光合作用測定，選擇長勢較為一致的5 株進行重復測定，每個部位都選擇健康且完全展開葉進行測定。

圖1 白術不同部位葉片的劃分Fig.1 Blade division of different parts of Atiactylodes

1.2 數(shù)據(jù)測定

采用便攜式光合儀（LI-6400XT，LI-COR Inc，USA）在2020 年7 月20 日至7 月26 日的9：00～11：00 對白術進行光響應曲線和CO2 響應曲線的測定。測量光響應曲線時，控制葉室溫度為25℃、流速500mol s-1、CO2采用CO2 Mixer注入系統(tǒng)（濃度控制400mol mol-1）、PAR 強度梯度設置為1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、100、50 和0mol m-2s-1。測定CO2 響應曲線時，葉室溫度控制為25℃、流速為500mol s-1、PAR為1 000mol m-2s-1、CO2 采用CO2 Mixer 注入系統(tǒng)且濃度梯度控制為400、300、200、100、50、400、600、800、1 000、1 200 和1 500mol mol-1，葉片適應時間為3～5 min，設定好參數(shù)后由LI-6400XT 內(nèi)置自動測量程序完成光響應曲線和CO2 響應曲線。

使用便攜式光合儀于2020 年7 月20 日至7 月26 日9：00～11：00 對不同年限白術上部、中部和下部進行凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Cond）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和葉片蒸騰速率（Tr）測定。測量時，控制葉室溫度為25 ℃、流速500mol s-1、CO2 采用CO2 Mixer 注入系統(tǒng)（濃度控制400mol mol-1）、PAR 強度為1 000mol m2s-1。

將上部、中部和下部對應測定葉片帶回貴州省藥用植物繁育與種植（工程）實驗室進行葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b、類胡蘿卜素和葉綠素總量的測定。稱取0.1 g 不同部位白術葉片（無葉脈），剪成小塊，用3mL 95%乙醇研磨成勻漿，轉移至10 mL離心管（95%乙醇洗滌用量2 mL），暗處理靜置提取12 h，3 000 r/min離心10 min，定容至10 mL，上機測定470、649、665 nm3 個波長處的最大吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用光合作用對光響應的直角雙曲線模型[12]擬合光響應曲線，得出最大凈光合速率（maximal photosynthetic rate,Pn-max）、初始量子效率（initial quantum efficiency,）、飽和光強（saturation light intensity,Isat）、光補償點（light compensation point, Ic）和暗呼吸速率（dark respiration rate, Rd）等參數(shù)。CO2 對光響應的直角雙曲線模型[13]擬合CO2 響應曲線，得出植株光合能力（photosynthetic capacity, Pmax）、羧化速率（carboxylation efficiency,EC）、飽和CO2 濃度（saturation CO2 concentration，Cisat）、光呼吸速率（photorespiration, Rp）和CO2 補償點（CO2 compensation point）等參數(shù)。利用SPSS 26.0 進行模型擬合和參數(shù)之間的差異對比，采用LSD 法進行多重比較。利用Excel 2010 和Power Point2010 進行相關圖表繪制。

2 結果

2.1 白術不同部位葉綠素含量差異

白術不同部位葉綠素含量差異，見表1。

表1 白術葉片葉綠素含量差異Table 1 The content of chlorophyll in leaves of Atiactylodes

表1 數(shù)據(jù)顯示，白術不同部位葉片葉綠素含量差異較小。1 年生白術不同部位葉片葉綠素a 含量和葉綠素總量存在差異，表現(xiàn)為中上部葉片中的葉綠素a和葉綠素總量顯著高于（P ＜0.05）下部葉片，而葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素a/b 值各個部位葉片之間的含量沒有顯著差異；2 年生白術不同部位葉片葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總量的值不存在顯著差異，而類胡蘿卜素含量在不同部位之間差異較大，表現(xiàn)為上部＞中部＞下部；1 年生與2 年生對比可以發(fā)現(xiàn)，除類胡蘿卜素外，2 年生白術的其他葉綠素相關指標都遠大于1 年生。

2.2 白術不同部位葉片凈光合速率差異

白術不同部位葉片凈光合速率差異，見表2.

表2 白術葉片Pn、Ci、Cond 和Tr 的差異Table 2 Differences of Pn,Ci,Cond and Trmmol in leaves of Atiactylodes

2.3 白術不同部位葉片光合參數(shù)的差異

圖2 1 年生、2 年生白術不同部位葉片光合作用對光的響應曲線擬合。a：1 年生上部葉片，b：1 年生中部葉片，c：1 年生下部葉片；d：2 年生上部葉片，e：2 年生中部葉片，f：2 年生下部葉片F(xiàn)ig.2 Light response curve fitting of photosynthesis in different parts of annual and biennial atractyloides.a:upper leaves of anaual,b:middle leaves of annual,c:lower leaves of annual；d:Upper leaves of biennial,e:middle leaves of biennial,f:lower leaves of biennial

圖3 1 年生、2 年生白術不同部位葉片光合作用對CO2 的響應曲線擬合。A：1 年生上部，B：1 年生中部，C：1 年生下部；D：2 年生上部，E：2 年生中部，F(xiàn)：2 年生下部Flg.3 Light response curve fitting of photosynthesis in different parts of annual and biennial atractyloids.A:Upper leaves of annual,B:middle leaves of annual,C:lower leaves of annual；D:Upper leaves of biennial,E:middle leaves of biennial,F:lower leaves of biennial

從圖2 和圖3 曲線擬合情況可知，直角雙曲線模型可以很好地擬合白術光合作用對光的響應曲線和CO2 對光的響應曲線。1 年生白術的擬合曲線擬合度為R2a=0.996，R2b=0.993，R2c=0.998，R2d=0.998，R2e=0.999，R2f=0.998；2 年生白術的為R2A=0.990，R2B=0.987，R2C=0.985，R2D=0.993，R2E=0.987，R2F=0.987。從圖中可知不管是擬合值還是測量值，Pn都隨著光強和CO2濃度的增加而增大，當光強達到1 000mol m-2s-1和CO2 濃度為800mol mol-1之后增加幅度變小且逐漸下降。曲線無法精確擬合凈光合速率隨著光強或飽和二氧化碳濃度增加至飽和之后的點。

表3 白術葉片光響應參數(shù)差異Table 3 Differences in light response parameters of Atractylodes leaves

由于直角雙曲線無法直接擬合出植物的最大凈光合速率和飽和光強，需要通過再次線性擬合光強小于等于200mol m-2s-1時的線性方程（a 為≤200mol m-2s-1擬合直線斜率）算出。通過兩次擬合后得出表3 數(shù)據(jù)，分析可知1 年生白術不同部位葉片各光響應參數(shù)存在差異。表現(xiàn)為各部位光補償點（Ic）沒有顯著差異，但下部葉片卻略高于中上部，2 年生白術與1 年生的一致，說明下部葉片衰老且對光利用能力下降；葉片的Pn-max為上部＞中部＞下部，分別為21.27、16.8 和11.39mo（l CO2）m-2s-1；各個部位葉片的暗呼吸速率（Rd）和表觀量子效率（）并沒有太大差異，說明1 年生白術對低光強的利用率，各個部位的葉片并沒有顯著差異；而上部葉片的光飽和點（Isat）顯著高于中下部，為680.89mol m-2s-1。2 年生白術葉片的Ic、Rd 和Isat 之間沒有顯著差異；而Pn-max 卻表現(xiàn)為上部＞中部＞下部，最大值為21.57mol（CO2）m-2s-1。

表4 白術葉片CO2 響應參數(shù)差異Table 4 Differences of CO2 response parameters in Atractylodes leaves

采用同樣的方法對白術葉片CO2 對光的響應曲線進行擬合，進行兩次擬合后計算得到表4 參數(shù)（線性方程為Pmax=K*Cisat-Rp，K為CO2 濃度≤200mol mol-1時擬合直線斜率）。分析參數(shù)可知不同年限白術不同部位葉片CO2 擬合參數(shù)值存在差異。1 年生白術的CO2補償點各部位葉片不存在顯著差異，但隨葉位下降而升高；上部葉片的光合作用能力（Pmax）遠高于中下部葉片，為67.71mol(CO2) m-2s-1，上部相對于下部高出49.60%；而羧化速率（EC）、光呼吸速率（Rp）和CO2飽和點濃度（Cisat）在不同部位葉片之間沒有顯著差異，說明旺盛生長期的白術中上部葉片是其光合作用的主要部位，下部逐漸衰退。同樣2 年生白術不同部位葉片的EC 和Rp 也沒有顯著差異，CO2 補償點和1 年生趨勢不同，但相同部位較1 年生補償點濃度高；而Pmax 和Cisat 卻隨著葉位的下降而降低，最為顯著的是Pmax，分別為上部[72.02mo（l CO2）m-2s-1]＞中部[45.00mol (CO2) m-2s-1]＞下部[28.75mol（CO2）m-2s-1]；上部葉片Cisat 顯著高于中下部葉片，為1 157.02mol mol-1，說明2 年生白術上部葉片的活力更強，進行光合作用和對CO2 的固定能力也更強，其原因是出蕾后期的白術花蕾具有更強的庫強。

3 討論

植物生理生長和生殖生長以及光合作用產(chǎn)物積累與分配都深受光合作用的影響。由于不同植物甚至不同葉位具有不一致的光合作用特性，因此探究植物光合作用一直是植物生理生態(tài)學的研究熱點。但是植物光合作用不僅受到自身因素的影響，更受到外界環(huán)境因素的影響，導致了光合反應的復雜性[14-17]，探究光合作用對光和CO2 的響應一直是了解植物光合作用特性的基礎手段之一。為了了解白術光合作用特性，本文對不同年限白術的不同部位的葉片進行了光合作用相關生理指標測定，發(fā)現(xiàn)白術上部葉片具有更高的葉綠素含量，這與陳良秋等[18]人的研究相似，因為同一時期不同葉位的葉片發(fā)育程度不一致，下部和中部葉片較上部具有更高的成熟度，成熟度越高導致葉綠素合成代謝緩慢[19]，所以在葉片葉綠素含量上呈現(xiàn)出上部＞中部＞下部的趨勢。

通過控制光強、溫度和CO2 濃度等參數(shù)測定不同年限白術不同部的位葉片光合速率發(fā)現(xiàn)，中上部葉片的Pn、Cond、Ci、Tr 與葉綠素含量都顯著高于下部，這與切花菊和馬鈴薯不同葉位光合參數(shù)有相似之處，但不同于黃瓜[20-22]，這是由于植物凈光合速率受葉位高低的影響，不同葉位的葉片葉綠素含量、葉綠體超微結構、基粒數(shù)目和片層等隨葉位的上升而增加，光合強度也高于其他葉片[23]。采用直角雙曲線模型擬合發(fā)現(xiàn)，白術葉片光飽和點在680mol m-2s-1左右且隨葉位下降，二氧化碳飽和點在1 200mol mol-1左右且隨葉位下降。葉位不同導致葉片成熟度和衰老速度等不一致，相應的葉綠素含量隨葉位下降而降低，光合作用能力也隨之下降；葉片衰老導致葉片氣孔導度、葉片含水量和二氧化碳擴散速率等參數(shù)下降，所以白術下部葉片光合作用能力下降主要由氣孔因素引起的[24-26]。

此外通過對擬合后的參數(shù)分析，得到不同年限白術不同部位葉片的光補償點、表觀量子效率、飽和光強、羧化速率補償點和飽和點等指標，由于白術發(fā)育階段和葉位不同等原因導致差異不一致，呈現(xiàn)上部＞中部＞下部趨勢，這是因為中上部葉片屬于白術的功能葉片，能夠進行正常的光合作用；雖然中部葉片可能開始衰老，但不明顯；而下部葉片已經(jīng)開始衰老，導致其各光合參數(shù)較低，且葉片衰老進一步導致氣孔導度下降，葉片含水量減少，CO2 擴散阻力增大[27-29]。另外從擬合參數(shù)可以看出，補償點偏高而飽和點偏低，這是由于該模型無法擬合Pn 隨光強或CO2 濃度增加而逐漸下降的階段，導致出現(xiàn)擬合飽和點較實際飽和點偏低，擬合補償點較實際補償點偏高，而且默認光強或CO2 濃度≤200mol mol-1時Pn 呈線性增加，相關學者已經(jīng)證明[30]，所以本文在進行凈光合測定時選擇飽和光強為1 000mol m-2s-1。

綜上所述，光合作用是白術生長發(fā)育的基礎，但白術不同葉位葉片的光合作用大小存在差異。在探究白術光合作用生理時發(fā)現(xiàn)白術中上部葉片光合作用更強，是白術干物質生產(chǎn)的主要部位。