李 霞，張 珂，閔 楠

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830011)

經(jīng)相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)作用后，巨噬細(xì)胞源性外泌體可以有效產(chǎn)生抑制功效，但其所存在著作用機(jī)制尚不明確。經(jīng)另一項(xiàng)調(diào)查觀察到，在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)對(duì)miRNA-7進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可以有效對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體以及受體下游信號(hào)通路的表達(dá)水平進(jìn)行抑制，并可以對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移與侵襲作用進(jìn)行抑制[1-12]。所以，本研究旨在探究經(jīng)TWEAK作用后是否借助于對(duì)巨噬細(xì)胞與其外泌體內(nèi)miRNA-7表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，抑制EOC細(xì)胞遷徙與遷移作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 實(shí)驗(yàn)中所使用的人單核細(xì)胞株THP-1購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院中細(xì)胞庫(kù)內(nèi)，使用市級(jí)內(nèi)婦科腫瘤重點(diǎn)研究室長(zhǎng)期保存著的人上皮性卵巢癌細(xì)胞株HO8910-PM。RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清來(lái)自于Hyclone公司；重組人TWEAK細(xì)胞因子來(lái)自于Sigma公司；佛波酯來(lái)自于PeproTech公司；總外泌體分離試劑盒與TRIzol試劑來(lái)自于Invitrogen公司；TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自于Applied Biosystems公司；U6的特殊性探針與miRNA-7來(lái)自于Applied Biosystems公司。Transwell小室屬于Corning公司，此類型號(hào)為3422；0.22 μm濾器具來(lái)自于Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠來(lái)自于BD公司)；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中主要使用CST公司的的蛋白檢測(cè)抗體。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人單核細(xì)胞THP-1與人上皮性卵巢癌細(xì)胞HO8910-PM培養(yǎng)在包含有純度10%的胎牛血清的0% RPIM-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃ 5%CO2條件下經(jīng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)間進(jìn)行傳代。細(xì)胞通過(guò)1 500×g離心2 min后傳代或是換液。THP-1細(xì)胞注意保持形態(tài)相同、透亮、圓形的懸浮狀況有所發(fā)生。

1.2.2對(duì)誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞作用 懸浮著的THP-1細(xì)胞根據(jù)5×105個(gè)/mL的密度在10 cm的培養(yǎng)皿當(dāng)中進(jìn)行接種，與此同時(shí)添加100 ng/mL的佛波酯進(jìn)行誘導(dǎo)24 h。

1.2.3經(jīng)TWEAK作用對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激 所懸浮著的THP-1細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定的誘導(dǎo)過(guò)程使得細(xì)胞變?yōu)樗N壁著的巨噬細(xì)胞后，使用PBS洗2次，并將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為不含有血清的RPIM-1640培養(yǎng)基，200 ng/mL的對(duì)其進(jìn)行添加TWEAK并持續(xù)刺激24 h。對(duì)照組添加同等體積量的PBS，其他的處理形式與上述幾近相似。

1.2.4細(xì)胞上清液中外泌體的分離 選擇400×g取細(xì)胞上清液進(jìn)行離心處理15 min，選擇上清。選擇5 000×g，在溫度為4 ℃下離心處理15 min，選擇0.22 μm濾器進(jìn)行過(guò)濾。按照2∶1的比例將上清與抽提試劑混合添加至外泌體抽提試劑當(dāng)中，快速混勻并放置在4 ℃過(guò)夜，次日拿走，10 000×g，在4 ℃溫度下離心1 h，將上清抽離出來(lái)。沉淀為抽提的外泌體，使用PBS重懸處理后使用BCA手段定量蛋白。然后將其放置在-80 ℃攝氏度的冰箱進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的封存，盡可能防止反復(fù)凍融。

1.2.5Western blotting手段對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè) 去除細(xì)胞培養(yǎng)基，利用溫度為4 ℃預(yù)冷后的PBS洗2次，添加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上對(duì)其裂解30 min。使用裂解溶液以1 200×g，在溫度為4 ℃進(jìn)行離心處理10 min，去除沉淀后對(duì)裂解溶液使用BCA手段對(duì)其進(jìn)行定量。含量10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳對(duì)蛋白樣品進(jìn)行相應(yīng)的分離，最初的電壓保持在80 V，將蛋白marker進(jìn)行分開(kāi)后，將使用電壓調(diào)節(jié)至120 V，完成整個(gè)電泳實(shí)驗(yàn)。經(jīng)聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜轉(zhuǎn)膜90 min后，保持恒電流為200 mA。濃度為5%的BSA在室溫條件下?lián)u床封閉2 h，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)所表示，添加稀釋一抗并在溫度為4 ℃條件下孵育過(guò)夜，在實(shí)驗(yàn)中使用TBS-T緩沖溶液洗膜后二抗在常溫條件下進(jìn)行1 h的孵育，使用熒光掃描設(shè)備對(duì)顯影進(jìn)行掃描。

1.2.6使用Real-time PCR技術(shù)對(duì)miRNA-7的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè) 按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)內(nèi)容選取巨噬細(xì)胞與外泌體內(nèi)的RNA。使用特殊的TaqMan反轉(zhuǎn)錄探針對(duì)miRNA-7進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄可以轉(zhuǎn)錄成為cDNA，使用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系結(jié)果進(jìn)行調(diào)試，配置反應(yīng)體系中所需要的所有處理都是在冰的條件下進(jìn)行處理。反應(yīng)條件為時(shí)間30 min，溫度為16 ℃，30 min 42 ℃，5 min 85 ℃。而后按照后TaqMan miRNA Assay操作手冊(cè)所要求的操作步驟對(duì)相關(guān)試劑進(jìn)行配置并完成PCR反應(yīng)。確保反應(yīng)順利進(jìn)行，應(yīng)當(dāng)控制精準(zhǔn)的反應(yīng)條件：10 min 95 ℃，15 s 95 ℃，1 min 60 ℃，之后的兩個(gè)步驟共分為40個(gè)循環(huán)。使用U6作為內(nèi)參照，以2-△△CT值對(duì)微小RNA即miRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估，在進(jìn)行試驗(yàn)后，保證每組試驗(yàn)設(shè)定為3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 使用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基對(duì)HO8910-PM細(xì)胞進(jìn)行重懸，對(duì)細(xì)胞數(shù)密度進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。按照4×104個(gè)細(xì)胞在遷移實(shí)驗(yàn)中種于上室；在進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先使用無(wú)血清先將RPMI-1640培養(yǎng)基按照1∶6的比例對(duì)Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋，選擇容量為50 μL稀釋溶液包被置于Transwell小室的最下位置處，將8×104個(gè)細(xì)胞種于上室。在下室添加濃度為10%的750 μL胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基后，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后使用濃度為4%的多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色時(shí)間大約為30 min，使用PBS清洗3次后使用棉簽對(duì)上室殘留細(xì)胞進(jìn)行擦去，放置在倒置顯微鏡下拍照并進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)量。每個(gè)樣品隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)并在數(shù)據(jù)中選取平均數(shù)值。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)TWEAK在刺激作用前后的巨噬細(xì)胞源性外泌體進(jìn)行收集，同H08910-PM一起進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)使用real-time PCR對(duì)巨噬細(xì)胞源性外泌體、巨噬細(xì)胞以及共同培養(yǎng)后的HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Western blotting技術(shù)對(duì)共培養(yǎng)后的HO8910-PM細(xì)胞中EGFR/AKT/ERK1/2信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，觀察與比較2組巨噬細(xì)胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達(dá)水平、2組巨噬細(xì)胞源性外泌體對(duì)HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組巨噬細(xì)胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達(dá)水平比較 在TWEAK作用后，觀察組巨噬細(xì)胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組巨噬細(xì)胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of expression levels of miRNA-7 in macrophages and their exosomes in two groups

2.22組巨噬細(xì)胞源性外泌體對(duì)HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)比較 在TWEAK作用后，觀察組經(jīng)TWEAK刺激后的巨噬細(xì)胞源性外泌體對(duì)HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組巨噬細(xì)胞源性外泌體對(duì)HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7 的表達(dá)比較Table 2 Comparison of expression of miRNA-7 in HO8910-PM cells by macrophage derived exosomes in two groups

3 討 論

TWEAK蛋白最初是1997年被相關(guān)學(xué)者所發(fā)現(xiàn)，它是由249個(gè)氨基酸所組成的Ⅱ型跨膜蛋白，包含有TNF的同源結(jié)構(gòu)范圍?，F(xiàn)今探究表明，經(jīng)TWEAK作用后可直接對(duì)自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞的功效進(jìn)行調(diào)節(jié)。經(jīng)相關(guān)學(xué)者探究表明，TWEAK可以對(duì)腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用有著重要的影響，但現(xiàn)如今對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制還探究的甚少[13-15]。經(jīng)前期探究表明，在TWEAK作用下，巨噬細(xì)胞上所存在著的清液可以對(duì)人卵巢癌細(xì)胞HO8910-PM的侵襲作用進(jìn)行有效抑制。之后在TWEAK刺激作用后的從巨噬細(xì)胞上清液之中分離并提取出外泌體，觀察到其外泌體具有可以對(duì)HO8910-PM細(xì)胞侵襲和遷移的作用進(jìn)行抑制的因子。但是外泌體包含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等多類的生物活性物質(zhì)，它可以具備抑制癌癥的功效[16-17]。

本研究主要探究巨噬細(xì)胞源性外泌體在TWEAK作用后抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲與遷移的作用機(jī)制，經(jīng)研究表明，在TWEAK作用后，觀察組巨噬細(xì)胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達(dá)水平提高。在進(jìn)行不同處理后，巨噬細(xì)胞源性外泌體同HO8910-PM細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，之后對(duì)HO8910-PM細(xì)胞中的miRNA-7進(jìn)行檢測(cè)。觀察組經(jīng)TWEAK刺激后的巨噬細(xì)胞源性外泌體對(duì)HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該數(shù)據(jù)提示在TWEAK對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)中，miRNA-7可以發(fā)揮其抑制癌癥的功效。其中外泌體中的miRNA可以穩(wěn)定地保存著，通過(guò)細(xì)胞間的傳遞并調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)過(guò)程。對(duì)乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等的癌癥的探究，其中通過(guò)miRNA-7可以有效抑制貼壁于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的斑激酶并可以抑制EGFR等分子及其下游信號(hào)通路，幫助調(diào)節(jié)抑制癌癥。大概約有70%的卵巢癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)水平，所被激活的EGFR信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲、遷移等過(guò)程，并極大提高產(chǎn)生腫瘤血管的量。因此有效抑制其相關(guān)的信號(hào)通路就可以做到治療患者的卵巢癌。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在分泌過(guò)程中會(huì)分泌外泌體，調(diào)節(jié)患者HO8910-PM細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)水平，對(duì)其EGFR/AKT/ERK1/2信號(hào)通路的活化進(jìn)行抑制，并使得卵巢癌細(xì)胞的在整個(gè)侵襲和遷移階段中得到較好的抑制作用。通過(guò)作相關(guān)的對(duì)體外實(shí)驗(yàn)觀察到，有一類miRNA-7可以有效地抑制卵巢癌細(xì)胞整個(gè)遷移過(guò)程。本探究還需要開(kāi)展后期對(duì)動(dòng)物的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)?，F(xiàn)階段，已有許多有關(guān)于體內(nèi)研究的文獻(xiàn)。相關(guān)學(xué)者利用注射相關(guān)所研究的細(xì)胞液體直至小鼠腹腔內(nèi)部，對(duì)腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的CD206的表達(dá)能力進(jìn)行檢測(cè)。觀察結(jié)果為卵巢癌細(xì)胞外泌體可以對(duì)整個(gè)分化成為M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，幫助外泌體內(nèi)的miRNA-223發(fā)揮巨大作用。

綜上所述，TWEAK對(duì)癌細(xì)胞中miRNA-7的表達(dá)能力進(jìn)行上調(diào)，并抑制EGFR表達(dá)活化相關(guān)信息通路從而抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[18]。