孟濤，劉林，王海江

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的前列[1]。約有40%結(jié)直腸癌患者最終死于復發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-5]，且其發(fā)生機制仍不明確。因此，研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制具有重要的意義?；貜鸵龑О腚装彼嶝S富蛋白Kazal基元(reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK)是一個公認的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，研究顯示RECK與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[2]。MicroRNA(miRNA)是一類長度在19～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈 RNA，能通過與靶基因 miRNA 特異性的堿基互補配對,引起靶基因 miRNA 的降解或者抑制其翻譯，負調(diào)控靶基因的表達，參與和影響細胞分化、組織發(fā)育、腫瘤診斷及預后[3]；而長編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過 200個核苷酸、不編碼蛋白的RNA，在發(fā)育、分化及代謝等多方面發(fā)揮著重要作用[4]。miRNA和lncRNA都高度保守穩(wěn)定，可競爭性結(jié)合并調(diào)控靶基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因而可作為潛在標志物用于腫瘤的預測、診斷及預后的判斷[5-8]。本研究通過生物信息學方法找出結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA及l(fā)ncRNA，并選取結(jié)直腸癌變組織及其對應的癌旁觀察其表達，分析它們的相互作用及對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Trizol 購自上海生工公司，miRcute miRNA cDNA 試劑盒(KR201)、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green，F(xiàn)P411)及l(fā)nRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green) (FP402) 購自北京天根生化科技有限公司，lncGAS5過表達質(zhì)粒及含lncGAS5啟動子的CRISPR-Cas9質(zhì)粒購自吉凱基因公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher,DMEM等細胞培養(yǎng)試劑購自Gibco公司；Anti-RECK抗體(ab238162)和山羊抗兔IgG H&L (HRP，ab205718)購自Abcam，所用引物U6、RECK及 miRNA 26a購自廣州復能公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學預測 利用miRanda數(shù)據(jù)庫(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和 Starbase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測RECKmRNA-miRNA,miRNA-lncRNA的結(jié)合位點并做分析。

1.2.2構(gòu)建過表達和沉默lncGAS5的SW480細胞 在轉(zhuǎn)染的前一天，傳代準備SW480細胞，待細胞密度生長至60%～80%時即可用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將2種質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(先用不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋)混勻，加入到SW480細胞中；于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8 h后，取出轉(zhuǎn)染細胞，用2 mL新鮮的不含雙抗的完全培養(yǎng)基換掉原培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后、加入嘌呤霉素(3.0 mg/L)進行篩選。10～15 d后收取細胞提取RNA和蛋白。

1.2.3RNA、miRNA、lncRNA提取 取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌變組織及癌旁 5 cm 以上的正常黏膜組織，用Trizol提取總RNA，用試劑盒提取miRNA和lncRNA，紫外分光光度儀測定濃度及純度(OD260/OD280>1.8可用)。按照試劑盒說明書對miRNA和lncRNA進行熒光定量檢測。

1.2.4熒光定量PCR(qPCR) 吸取1.2.3中得到的RNA，加入超純水，70 ℃孵育5 min，冷卻后置于冰上，加入反轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃孵育60 min，70 ℃加熱10 min，保存于-20 ℃?；蛞镉缮虾Ｉど镉邢薰竞铣桑簂ncRNA GAS5，F(xiàn)為5-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3，R為5-TTGTGCCATGAG

ACTCCATCAG-3；GAPDH，F(xiàn)為5-ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG-3，R為5-TTTGCTTGAAGTTTCA

CTGGCATC-3；miR-221，F(xiàn)為5-AGCTAAAAAAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTCG-3，R為5-GATCCGA

AACCC AGCAGACAATGTAGCTTTTTT-3)。反應條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min，32個循環(huán)。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.5ECK蛋白表達水平 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)，將少量組織或構(gòu)建過表達和沉默lncGAS5的SW480細胞置于勻漿器中，加入蛋白質(zhì)裂解液研磨至無肉眼可見組織置于冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清，在紫外分光光度儀上測定蛋白質(zhì)濃度并置-20度保存。制膠后，加入50 ng變性蛋白溶液進行電泳及蛋白轉(zhuǎn)移，結(jié)束后加入RECK一抗和二抗進行孵育，最后進行凝膠圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 預測RECK/miRNA/lncRNA結(jié)合位點及組織標本中含量測定

利用miRanda數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示(表1)，RECKmRNA與miR-221有4個結(jié)合位點，與miR-26a有1個結(jié)合位點，推測miR-221/26a能靶向結(jié)合到RECKmRNA上對其進行調(diào)控。利用Starbase數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示lncRNA GAS5與miR-221/26a存在1個結(jié)合位點，提示它們之間存在相互作用關(guān)系。因此，利用qPCR對結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA及miR-221/26a的含量進行驗證(圖1)，結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中，miR-221/26a的表達高于其相應的癌旁組織 (P<0.001、或0.05)，lncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌中表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表1 miRanda數(shù)據(jù)庫預測RECK mRNA與miR-221/26a結(jié)合位點Tab.1 Predicted binding sites of RECK mRNA with miR-221/26a using miRanda database

表2 Starbase數(shù)據(jù)庫預測lncRNA GAS5與miR-221/26a結(jié)合位點Tab.2 Predicted binding sites of lncRNA GAS5 with miR-221/26a using Starbase database

圖1 lncRNA GAS5及miR-221/26a在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達Fig.1 The relative expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in CRC tissues and corresponding adjacent tissues

2.2 過表達lncRNA GAS5的SW480細胞中l(wèi)ncRNA GAS5及miR-221/26a表達

取穩(wěn)轉(zhuǎn)lncRNA GAS5后的SW480細胞提取RNA和蛋白，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，過表達組SW480細胞中GAS5相對含量為0.137±0.045，轉(zhuǎn)染空載組含量為 0.031±0.015，過表達組GAS5的含量是空載組的4.4倍，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。過表達組SW480細胞中的miR221相對含量為0.004±0.001，空載組為0.010±0.002，過表達組低于空載組，僅為空載組的0.4倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。過表達組SW480細胞中的miR26a相對含量為0.005 8±0.002 3，空載組為0.012±0.001，過表達組低于空載組，僅為空載組的0.48倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，過表達組細胞中的RECK蛋白表達含量低于空載組。

注:與空載組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.01。圖2 穩(wěn)轉(zhuǎn)lncRNA GAS5后SW480細胞中l(wèi)ncRNA GAS5及miR-221/26a表達Fig.2 The expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in SW480 cells overexpressing lncRNA GAS5

2.3 lncGAS5 沉默細胞株情況

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細胞后，用qPCR檢測lncGAS5、miR221及miR26a含量，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，GAS5在沉默組SW480細胞中相對含量約為0.000 5±0.000 13，而在空載組則為0.032±0.005 6，沉默組低于空載組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示成功建立lncGAS5 沉默細胞株。miR221在沉默組相對表達含量為0.078±0.021，空載組中為0.03±0.02，沉默組高于空載組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR26a在沉默組相對表達含量為0.059±0.007 3，空載組中為0.039±0.011，沉默組高于空載組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示GAS5的降低在一定程度上會上調(diào)miR221和miR26a的含量。Western blot 結(jié)果顯示，沉默GAS5時，RECK蛋白表達增加。

3 討論

我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，其發(fā)病率、死亡率在所有惡性腫瘤中均居第5位[6]。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的癌基因并揭示和預測其在結(jié)直腸癌的病程進展和轉(zhuǎn)移過程中的功能，對于結(jié)直腸癌的診治具有十分重要的理論意義和實際應用價值。

RECK是一個公認的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，其蛋白主要定位于細胞外。它富含半胱氨酸，是一類膜錨定糖蛋白，在常見細胞中通過轉(zhuǎn)錄后能調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達，阻遏腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌病人的腫瘤樣本中，RECK的表達水平和病人復發(fā)風險有關(guān)，高濃度的RECK往往預示著病人的復發(fā)風險較低。此外通過動物及細胞實驗發(fā)現(xiàn)，提升RECK的表達能抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管新生[8-9]。以上研究提示RECK與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。課題組在前期研究中探討了RECK蛋白和mRNA在原發(fā)腫瘤組、結(jié)直腸轉(zhuǎn)移灶組以及癌旁組織的表達情況，證實了RECK蛋白及mRNA水平在腫瘤組中是呈低表達的，且在轉(zhuǎn)移灶組中RECK蛋白及mRNA表達量更低。

注:(1)與空載組比較，P<0.01。圖3 沉默lncRNA GAS5的SW480細胞的qPCR及Western blot 結(jié)果Fig.3 The results of qPCR and Western blot in SW480 cells silencing lncRNA GAS5

miRNA是一類約含22個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)上的相應靶點結(jié)合，能抑制或降解特定靶基因，從而起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的作用[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-25-3p通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞相關(guān)因子表達，可以促進血管通透性和血管生成，同時大腸癌細胞的miR-25-3p外顯子可顯著誘導大腸癌的血管滲漏，促進大腸癌在肝、肺的轉(zhuǎn)移。此外，miR-25-3p的表達水平在發(fā)生轉(zhuǎn)移的大腸癌患者中明顯高于無轉(zhuǎn)移者，證明了miR-25-3p是一種促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的miRNA[12]。有學者發(fā)現(xiàn)與直腸癌相關(guān)的miRNA約有50多個，這些miRNA可通過改變Wnt通路的β-連環(huán)蛋白(βcatenin)、表皮生長因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和腫瘤抑制蛋白(TP53)等信號通路來影響大腸癌的生存、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此，miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密不可分[14-15]，而lncRNA與miRNA一樣，屬于非編碼RNA，區(qū)別是lncRNA轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸，在生物發(fā)育、分化和代謝等方面起到了重要調(diào)控作用，成為近年來的研究熱點[16-18]。不少研究顯示lncRNA和miRNA存在競爭結(jié)合參與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-21]。如Wang等[22]人在綜述中就提到40多種lncRNA/miRNA參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的情況。

本研究利用生物信息學進行預測，發(fā)現(xiàn)了多條與RECKmRNA相結(jié)合的miRNA，其中 miR-221 與之有4個結(jié)合位點，miR-26a 與之有1個結(jié)合位點，由此推測RECK表達與這2個miRNA有關(guān)系，進而對結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織中miR-221/26a進行驗證。結(jié)果顯示這2個miRNA在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達。這或許暗示了在結(jié)直腸癌中，上調(diào)的miR-221/miR-26a 通過結(jié)合RECKmRNA，抑制了RECK蛋白的表達，從而促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。同時數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果還顯示lncRNA GAS5能同時結(jié)合 miR-221、miR-26a，本研究也對結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA GAS5進行驗證，結(jié)果顯示lncRNA GAS5在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈低表達。

以上結(jié)果初步提示在結(jié)直腸癌細胞中，lncRNA GAS5表達降低，會使得 miR-221 和miR-26a 的豐度升高，從而抑制了RECKmRNA 表達，最終促進結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移?；谝陨贤茰y，本研究在SW480細胞中過表達了lncRNA GAS5，通過測定GAS5含量提示我們過表達細胞模型構(gòu)建成功且miR-221/26a含量隨著GAS5的增加而下降，RECK蛋白含量降低，提示GAS5能通過負反饋miR-221/26a含量影響RECK蛋白表達。同時，本研究還通過轉(zhuǎn)染含GAS5啟動子的CRISPR-Cas9質(zhì)粒，下調(diào)其含量，并檢測miR-221/26a變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著GAS5含量下降，miR-221/26a和RECK表達均上調(diào)。通過細胞實驗可以初步證實lncRNA GAS5表達降低，對 miR-221 和 miR-26a 的吸附作用降低，導致 miR-221 和miR-26a 的表達升高，結(jié)果提示miR-221 和 miR-26a 能與抑癌基因RECKmRNA結(jié)合，并抑制其表達，進而最終促進結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究先通過生物信息學預測出相關(guān)的lncRNA和miRNA，再通過構(gòu)建過表達和沉默細胞株驗證GAS5，miR-221/ 26a和RECK之間的關(guān)系，結(jié)果表明lncRNA GAS5和miR-221 /miR-26a與結(jié)直腸癌發(fā)展密切相關(guān)，檢測其含量變化可提前為癌細胞是否轉(zhuǎn)移做出預測。