孟濤，劉林，王海江

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的前列[1]。約有40%結(jié)直腸癌患者最終死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-5]，且其發(fā)生機(jī)制仍不明確。因此，研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義。回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元(reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK)是一個(gè)公認(rèn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，研究顯示RECK與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[2]。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度在19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈 RNA，能通過與靶基因 miRNA 特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì),引起靶基因 miRNA 的降解或者抑制其翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與和影響細(xì)胞分化、組織發(fā)育、腫瘤診斷及預(yù)后[3]；而長(zhǎng)編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過 200個(gè)核苷酸、不編碼蛋白的RNA，在發(fā)育、分化及代謝等多方面發(fā)揮著重要作用[4]。miRNA和lncRNA都高度保守穩(wěn)定，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并調(diào)控靶基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因而可作為潛在標(biāo)志物用于腫瘤的預(yù)測(cè)、診斷及預(yù)后的判斷[5-8]。本研究通過生物信息學(xué)方法找出結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA及l(fā)ncRNA，并選取結(jié)直腸癌變組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁觀察其表達(dá)，分析它們的相互作用及對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Trizol 購(gòu)自上海生工公司，miRcute miRNA cDNA 試劑盒(KR201)、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green，F(xiàn)P411)及l(fā)nRcute lncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green) (FP402) 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，lncGAS5過表達(dá)質(zhì)粒及含lncGAS5啟動(dòng)子的CRISPR-Cas9質(zhì)粒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自Thermo Fisher,DMEM等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Gibco公司；Anti-RECK抗體(ab238162)和山羊抗兔IgG H&L (HRP，ab205718)購(gòu)自Abcam，所用引物U6、RECK及 miRNA 26a購(gòu)自廣州復(fù)能公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 利用miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)RECKmRNA-miRNA,miRNA-lncRNA的結(jié)合位點(diǎn)并做分析。

1.2.2構(gòu)建過表達(dá)和沉默lncGAS5的SW480細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染的前一天，傳代準(zhǔn)備SW480細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至60%～80%時(shí)即可用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將2種質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(先用不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋)混勻，加入到SW480細(xì)胞中；于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8 h后，取出轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用2 mL新鮮的不含雙抗的完全培養(yǎng)基換掉原培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后、加入嘌呤霉素(3.0 mg/L)進(jìn)行篩選。10～15 d后收取細(xì)胞提取RNA和蛋白。

1.2.3RNA、miRNA、lncRNA提取 取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌變組織及癌旁 5 cm 以上的正常黏膜組織，用Trizol提取總RNA，用試劑盒提取miRNA和lncRNA，紫外分光光度儀測(cè)定濃度及純度(OD260/OD280>1.8可用)。按照試劑盒說明書對(duì)miRNA和lncRNA進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。

1.2.4熒光定量PCR(qPCR) 吸取1.2.3中得到的RNA，加入超純水，70 ℃孵育5 min，冷卻后置于冰上，加入反轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃孵育60 min，70 ℃加熱10 min，保存于-20 ℃?；蛞镉缮虾Ｉど镉邢薰竞铣桑簂ncRNA GAS5，F(xiàn)為5-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3，R為5-TTGTGCCATGAG

ACTCCATCAG-3；GAPDH，F(xiàn)為5-ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG-3，R為5-TTTGCTTGAAGTTTCA

CTGGCATC-3；miR-221，F(xiàn)為5-AGCTAAAAAAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTCG-3，R為5-GATCCGA

AACCC AGCAGACAATGTAGCTTTTTT-3)。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min，32個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5ECK蛋白表達(dá)水平 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)，將少量組織或構(gòu)建過表達(dá)和沉默lncGAS5的SW480細(xì)胞置于勻漿器中，加入蛋白質(zhì)裂解液研磨至無肉眼可見組織置于冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清，在紫外分光光度儀上測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并置-20度保存。制膠后，加入50 ng變性蛋白溶液進(jìn)行電泳及蛋白轉(zhuǎn)移，結(jié)束后加入RECK一抗和二抗進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行凝膠圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)RECK/miRNA/lncRNA結(jié)合位點(diǎn)及組織標(biāo)本中含量測(cè)定

利用miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表1)，RECKmRNA與miR-221有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，與miR-26a有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)miR-221/26a能靶向結(jié)合到RECKmRNA上對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。利用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示lncRNA GAS5與miR-221/26a存在1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，提示它們之間存在相互作用關(guān)系。因此，利用qPCR對(duì)結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA及miR-221/26a的含量進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)，結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中，miR-221/26a的表達(dá)高于其相應(yīng)的癌旁組織 (P<0.001、或0.05)，lncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表1 miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)RECK mRNA與miR-221/26a結(jié)合位點(diǎn)Tab.1 Predicted binding sites of RECK mRNA with miR-221/26a using miRanda database

表2 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA GAS5與miR-221/26a結(jié)合位點(diǎn)Tab.2 Predicted binding sites of lncRNA GAS5 with miR-221/26a using Starbase database

圖1 lncRNA GAS5及miR-221/26a在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 The relative expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in CRC tissues and corresponding adjacent tissues

2.2 過表達(dá)lncRNA GAS5的SW480細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5及miR-221/26a表達(dá)

取穩(wěn)轉(zhuǎn)lncRNA GAS5后的SW480細(xì)胞提取RNA和蛋白，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，過表達(dá)組SW480細(xì)胞中GAS5相對(duì)含量為0.137±0.045，轉(zhuǎn)染空載組含量為 0.031±0.015，過表達(dá)組GAS5的含量是空載組的4.4倍，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過表達(dá)組SW480細(xì)胞中的miR221相對(duì)含量為0.004±0.001，空載組為0.010±0.002，過表達(dá)組低于空載組，僅為空載組的0.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。過表達(dá)組SW480細(xì)胞中的miR26a相對(duì)含量為0.005 8±0.002 3，空載組為0.012±0.001，過表達(dá)組低于空載組，僅為空載組的0.48倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞中的RECK蛋白表達(dá)含量低于空載組。

注:與空載組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.01。圖2 穩(wěn)轉(zhuǎn)lncRNA GAS5后SW480細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GAS5及miR-221/26a表達(dá)Fig.2 The expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in SW480 cells overexpressing lncRNA GAS5

2.3 lncGAS5 沉默細(xì)胞株情況

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞后，用qPCR檢測(cè)lncGAS5、miR221及miR26a含量，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，GAS5在沉默組SW480細(xì)胞中相對(duì)含量約為0.000 5±0.000 13，而在空載組則為0.032±0.005 6，沉默組低于空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示成功建立lncGAS5 沉默細(xì)胞株。miR221在沉默組相對(duì)表達(dá)含量為0.078±0.021，空載組中為0.03±0.02，沉默組高于空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miR26a在沉默組相對(duì)表達(dá)含量為0.059±0.007 3，空載組中為0.039±0.011，沉默組高于空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示GAS5的降低在一定程度上會(huì)上調(diào)miR221和miR26a的含量。Western blot 結(jié)果顯示，沉默GAS5時(shí)，RECK蛋白表達(dá)增加。

3 討論

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，其發(fā)病率、死亡率在所有惡性腫瘤中均居第5位[6]。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的癌基因并揭示和預(yù)測(cè)其在結(jié)直腸癌的病程進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中的功能，對(duì)于結(jié)直腸癌的診治具有十分重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

RECK是一個(gè)公認(rèn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，其蛋白主要定位于細(xì)胞外。它富含半胱氨酸，是一類膜錨定糖蛋白，在常見細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)錄后能調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，阻遏腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌病人的腫瘤樣本中，RECK的表達(dá)水平和病人復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，高濃度的RECK往往預(yù)示著病人的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低。此外通過動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提升RECK的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管新生[8-9]。以上研究提示RECK與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。課題組在前期研究中探討了RECK蛋白和mRNA在原發(fā)腫瘤組、結(jié)直腸轉(zhuǎn)移灶組以及癌旁組織的表達(dá)情況，證實(shí)了RECK蛋白及mRNA水平在腫瘤組中是呈低表達(dá)的，且在轉(zhuǎn)移灶組中RECK蛋白及mRNA表達(dá)量更低。

注:(1)與空載組比較，P<0.01。圖3 沉默lncRNA GAS5的SW480細(xì)胞的qPCR及Western blot 結(jié)果Fig.3 The results of qPCR and Western blot in SW480 cells silencing lncRNA GAS5

miRNA是一類約含22個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)上的相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合，能抑制或降解特定靶基因，從而起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的作用[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-25-3p通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)，可以促進(jìn)血管通透性和血管生成，同時(shí)大腸癌細(xì)胞的miR-25-3p外顯子可顯著誘導(dǎo)大腸癌的血管滲漏，促進(jìn)大腸癌在肝、肺的轉(zhuǎn)移。此外，miR-25-3p的表達(dá)水平在發(fā)生轉(zhuǎn)移的大腸癌患者中明顯高于無轉(zhuǎn)移者，證明了miR-25-3p是一種促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的miRNA[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)與直腸癌相關(guān)的miRNA約有50多個(gè)，這些miRNA可通過改變Wnt通路的β-連環(huán)蛋白(βcatenin)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和腫瘤抑制蛋白(TP53)等信號(hào)通路來影響大腸癌的生存、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此，miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密不可分[14-15]，而lncRNA與miRNA一樣，屬于非編碼RNA，區(qū)別是lncRNA轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸，在生物發(fā)育、分化和代謝等方面起到了重要調(diào)控作用，成為近年來的研究熱點(diǎn)[16-18]。不少研究顯示lncRNA和miRNA存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-21]。如Wang等[22]人在綜述中就提到40多種lncRNA/miRNA參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的情況。

本研究利用生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了多條與RECKmRNA相結(jié)合的miRNA，其中 miR-221 與之有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，miR-26a 與之有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，由此推測(cè)RECK表達(dá)與這2個(gè)miRNA有關(guān)系，進(jìn)而對(duì)結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織中miR-221/26a進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示這2個(gè)miRNA在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達(dá)。這或許暗示了在結(jié)直腸癌中，上調(diào)的miR-221/miR-26a 通過結(jié)合RECKmRNA，抑制了RECK蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。同時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果還顯示lncRNA GAS5能同時(shí)結(jié)合 miR-221、miR-26a，本研究也對(duì)結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA GAS5進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示lncRNA GAS5在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈低表達(dá)。

以上結(jié)果初步提示在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，lncRNA GAS5表達(dá)降低，會(huì)使得 miR-221 和miR-26a 的豐度升高，從而抑制了RECKmRNA 表達(dá)，最終促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移?；谝陨贤茰y(cè)，本研究在SW480細(xì)胞中過表達(dá)了lncRNA GAS5，通過測(cè)定GAS5含量提示我們過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功且miR-221/26a含量隨著GAS5的增加而下降，RECK蛋白含量降低，提示GAS5能通過負(fù)反饋miR-221/26a含量影響RECK蛋白表達(dá)。同時(shí)，本研究還通過轉(zhuǎn)染含GAS5啟動(dòng)子的CRISPR-Cas9質(zhì)粒，下調(diào)其含量，并檢測(cè)miR-221/26a變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著GAS5含量下降，miR-221/26a和RECK表達(dá)均上調(diào)。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以初步證實(shí)lncRNA GAS5表達(dá)降低，對(duì) miR-221 和 miR-26a 的吸附作用降低，導(dǎo)致 miR-221 和miR-26a 的表達(dá)升高，結(jié)果提示miR-221 和 miR-26a 能與抑癌基因RECKmRNA結(jié)合，并抑制其表達(dá)，進(jìn)而最終促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究先通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出相關(guān)的lncRNA和miRNA，再通過構(gòu)建過表達(dá)和沉默細(xì)胞株驗(yàn)證GAS5，miR-221/ 26a和RECK之間的關(guān)系，結(jié)果表明lncRNA GAS5和miR-221 /miR-26a與結(jié)直腸癌發(fā)展密切相關(guān)，檢測(cè)其含量變化可提前為癌細(xì)胞是否轉(zhuǎn)移做出預(yù)測(cè)。