孟濤,劉林,王海江
(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 胃腸外科,新疆 烏魯木齊 830011)
結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的前列[1]。約有40%結(jié)直腸癌患者最終死于復發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-5],且其發(fā)生機制仍不明確。因此,研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制具有重要的意義?;貜鸵龑О腚装彼嶝S富蛋白Kazal基元(reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs,RECK)是一個公認的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子,研究顯示RECK與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[2]。MicroRNA(miRNA)是一類長度在19~24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈 RNA,能通過與靶基因 miRNA 特異性的堿基互補配對,引起靶基因 miRNA 的降解或者抑制其翻譯,負調(diào)控靶基因的表達,參與和影響細胞分化、組織發(fā)育、腫瘤診斷及預后[3];而長編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過 200個核苷酸、不編碼蛋白的RNA,在發(fā)育、分化及代謝等多方面發(fā)揮著重要作用[4]。miRNA和lncRNA都高度保守穩(wěn)定,可競爭性結(jié)合并調(diào)控靶基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因而可作為潛在標志物用于腫瘤的預測、診斷及預后的判斷[5-8]。本研究通過生物信息學方法找出結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA及l(fā)ncRNA,并選取結(jié)直腸癌變組織及其對應的癌旁觀察其表達,分析它們的相互作用及對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響。
Trizol 購自上海生工公司,miRcute miRNA cDNA 試劑盒(KR201)、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green,F(xiàn)P411)及l(fā)nRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green) (FP402) 購自北京天根生化科技有限公司,lncGAS5過表達質(zhì)粒及含lncGAS5啟動子的CRISPR-Cas9質(zhì)粒購自吉凱基因公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher,DMEM等細胞培養(yǎng)試劑購自Gibco公司;Anti-RECK抗體(ab238162)和山羊抗兔IgG H&L (HRP,ab205718)購自Abcam,所用引物U6、RECK及 miRNA 26a購自廣州復能公司。
1.2.1生物信息學預測 利用miRanda數(shù)據(jù)庫(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和 Starbase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測RECKmRNA-miRNA,miRNA-lncRNA的結(jié)合位點并做分析。
1.2.2構(gòu)建過表達和沉默lncGAS5的SW480細胞 在轉(zhuǎn)染的前一天,傳代準備SW480細胞,待細胞密度生長至60%~80%時即可用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將2種質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(先用不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋)混勻,加入到SW480細胞中;于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~8 h后,取出轉(zhuǎn)染細胞,用2 mL新鮮的不含雙抗的完全培養(yǎng)基換掉原培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h后、加入嘌呤霉素(3.0 mg/L)進行篩選。10~15 d后收取細胞提取RNA和蛋白。
1.2.3RNA、miRNA、lncRNA提取 取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌變組織及癌旁 5 cm 以上的正常黏膜組織,用Trizol提取總RNA,用試劑盒提取miRNA和lncRNA,紫外分光光度儀測定濃度及純度(OD260/OD280>1.8可用)。按照試劑盒說明書對miRNA和lncRNA進行熒光定量檢測。
1.2.4熒光定量PCR(qPCR) 吸取1.2.3中得到的RNA,加入超純水,70 ℃孵育5 min,冷卻后置于冰上,加入反轉(zhuǎn)錄酶,42 ℃孵育60 min,70 ℃加熱10 min,保存于-20 ℃?;蛞镉缮虾Iど镉邢薰竞铣桑簂ncRNA GAS5,F(xiàn)為5-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3,R為5-TTGTGCCATGAG
ACTCCATCAG-3;GAPDH,F(xiàn)為5-ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG-3,R為5-TTTGCTTGAAGTTTCA
CTGGCATC-3;miR-221,F(xiàn)為5-AGCTAAAAAAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTCG-3,R為5-GATCCGA
AACCC AGCAGACAATGTAGCTTTTTT-3)。反應條件為95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min,32個循環(huán)。實驗重復3次,采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。
1.2.5ECK蛋白表達水平 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot),將少量組織或構(gòu)建過表達和沉默lncGAS5的SW480細胞置于勻漿器中,加入蛋白質(zhì)裂解液研磨至無肉眼可見組織置于冰上裂解30 min,將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中,4 ℃ 12 000 r/min離心5 min,取上清,在紫外分光光度儀上測定蛋白質(zhì)濃度并置-20度保存。制膠后,加入50 ng變性蛋白溶液進行電泳及蛋白轉(zhuǎn)移,結(jié)束后加入RECK一抗和二抗進行孵育,最后進行凝膠圖像分析。
利用miRanda數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示(表1),RECKmRNA與miR-221有4個結(jié)合位點,與miR-26a有1個結(jié)合位點,推測miR-221/26a能靶向結(jié)合到RECKmRNA上對其進行調(diào)控。利用Starbase數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示lncRNA GAS5與miR-221/26a存在1個結(jié)合位點,提示它們之間存在相互作用關(guān)系。因此,利用qPCR對結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA及miR-221/26a的含量進行驗證(圖1),結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中,miR-221/26a的表達高于其相應的癌旁組織 (P<0.001、或0.05),lncRNA GAS5 在結(jié)直腸癌中表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
表1 miRanda數(shù)據(jù)庫預測RECK mRNA與miR-221/26a結(jié)合位點Tab.1 Predicted binding sites of RECK mRNA with miR-221/26a using miRanda database
表2 Starbase數(shù)據(jù)庫預測lncRNA GAS5與miR-221/26a結(jié)合位點Tab.2 Predicted binding sites of lncRNA GAS5 with miR-221/26a using Starbase database
圖1 lncRNA GAS5及miR-221/26a在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達Fig.1 The relative expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in CRC tissues and corresponding adjacent tissues
取穩(wěn)轉(zhuǎn)lncRNA GAS5后的SW480細胞提取RNA和蛋白,結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示,過表達組SW480細胞中GAS5相對含量為0.137±0.045,轉(zhuǎn)染空載組含量為 0.031±0.015,過表達組GAS5的含量是空載組的4.4倍,2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。過表達組SW480細胞中的miR221相對含量為0.004±0.001,空載組為0.010±0.002,過表達組低于空載組,僅為空載組的0.4倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。過表達組SW480細胞中的miR26a相對含量為0.005 8±0.002 3,空載組為0.012±0.001,過表達組低于空載組,僅為空載組的0.48倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示,過表達組細胞中的RECK蛋白表達含量低于空載組。
注:與空載組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.01。圖2 穩(wěn)轉(zhuǎn)lncRNA GAS5后SW480細胞中l(wèi)ncRNA GAS5及miR-221/26a表達Fig.2 The expression levels of lncRNA,miR-221,and miR-26a in SW480 cells overexpressing lncRNA GAS5
將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細胞后,用qPCR檢測lncGAS5、miR221及miR26a含量,結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示,GAS5在沉默組SW480細胞中相對含量約為0.000 5±0.000 13,而在空載組則為0.032±0.005 6,沉默組低于空載組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示成功建立lncGAS5 沉默細胞株。miR221在沉默組相對表達含量為0.078±0.021,空載組中為0.03±0.02,沉默組高于空載組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR26a在沉默組相對表達含量為0.059±0.007 3,空載組中為0.039±0.011,沉默組高于空載組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示GAS5的降低在一定程度上會上調(diào)miR221和miR26a的含量。Western blot 結(jié)果顯示,沉默GAS5時,RECK蛋白表達增加。
我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢,其發(fā)病率、死亡率在所有惡性腫瘤中均居第5位[6]。因此,尋找和發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的癌基因并揭示和預測其在結(jié)直腸癌的病程進展和轉(zhuǎn)移過程中的功能,對于結(jié)直腸癌的診治具有十分重要的理論意義和實際應用價值。
RECK是一個公認的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子,其蛋白主要定位于細胞外。它富含半胱氨酸,是一類膜錨定糖蛋白,在常見細胞中通過轉(zhuǎn)錄后能調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達,阻遏腫瘤血管生成,從而抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。有研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌病人的腫瘤樣本中,RECK的表達水平和病人復發(fā)風險有關(guān),高濃度的RECK往往預示著病人的復發(fā)風險較低。此外通過動物及細胞實驗發(fā)現(xiàn),提升RECK的表達能抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管新生[8-9]。以上研究提示RECK與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。課題組在前期研究中探討了RECK蛋白和mRNA在原發(fā)腫瘤組、結(jié)直腸轉(zhuǎn)移灶組以及癌旁組織的表達情況,證實了RECK蛋白及mRNA水平在腫瘤組中是呈低表達的,且在轉(zhuǎn)移灶組中RECK蛋白及mRNA表達量更低。
注:(1)與空載組比較,P<0.01。圖3 沉默lncRNA GAS5的SW480細胞的qPCR及Western blot 結(jié)果Fig.3 The results of qPCR and Western blot in SW480 cells silencing lncRNA GAS5
miRNA是一類約含22個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA,通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)上的相應靶點結(jié)合,能抑制或降解特定靶基因,從而起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的作用[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-25-3p通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞相關(guān)因子表達,可以促進血管通透性和血管生成,同時大腸癌細胞的miR-25-3p外顯子可顯著誘導大腸癌的血管滲漏,促進大腸癌在肝、肺的轉(zhuǎn)移。此外,miR-25-3p的表達水平在發(fā)生轉(zhuǎn)移的大腸癌患者中明顯高于無轉(zhuǎn)移者,證明了miR-25-3p是一種促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的miRNA[12]。有學者發(fā)現(xiàn)與直腸癌相關(guān)的miRNA約有50多個,這些miRNA可通過改變Wnt通路的β-連環(huán)蛋白(βcatenin)、表皮生長因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和腫瘤抑制蛋白(TP53)等信號通路來影響大腸癌的生存、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,因此,miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密不可分[14-15],而lncRNA與miRNA一樣,屬于非編碼RNA,區(qū)別是lncRNA轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸,在生物發(fā)育、分化和代謝等方面起到了重要調(diào)控作用,成為近年來的研究熱點[16-18]。不少研究顯示lncRNA和miRNA存在競爭結(jié)合參與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-21]。如Wang等[22]人在綜述中就提到40多種lncRNA/miRNA參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的情況。
本研究利用生物信息學進行預測,發(fā)現(xiàn)了多條與RECKmRNA相結(jié)合的miRNA,其中 miR-221 與之有4個結(jié)合位點,miR-26a 與之有1個結(jié)合位點,由此推測RECK表達與這2個miRNA有關(guān)系,進而對結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織中miR-221/26a進行驗證。結(jié)果顯示這2個miRNA在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達。這或許暗示了在結(jié)直腸癌中,上調(diào)的miR-221/miR-26a 通過結(jié)合RECKmRNA,抑制了RECK蛋白的表達,從而促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。同時數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果還顯示lncRNA GAS5能同時結(jié)合 miR-221、miR-26a,本研究也對結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA GAS5進行驗證,結(jié)果顯示lncRNA GAS5在結(jié)直腸癌腫瘤組織中呈低表達。
以上結(jié)果初步提示在結(jié)直腸癌細胞中,lncRNA GAS5表達降低,會使得 miR-221 和miR-26a 的豐度升高,從而抑制了RECKmRNA 表達,最終促進結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移?;谝陨贤茰y,本研究在SW480細胞中過表達了lncRNA GAS5,通過測定GAS5含量提示我們過表達細胞模型構(gòu)建成功且miR-221/26a含量隨著GAS5的增加而下降,RECK蛋白含量降低,提示GAS5能通過負反饋miR-221/26a含量影響RECK蛋白表達。同時,本研究還通過轉(zhuǎn)染含GAS5啟動子的CRISPR-Cas9質(zhì)粒,下調(diào)其含量,并檢測miR-221/26a變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著GAS5含量下降,miR-221/26a和RECK表達均上調(diào)。通過細胞實驗可以初步證實lncRNA GAS5表達降低,對 miR-221 和 miR-26a 的吸附作用降低,導致 miR-221 和miR-26a 的表達升高,結(jié)果提示miR-221 和 miR-26a 能與抑癌基因RECKmRNA結(jié)合,并抑制其表達,進而最終促進結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移。
綜上所述,本研究先通過生物信息學預測出相關(guān)的lncRNA和miRNA,再通過構(gòu)建過表達和沉默細胞株驗證GAS5,miR-221/ 26a和RECK之間的關(guān)系,結(jié)果表明lncRNA GAS5和miR-221 /miR-26a與結(jié)直腸癌發(fā)展密切相關(guān),檢測其含量變化可提前為癌細胞是否轉(zhuǎn)移做出預測。