沈鑫鑫 金 磊 趙 倩 迪力夏提·金斯汗 朱麗萍 楊 亮

乳腺癌發(fā)病率位于女性惡性腫瘤的第1位。盡管乳腺癌在診療水平上已取得重大進展，但部分乳腺癌患者的預后仍不能令人滿意，其中浸潤性乳腺癌易出現(xiàn)局部復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和治療抵抗。乳腺癌細胞浸潤和通過腫瘤滋養(yǎng)血管轉(zhuǎn)移的分子機制仍需要進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，血管抑制蛋白(vasohibin, VASH)家族中VASH-2蛋白與腫瘤的發(fā)生及血管生成相關。有研究報道，VASH-2是一種內(nèi)皮細胞非固有的不依賴血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的促血管生成因子。VASH-2在肝細胞惡性腫瘤、胃惡性腫瘤、和胰腺惡性腫瘤中均有表達并且能夠促進腫瘤新生血管形成，在癌細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。然而，VASH-2對乳腺癌的具體作用尚不清楚。本研究運用免疫組織化學法檢測VASH-2在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達情況，并分析其表達與患者預后的關系，為進一步研究其功能和機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月1日至2013年12月31日新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院185例原發(fā)性乳腺癌病例為研究對象：患者年齡30～70歲，平均(48.60±11.21)歲；未絕經(jīng)者100例，絕經(jīng)者85例。收集患者年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤大小、細胞學分級、組織學類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。納入標準：①病理免疫組織化學方法確診為乳腺癌；②術前未接受新輔助治療；③卡式評分(Karnofsky performance status, KPS)≥90分，接受手術治療者；④無其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史；⑤術前同意標本采集并簽署知情同意書。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院倫理委員會批準。排除標準：排除遠處轉(zhuǎn)移乳腺癌及特殊類型浸潤性乳腺癌(炎性乳腺癌、肉瘤、微乳頭狀癌、粘液癌、小管癌、髓樣癌)者。

1.2 方法 術前采用B超血管成像了解病灶血流分布情況，并在其引導下對乳腺癌病灶富血供區(qū)域及乏血供區(qū)域進行穿刺(血流豐富程度的分級通常分為四級：0級為腫塊內(nèi)未見血流信號顯示；1級為少量血流，腫塊內(nèi)見1～2個點狀血流信號；2級為中量血流，腫塊內(nèi)見3～4個點狀血流信號或一條壁管清晰的血管；3級為豐富血流，腫塊內(nèi)見4個以上點狀血流或2條管壁清晰的血管。定義0～1級為乏血供區(qū)域，2～3級為富血供區(qū)域)，并取出相應區(qū)域組織；在術中取得乳腺癌及癌旁組織標本，對所有標本采用免疫組化(Immunohistochemistry)SP法染色，根據(jù)試劑說明書步驟進行染色，采用微波法進行抗原修復。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定 由3名病理科醫(yī)師采用盲法判讀免疫組化染色結(jié)果，染色結(jié)果判讀采用EnVison法。標本處理：10%甲醛固定標本，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化自動染色儀染色。以已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替VASH-2一抗(美國Proteintech公司，兔抗人VASH-2多克隆抗體，稀釋比為1∶1 000)作為陰性對照，光鏡下觀察。VASH-2主要表達于細胞質(zhì)中，呈棕黃色染色顆粒，根據(jù)細胞染色強度，分為未著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色；采用半定量結(jié)果判斷，分別對鏡下陽性表達的百分比和染色強度給予評分。①陽性細胞著色細胞數(shù)：每張切片上觀察5～10個高倍鏡視野(×100)，計數(shù)陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。②陽性細胞著色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③上述兩者計分相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。其中，定義0～4分為VASH-2低表達，5～12分為VASH-2高表達。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)表達依據(jù)2010年美國臨床腫瘤學會的標準判讀。人表皮生長因子-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2 )表達依據(jù)2013年美國臨床腫瘤學會/美國病理學家學會乳腺癌HER-2檢測指南判讀，其中免疫組化結(jié)果提示HER-2蛋白(++)的樣本需再行熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測明確HER-2表達狀態(tài)。

1.4 觀察指標 比較乳腺癌組織及癌旁組織VASH-2表達情況；比較乳腺癌組織VASH-2在乳腺癌富血供病灶和乏血供病灶中的表達情況；搜集患者臨床資料，比較不同病理參數(shù)(年齡、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、ER表達、是否絕經(jīng)及腫瘤細胞學分級、腫塊大小、分子分型、HER-2表達情況)乳腺癌患者VASH-2表達量的差異。

隨訪截至2019年1月，中位隨訪時間38個月(8～60個月)，采用Kaplan-Meier 法分析乳腺癌病灶中不同VASH-2表達情況對患者5年無病進展生存期(progression-free survival，PFS)的影響。

2 結(jié)果

2.1 VASH-2 蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，VASH-2蛋白主要分布在細胞質(zhì)中，呈棕黃色染色顆粒。VASH-2在乳腺癌病灶中多呈高表達，表達率為52.43%(97/185)，而在癌旁組織中表達率為27.03%(50/185)，差異有統(tǒng)計學意義(χ=24.933,

P

<0.001)。見圖1。

圖1 VASH-2在乳腺癌不同區(qū)域組織中表達情況 (SP×100)

2.2 VASH-2蛋白在乳腺癌富血供和乏血供病灶中的表達情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，VASH-2在乳腺癌病灶中富血供區(qū)域多呈高表達，表達率為60.82%(59/97)，而在乏血供區(qū)域表達率為38.64%(34/88)，差異有統(tǒng)計學意義(χ=9.087,

P

<0.05)。見圖2。

圖2 VASH-2在乳腺癌組織富血供和乏血供區(qū)域中的表達情況 (SP×100)

2.3 不同臨床病理參數(shù)患者VASH-2蛋白表達情況比較 不同腫塊大小、分子分型及HER-2是否陽性的乳腺癌患者VASH-2表達情況比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表1。2.4 VASH-2表達情況與患者預后的關系 Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示，VASH-2低表達組5年PFS優(yōu)于VASH-2高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(

χ

=5.635,

P

=0.018)。見圖3。

表1 不同臨床病理參數(shù)患者VASH-2蛋白表達情況比較

圖3 VASH-2高表達和低表達組5年PFS比較

3 討論

近年來乳腺癌發(fā)病率逐年升高，已成為中國婦女最常見的惡性腫瘤，部分乳腺癌具有惡性程度高、易內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、5年總生存率低等特點。腫瘤血管形成促進了腫瘤細胞增殖并形成了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的通道，氧氣和營養(yǎng)成分通過新生血管到達腫瘤細胞，直接影響腫瘤的發(fā)展進程。有研究發(fā)現(xiàn)惡性程度較高的乳腺癌多有豐富的血流及豐富的淋巴管網(wǎng)，腫瘤細胞通過血管及淋巴管出現(xiàn)淋巴結(jié)及血道遠處轉(zhuǎn)移。血管新生相關因子VASH-2在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮了積極作用。相關基因表達分析研究結(jié)果顯示，VASH-2是一種新發(fā)現(xiàn)的血管新生影響因子，在多種腫瘤如肝細胞癌、胃癌和胰腺癌等癌細胞中均有表達。研究表明VASH-2在人和小鼠胚胎發(fā)育期的內(nèi)皮細胞中表達，出生后表達消失；VASH-2促使人乳腺癌細胞進行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，降低癌細胞中VASH-2的基因表達在理論上能明顯控制癌細胞生長和腫瘤血管生成。

本研究結(jié)果顯示，VASH-2表達情況在富血供乳腺癌組織和乏血供乳腺癌組織中存在差異(

P

<0.05)。正常情況下，VASH-2促進血管生成；隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，腫瘤細胞能夠分泌更多VASH-2因子促進血管生成，血管向腫瘤病灶延伸，腫瘤通過血管獲取更多養(yǎng)分及通過血管通道轉(zhuǎn)移。這提示VASH-2與乳腺癌的進展密切相關。分析原因可能是血管生成增加導致腫瘤細胞通過血管通道出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，或通過血運轉(zhuǎn)移促進疾病進展，提示VASH-2可以作為預測乳腺癌惡性程度的標志物。有研究發(fā)現(xiàn)，VASH-2異常表達和肝癌、食管癌預后相關。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌病灶中VASH-2低表達組的5年PFS優(yōu)于VASH-2高表達組 (

P

=0.018)，這與部分學者研究結(jié)果一致。關于VASH-2異常表達影響患者預后的具體機制，有待后續(xù)研究進一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同腫塊大小、分子分型及HER-2是否陽性的乳腺癌患者VASH-2表達情況比較，差異顯著(

P

<0.05)。提示VASH-2異常表達和乳腺癌分子分型相關，VASH-2在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)中多呈現(xiàn)高表達，這可能與TNBC容易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移密切相關。

綜上所述，乳腺癌病灶中VASH-2 表達量明顯高于癌旁病灶，且富血供病灶中VASH-2的表達量高于乏血供病灶，其高表達可能與乳腺癌血管生成相關，VASH-2表達情況和乳腺癌預后相關。本實驗為回顧性小樣本研究，且可能存在研究過程中隨訪樣本不足，復發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的樣本數(shù)較少，存在檢驗誤差等，因此VASH-2在乳腺癌中所起的作用仍需以后更多的臨床大樣本研究證實。