王學博 符攀峰 任紅娟 孫 麗 白峰巖

宮頸癌具有惡性程度高、發(fā)展速度快等特點，手術切除、放化療等是目前治療宮頸癌的主要方法，但是這些治療方法的療效有一定的局限性。分子靶向治療是近些年來研究發(fā)現(xiàn)的具有潛在應用前景的腫瘤治療途徑，中藥聯(lián)合分子靶向治療可能是未來腫瘤治療的一種有效途徑。木犀草素是天然的黃酮類化合物，具有抑制腫瘤生長和轉移的作用。miR-425-5p是一個在腫瘤細胞中過度表達的微小RNA分子，具有促進胰腺癌、胃癌等腫瘤細胞浸潤和轉移的作用。有研究顯示，miR-425-5p在宮頸癌患者中呈高表達，且與腫瘤患者的臨床分期和轉移程度有關。本文擬探討木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，以期為尋找治療宮頸癌有效的治療方案提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)抗體(生產(chǎn)廠家：Cell Signaling Technology)；木犀草素(生產(chǎn)廠家：成都格利普生物科技有限公司)；c-caspase-9抗體、p-Akt抗體(生產(chǎn)廠家：美國Santa Cruz)；c-caspase-3抗體(生產(chǎn)廠家：美國ABCAM)；miRNA first-strand cDNA synthesis kit (生產(chǎn)廠家：美國Thermo Fisher)；inhibitor control、miR-425-5p inhibitor[生產(chǎn)廠家：吉滿生物科技(上海)有限公司]；MMP-9抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗(生產(chǎn)廠家：美國cytoskeleton)；引物(生產(chǎn)廠家：武漢金開瑞生物工程有限公司)；Lipofectamine 2000(生產(chǎn)廠家：美國Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 HeLa細胞轉染及miR-425-5p表達水平檢測 HeLa細胞中轉染inhibitor control、miR-425-5p inhibitor操作同Lipofectamine 2000，步驟如下：將inhibitor control、miR-425-5p inhibitor和Lipofectamine 2000分別用DMEM稀釋，混合后添加到細胞中，培養(yǎng)24 h以后，更換新鮮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。細胞在轉染24 h后，采用Realtime PCR測定。即在細胞中添加Trizol試劑，充分裂解后，添加氯仿溶液，4℃，3000 r/min離心15 min，吸取上層溶液，異丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗滌2次，-20℃保存。按照miRNA first-strand cDNA synthesis kit 試劑盒進行反轉錄，反轉錄步驟：吸取2 μL的RNA，加入1 μL的gDNA Eraser、2 μL的gDNA Eraser Buffer，添加RNase-free HO至10 μL，在42℃條件下孵育2 min，取出反應液，添加4 μL的5×PrimeScript Buffer、1 μL的PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μL的RT Prime Mix 4，添加RNase-free HO至20 μL，在37℃條件下反應15 min，85℃反應5 s，在4℃保存。取1 μL的cDNA，添加10 μL的SYBR Prime Ex Taq II、0.4 μL的上游和下游引物、0.4 μL的ROX Reference Dye II，添加RNase-free HO至20 μL，PCR反應條件：第一階段95℃預變性30 s；第二階段：95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。以U6作為參照，根據(jù)反應得到的Ct值(2法)分析miR-425-5p表達水平。U6 sense 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAATACTAAAAT-3’，Anti-sense 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。miR-425-5p sense 5’-GGGGAGTTAGGATTAGGTC-3’，Anti-sense 5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

1.2.2 細胞分組 將HeLa細胞分成Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p、木犀草素+Anti-NC、木犀草素+Anti-miR-425-5p共5組，Control組為不做轉染的宮頸癌HeLa細胞，Anti-NC組、Anti-miR-425-5p組分別轉染inhibitor control、miR-425-5p inhibitor的宮頸癌HeLa細胞，木犀草素+Anti-NC組、木犀草素+Anti-miR-425-5p組分別轉染inhibitor control、miR-425-5p inhibitor并且經(jīng)過40 μmol/L木犀草素處理培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細胞。每個實驗設置3復孔，實驗重復3次。

1.2.3 HeLa細胞增殖檢測 采用MTT法檢測HeLa細胞增殖，結果以A值表示。操作方法：將5組HeLa細胞種植到96孔板內(接種密度為每孔5 000個細胞)，把培養(yǎng)板放在37℃，5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以后，將培養(yǎng)板取出。用移液槍分別在孔內添加MTT工作液，每孔10 μL，繼續(xù)反應4 h。將培養(yǎng)板內的液體吸棄，添加150 μL的DMSO溶液，震蕩反應5 min。把培養(yǎng)板放在酶標儀上，測定每孔的A值(波長490 nm)。

1.2.4 HeLa細胞克隆能力測定 采用平板克隆實驗測定。操作方法：將5組細胞種植到6孔板中，每個孔中加400個細胞。培養(yǎng)12 d以后，肉眼可見形成克隆團。用磷酸緩沖鹽洗滌細胞，結晶紫染色以后，計數(shù)克隆形成數(shù)目。以克隆形成數(shù)目占接種細胞數(shù)量的百分比表示克隆形成率。

1.2.5 HeLa細胞凋亡檢測 采用流式細胞術測定。操作方法：將5組細胞分別培養(yǎng)24 h后，添加0.25%的胰蛋白酶消化，用磷酸緩沖鹽洗滌。最后添加結合緩沖液將細胞懸浮，再加入PI及Annexin V-FITC溶液，混合均勻以后，立即用流式細胞儀測定。

1.2.6 HeLa細胞侵襲和遷移測定 遷移實驗采用Transwell小室檢測。操作方法：用不含血清的細胞培養(yǎng)液將5組HeLa細胞懸浮，吸取200 μL添加到Transwell小室的上室中，吸取500 μL的含血清細胞培養(yǎng)液添加到下室中。放在37℃，5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以后，取出小室，以多聚甲醛固定，結晶紫染色處理以后，放在顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)目(隨機選5個視野)，即為細胞遷移數(shù)目。細胞侵襲實驗檢測前添加基質膠將小室濕化，其余步驟同遷移實驗。

1.2.7 HeLa細胞中p-Akt、c-caspase-3、c-caspase-9、MMP-9、MMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測。操作方法：將5組HeLa細胞分別培養(yǎng)24 h，用移液器把孔內液體吸棄，分別添加蛋白裂解溶液，放在冰上將細胞完全裂解。把裂解液轉移到離心管中，以3000 r/min離心10 min，細胞蛋白存在于上清溶液中。SDS-PAGE凝膠用10%分離膠和5%的濃縮膠。蛋白在上樣之前同Loading Buffer混合煮沸變性處理。蛋白電泳上樣量為40 μg，電泳電壓為90 V，肉眼觀察到溴酚藍染料到達底部以后方可停止電泳。轉膜電壓為80 V，轉膜操作在冰上進行，轉膜時間為60 min。取出電轉后的NC膜，置于封閉液(5%牛血清白蛋白)中將非特異性位點封閉以后，然后同一抗(反應條件為4℃過夜，c-caspase-3、c-caspase-9稀釋倍數(shù)為1∶4 000，MMP-9、MMP-2、Bcl-2、Bax稀釋倍數(shù)為1∶1 000，p-Akt稀釋倍數(shù)為1∶400，Akt稀釋倍數(shù)為1∶600)、二抗稀釋液(反應條件為室溫孵育1 h，稀釋倍數(shù)為1∶2 000)孵育結合。ECL方法顯色以后，分析內參(β-actin)和目的蛋白(p-Akt、c-caspase-3、c-caspase-9、MMP-9、MMP-2、Bcl-2、Bax)灰度值，以目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

2 結果

2.1 Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 3組HeLa細胞中miR-425-5p表達水平比較 與Control組、Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組宮頸癌HeLa細胞中miR-425-5p表達水平(0.39±0.06)較Control組(1.00±0.07)、Anti-NC組(0.97±0.12)降低，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=46.467，

P

=0.000)。2.2 5組HeLa細胞增殖、克隆、凋亡及蛋白表達情況比較 與Control組、Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組、木犀草素+Anti-NC組HeLa細胞A值、克隆形成率下降，細胞凋亡率升高，c-caspase-3、c-caspase-9、Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平減少，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，且木犀草素+Anti-miR-425-5p組細胞A值、克隆形成率下降更明顯，細胞凋亡率也更高，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 5組HeLa細胞增殖、克隆、凋亡及蛋白表達情況比較

2.3 5組HeLa細胞侵襲與遷移數(shù)目和MMP-9、MMP-2蛋白表達比較 與Control組、Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組、木犀草素+Anti-NC組宮頸癌HeLa細胞侵襲與遷移數(shù)目和MMP-9、MMP-2蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，且木犀草素+Anti-miR-425-5p組細胞侵襲與遷移數(shù)目和MMP-9、MMP-2蛋白表達水平下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表2。2.4 5組HeLa細胞Akt、p-Akt蛋白表達水平比較 與Anti-NC組比較，Anti-miR-425-5p組、木犀草素+Anti-NC組宮頸癌HeLa細胞p-Akt蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，且木犀草素+Anti-miR-425-5p組細胞p-Akt蛋白表達水平下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表3。

表2 5組HeLa細胞侵襲與遷移數(shù)目和MMP-9、MMP-2蛋白表達水平比較

表3 5組HeLa細胞Akt、p-Akt蛋白表達水平比較

3 討論

木犀草素廣泛存在于西蘭花、芹菜、胡椒等植物中，具有抗宮頸癌細胞增殖的作用。miR-425-5p是一個與細胞分化、增殖等有關的重要調節(jié)因子。miR-425-5p在胃癌、肺癌、結直腸癌等腫瘤組織中呈高表達，并與腫瘤患者的預后、分期、浸潤程度等有關， miR-425-5p可能是腫瘤治療的潛在靶點。研究發(fā)現(xiàn)，miR-425-5p在宮頸癌患者中也呈高表達。Akt信號通路影響細胞增殖、凋亡、遷移等過程，降低腫瘤細胞中Akt信號的激活程度對于腫瘤進展具有明顯的抑制作用。本實驗探討木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞生物學特性的影響及可能機制，旨在為宮頸癌治療提供思路。

本研究結果顯示，木犀草素處理后的宮頸癌HeLa細胞A值、克隆形成率、細胞侵襲與遷移數(shù)目均顯著降低(

P

<0.05)，凋亡率顯著升高(

P

<0.05)，這說明木犀草素能夠在體外降低宮頸癌HeLa細胞惡性生長能力，激活細胞凋亡，降低細胞遷移和侵襲能力。這與相關研究一致，均說明木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p有抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，與單純下調miR-425-5p或木犀草素處理組相比，木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p后的宮頸癌HeLa細胞A值、克隆形成率、侵襲與遷移數(shù)目均顯著降低(

P

<0.05)，表明木犀草素和下調miR-425-5p聯(lián)合之后對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用更強，對細胞凋亡誘導的作用也更強，木犀草素和下調miR-425-5p對宮頸癌HeLa細胞的抑制功效大大增加，有望成為宮頸癌治療的潛在方法。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p后的宮頸癌HeLa細胞中p-Akt蛋白表達水平顯著降低(

P

<0.05)。Akt在腫瘤中發(fā)揮類似癌基因的作用，其磷酸化后形成p-Akt參與介導caspase凋亡反應和基質降解酶MMPs的表達，從而影響細胞增殖、凋亡、遷移等過程。相關研究顯示，降低腫瘤細胞中Akt信號的激活程度對于腫瘤進展具有明顯的抑制作用。本研究結果提示木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p降低了宮頸癌細胞中Akt信號通路的激活水平，因此推測，木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p可能是通過抑制Akt信號的激活程度從而抑制MMP-2、MMP-9的表達，并促進c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表達，這可能是木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p抗宮頸癌細胞惡性進展的作用機制。

綜上所述，木犀草素聯(lián)合下調miR-425-5p可在體外抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，作用機制可能與抑制Akt信號通路的激活有關。