[摘要]目的探討小白菊內酯（PN）對人肝癌HepG2細胞的抗腫瘤作用及其機制。方法取對數(shù)生長期的HepG2細胞分成兩組，DMSO組以換液形式加入含1/1 000 DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基，PN處理組分別加入PN濃度為15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、27.5 μmol/L的DMEM高糖培養(yǎng)基，應用WST-8法檢測PN處理24、48、72 h對HepG2細胞活力的影響。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，隨機分為DMSO組與PN（25.0 μmol/L）處理組（6、12、24 h），流式細胞術檢測PN對HepG2細胞內Ca2+水平、線粒體膜電位、凋亡細胞比例的影響，Western blot法檢測PN對細胞凋亡相關蛋白（Caspase-3、Caspase-9、FLIPL、FLIPS、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62）的影響，DCFH-DA探針流式細胞術檢測活性氧（ROS）水平，比色法檢測PN對細胞內谷胱甘肽（GSH）生成的影響，以及聯(lián)合使用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）1 mmol/L處理細胞24 h對上述指標的影響。結果與DMSO組相比，隨著PN作用濃度以及時間的增加，細胞活力明顯降低（F濃度=1 778.0，F(xiàn)時間=439.4，F(xiàn)交互=44.3，Plt;0.01）。PN作用細胞24 h，細胞內Ca2+水平明顯升高（t=31.58，Plt;0.01）。PN組隨著作用時間延長，線粒體膜電位顯著下降（F=971.1，Plt;0.01），凋亡細胞比例升高（F=211.3，Plt;0.01），Caspase-3、Caspase-9活化增加（F=430.9、866.0，Plt;0.01），F(xiàn)LIPL和FLIPS表達下降（F=57.8、83.3，Plt;0.01），LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達上調（F=2 219.0、527.7，Plt;0.01），P62蛋白表達下調（F=1 533.0，Plt;0.01），而HepG2細胞中ROS水平明顯升高（t=18.06，Plt;0.01）、GSH水平明顯降低（F=263.4，Plt;0.01）。聯(lián)合應用NAC處理24 h后，PN誘導的細胞凋亡增加、ROS水平升高和GSH水平降低均明顯減弱，與DMSO組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。結論PN可能通過減少HepG2細胞內GSH產生，誘導細胞內ROS水平升高，進而誘導細胞凋亡與自噬。

[關鍵詞]小白菊內酯;癌，肝細胞;活性氧;細胞凋亡

[中圖分類號]R285.5[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0025-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect and mechanism of parthenolide （PN） on human hepatoma HepG2 cells. MethodsHepG2 cells in the logarithmic growth phase were divided into DMSO group （treated with DMEM high-glucose medium containing 1/1 000 DMSO） and PN group （treated with DMEM high-glucose medium containing PN at doses of 15.0， 17.5， 20.0， 22.5， 25.0， and 27.5 μmol/L）， and WST-8 assay was used to observe the effect of PN on the viability of HepG2 cells after 24， 48， and 72 h of treatment. HepG2 cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into DMSO group and PN treatment group （treated with PN at a dose of 25.0 μmol/L for 6， 12， and 24 h）; flow cytometry was used to evaluate the effect of PN on Ca2+ level， mitochondrial membrane potential， and proportion of apoptotic cells; Western blot was used to observe the effect of PN on levels of cell death-related proteins （Caspase-3， Caspase-9， FLIPL， FLIPS， LC3-Ⅱ， Beclin-1， and P62）; DCFH-DA probe flow cytometry was used to measure the level of reactive oxygen species （ROS）; colorimetry was used to assess the effect of PN on the production of glutathione （GSH） in cells and the effect of co-treatment with PN and N-acetyl-L-cysteine （NAC，1 mmol/L） for 24 h on the above indices. ResultsCompared with the DMSO group， the PN treatment group had a significant reduction in cell viability with the increases in the concentration and duration of PN treatment （Fconcentration=1 778.0，F(xiàn)time=439.4，F(xiàn)interaction=44.3，Plt;0.01）. After PN treatment for 24 h， there was a significant increase in Ca2+ level in cells （t=31.58，Plt;0.01）; with the increase in the duration of PN treatment， the PN treatment group had a significant reduction in mitochondrial membrane potential （F=971.1，Plt;0.01） and a significant increase in the proportion of apoptotic cells （F=211.3，Plt;0.01）; Caspase-3 and Caspase-9 were activated （F=430.9，866.0;Plt;0.01）; there were significant reductions in the expression of FLIPL and FLIPS （F=57.8，83.3;Plt;0.01）， significant increases in the protein expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 （F=2 219.0，527.7，Plt;0.01）， a significant reduction in the protein expression of P62 （F=1 533.0，Plt;0.01）， a significant increase in ROS level in HepG2 cells （t=18.06，Plt;0.01）， and a significant reduction in the level of GSH level （F=263.4，Plt;0.01）. Co-treatment with NAC for 24 h significantly attenuated cell death， increased ROS level， and reduced GSH level induced by PN， with no significant difference from the DMSO group （Pgt;0.05）. ConclusionPN may induce cell apoptosis and autophagy by reducing the production of GSH and increasing the level of ROS in HepG2 cells.

[KEY WORDS]parthenolide; carcinoma， hepatocellular; reactive oxygen species; apoptosis

肝癌在全球范圍內發(fā)病率逐年升高，并且病人呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。肝癌治愈率低、死亡率高，其發(fā)病機制仍不清楚[1]。小白菊內酯（PN）是從小白菊中提取的一種倍半萜烯內酯類天然產物，歐美地區(qū)人們將其作為一種解熱鎮(zhèn)痛藥使用[2]，研究證實其具有抗腫瘤活性[3]。已有研究顯示，PN具有抗腫瘤作用，其機制可能與特異性抑制核轉錄因子NF-κB和誘導DNA烷基化有關[4-5]。但PN對肝癌細胞作用及其機制尚不清楚?；钚匝酰≧OS）在人類各種疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。低水平ROS通過調節(jié)內環(huán)境平衡發(fā)揮保護細胞的作用，而高水平ROS在蛋白質、脂質和DNA損傷中發(fā)揮關鍵作用。ROS也參與癌細胞凋亡[6-7]。本文研究旨在探討PN是否通過影響ROS水平對人肝癌細胞HepG2產生抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

人源肝癌細胞株HepG2（購于美國ATCC細胞庫），加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清（BI）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone），置于37.0 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PN購于MCE公司（美國），以DMSO為溶劑配制成200 mmol/L儲存液，分裝后并凍存于-80 ℃冰箱備用。實驗用一抗p62、caspase-3、caspase-9、FLIP、PARP1、LC3-Ⅱ和Beclin-1均購自于Cell Signaling Technology公司，β-actin購自于AB Clonal公司。

1.2WST-8細胞毒力實驗

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以1∶3比例接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，設置3個復孔，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2細胞培養(yǎng)箱中，加入DMEM高糖培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至75%時，隨機分為兩組。DMSO組加入含1/1 000 DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基，PN處理組分別加入PN濃度為15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、27.5 μmol/L的DMEM高糖培養(yǎng)基。各組細胞分別于培養(yǎng)24、48、72 h時，每孔以換液形式加入含10 μL CCK-8溶液的細胞培養(yǎng)基100 μL（另設一個空白孔以去除背景值），于細胞培養(yǎng)箱中孵育50 min，用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）。計算細胞抑制率，繪制細胞毒力圖，計算PN作用于HepG2的IC50值，取適宜濃度用于后續(xù)實驗。

1.3檢測指標及方法

1.3.1細胞分組及處理HepG2細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化重懸后均勻地接種于6 cm平皿（每皿1.5×106個細胞），隨機分為DMSO組與PN組，培養(yǎng)12 h，待細胞處于對數(shù)生長期、融合度為75%左右時，DMSO組細胞不作處理，PN組細胞加入含25 μmol/L PN的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱分別孵育6、12、24 h。

1.3.2細胞內Ca2+水平檢測各組細胞處理后，使用Fluo-3AM鈣離子探針試劑盒（S1056，碧云天，上海）和流式細胞儀檢測細胞內Ca2+水平。

1.3.3線粒體膜電位檢測用2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞約1 min，收集細胞，使用JC-1線粒體膜電位試劑盒（碧云天，上海）檢測線粒體膜電位，根據(jù)說明書進行操作，上流式細胞儀檢測。

1.3.4細胞凋亡檢測各組細胞處理后，使用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI細胞凋亡檢測試劑盒（40305ES60，上海翊圣生物）、流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.5Western blot檢測蛋白表達水平各組細胞處理后，用RIPA裂解液（P0013C，碧云天，上海）裂解細胞，采用BCA方法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和抗體孵育，最后將膜置于ECL化學發(fā)光顯影液中，充分反應后置于化學發(fā)光儀中進行曝光顯影。觀察Caspase-3、Caspase-9、FLIPL、FLIPS、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62和Beclin-1蛋白表達條帶，并使用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3.6ROS水平檢測各組細胞處理之后，使用DCFH-DA探針試劑盒（S0033，碧云天，上海）和流式細胞儀檢測ROS水平。

1.3.7谷胱甘肽（GSH）水平檢測各組細胞處理后，使用GSH檢測試劑盒（S0053，碧云天，上海）和

1期徐偉華，等. 小白菊內酯對肝癌HepG2細胞凋亡作用及其機制27

流式細胞儀檢測GSH水平。

以上所有實驗每個樣本均設3個復孔，每個實驗均重復3次。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料結果以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1不同濃度PN對HepG2細胞活力的影響

WST-8細胞毒力實驗結果顯示，隨著PN濃度及處理時間的增加，HepG2的細胞活力逐漸下降（F濃度=1 778.0，F(xiàn)時間=439.4，F(xiàn)交互=44.3，Plt;0.01）。見圖1。

2.2PN對HepG2細胞Ca2+以及線粒體膜電位水平影響

與DMSO組Ca2+濃度（3.83±0.35）相比，PN處理24 h HepG2細胞中Ca2+濃度（49.33±1.40）明顯升高，差異有顯著性（t=31.584，Plt;0.01）。JC-1流式細胞術檢測顯示，隨著PN處理時間的延長，HepG2細胞線粒體膜電位逐漸下降，在PN處理24 h后，HepG2細胞線粒體膜電位幾乎完全喪失，差異有顯著性（F=971.1，Plt;0.01）。見圖2A。

2.3PN對HepG2細胞凋亡相關指標影響

DMSO組和PN處理6、12、24 h組HepG2細胞總凋亡比例比較差異有顯著性（F=211.3，Plt;0.01）。見圖2B。PN處理后，HepG2細胞中凋亡相關蛋白Caspase-9和Caspase-3明顯被活化（F=430.9、866.0，Plt;0.01），而兩個外源性凋亡相關的蛋白FLIPL（長型）和FLIPs（短型）表達均下降（F=57.8、83.3，Plt;0.01）。見圖3、表1。

2.4PN對HepG2細胞自噬的影響

PN處理后，HepG2細胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達均升高，P62蛋白表達下降，差異有顯著性（F=527.7～2 219.0，Plt;0.01）。見圖4、表1。

2.5PN及其聯(lián)合應用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）對相關指標的影響

與DMSO組（2.43±0.33）相比，PN處理24 h后，HepG2細胞內ROS水平（29.33±1.45）明顯升高，差異有顯著性（t=18.06，Plt;0.01）。PN聯(lián)合應用NAC后細胞內ROS水平（5.63±0.59）較PN組明顯下降，NAC組（2.17±0.09）與DMSO組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。聯(lián)合應用NAC后，PN誘導的HepG2細胞活力下降消失，且聯(lián)合應用NAC后PN對凋亡蛋白PARP-1、Caspase-9和Caspase-3的活化作用消失。PN處理后HepG2細胞內GSH水平（12 h為8.64±0.28，24 h為4.41±0.26）較DMSO組（13.13±0.27）明顯下降，而聯(lián)合NAC作用24 h后HepG2細胞內GSH水平（12.80±0.43）較PN組（4.22±0.17）明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=263.4，Plt;0.01）。見圖5。

3討論

PN是從小白菊中提取的天然倍半萜內酯類化合物，具有優(yōu)異的抗癌活性，且對正常細胞無毒副作用[8]。本文研究結果顯示，PN對HepG2細胞具有細胞毒作用，且呈濃度與時間依賴性。細胞線粒體膜電位的下降是線粒體依賴性凋亡早期的一個標志性事件[9]。本實驗結果顯示，PN處理HepG2細胞后Ca2+內流增加、線粒體膜電位下降，細胞外Ca2+內流導致細胞內Ca2+水平增加并超載，線粒體通透性增加，細胞色素C釋放，從而啟動相關的凋亡信號[10]。說明PN在HepG2細胞中可誘導線粒體外膜通透（MOMP）。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，屬于細胞的自然死亡。而正常細胞增殖、分化失控，不能正常發(fā)生凋亡，則會誘導腫瘤發(fā)生。既往研究結果表明，PN可誘導多種腫瘤細胞凋亡[11]。本文實驗結果顯示，PN處理可使HepG2細胞總凋亡比例明顯增高，隨著PN處理時間延長，凋亡細胞比例升高。內源性凋亡是一種由多種微環(huán)境改變引起的包括（但不限于）生長因子耗竭、DNA損傷、內質網應激、ROS超載、復制應激、微管改變或有絲分裂缺陷等引起的調節(jié)性細胞死亡（RCD），其啟動階段會出現(xiàn)MOMP[12]，由Caspase執(zhí)行蛋白（主要是Caspase-3）來執(zhí)行[13]。本文結果顯示，PN作用后HepG2細胞內源性凋亡啟動蛋白Caspase-9、凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3活化，PARP1剪切型蛋白活化，提示PN可能在HepG2細胞內誘導內源性凋亡;隨著PN作用時間的延長，兩個外源性凋亡相關的蛋白FLIPL（長型）和FLIPs（短型）表達均呈下降趨勢，提示PN可能通過下調FLIP誘導HepG2細胞發(fā)生外源性凋亡。

有研究結果表明，PN可在多種腫瘤細胞中誘導細胞自噬[14]。細胞自噬是細胞程序性死亡的另外一種方式。LC3是目前公認的自噬標記物，LC3蛋白在自噬過程中形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體膜上[15]。Beclin-1是自噬體形成過程中所必需的自噬相關蛋白質，其除了促進自噬體的形成，還能誘導細胞凋亡的發(fā)生，被認為是調控細胞自噬和凋亡的分子開關蛋白[16]。P62蛋白是自噬激活的標記物，可通過與LC3的相互作用定位于自體吞噬體，不斷被自噬-溶酶體系統(tǒng)降解。因此，可溶性P62蛋白減少，同時LC3-Ⅱ增加則表明自噬流活化[17]。本文研究結果顯示，PN處理后HepG2細胞可溶性P62蛋白水平明顯下降，Beclin-1蛋白水平明顯升高，LC3-Ⅱ明顯增加，說明自噬可能參與了PN誘導的細胞死亡。

越來越多的證據(jù)表明，細胞內ROS水平升高后，氧化還原平衡狀態(tài)被打破引起的氧化應激（OS）不僅可抑制線粒體中ATP合成，還會對細胞器和細胞膜造成損傷[18]。本文研究結果顯示，PN誘導的HepG2細胞凋亡過程中產生了大量的ROS，且呈時間依賴性增加，而NAC可以完全阻斷PN誘導的細胞凋亡以及ROS水平的升高，提示ROS的積累導致細胞產生氧化損傷，激活一系列死亡信號通路，導致了細胞凋亡。進一步的研究結果顯示，PN處理后HepG2細胞中GSH明顯減少，說明PN可能通過下調GSH水平，從而誘導ROS水平升高，導致HepG2細胞凋亡。

綜上所述，PN可誘導HepG2細胞凋亡和自噬，該作用可能與PN通過抑制GSH誘導ROS水平升高密切相關。

[參考文獻]

[1]BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I，" et al." Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]." CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（6）：394-424.

[2]KNIGHT D W. Feverfew： chemistry and biological activity[J]." Nat Prod Rep， 1995，12（3）：271-276.

[3]SUZUKI T， SAITO Y， ISOZAKI S，" et al." Simple method for portal vein infusion in the rat[J]." J Pharm Sci， 1973，62（2）：345-347.

[4]GHANTOUS A， SINJAB A， HERCEG Z，" et al." Partheno-lide： from plant shoots to cancer roots[J]." Drug Discovery Today， 2013，18（17-18）：894-905.

[5]WANG M T， LI Q Y. Parthenolide could become a promising and stable drug with anti-inflammatory effects[J]." Nat Prod Res， 2015，29（12）：1092-1101.

[6]BROOKES P S， YOON Y， ROBOTHAM J L，" et al." Cal-cium， ATP， and ROS： a mitochondrial love-hate triangle[J]." Am J Physiol Cell Physiol， 2004，287（4）：C817-C833.

[7]LI R， JIA Z Q， TRUSH M A. Defining ROS in biology and medicine[J]." React Oxyg Species Apex N C， 2016，1（1）：9-21.

[8]MATHEMA V B， KOH Y， THAKURI B C， SILLANP M. Parthenolide， a sesquiterpene lactone， expresses multiple anti-cancer and anti-inflammatory activities[J]. Inflammation， 2012，35（2）：560-565.

[9]GALLUZZI L， KEPP O， KROEMER G. Mitochondrial regulation of cell death： a phylogenetically conserved control[J]." Microbial Cell， 2016，3（3）：101-108.

[10]ERMAK G， DAVIES K J A. Calcium and oxidative stress： from cell signaling to cell death[J]. Molecular Immunology， 2002，38（10）：713-721.

[11]MARIA-REGINA O K， GROOTJANS S， BIAVATTI M W，" et al." Sesquiterpene lactones as drugs with multiple targets in cancer treatment[J]." Anti-Cancer Drugs， 2012：1.

[12]STEPHEN W G， GREEN D R. Mitochondria and cell death： outer membrane permeabilization and beyond[J]." Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2010，11（9）：621-632.

[13]JULIEN O， WELLS J A. Caspases and their substrates[J]." Cell Death Differ， 2017，24（8）：1380-1389.

[14]SUN Jing， ZHANG Chan， BAO Yongli，" et al." Parthenolide-induced apoptosis， autophagy and suppression of proliferation in HepG2 cells[J]." Asian Pacific Journal of Cancer Prevention， 2014，15（12）：4897-4902.

[15]TANIDA I， UENO T， KOMINAMI E. LC3 and autophagy[J]." Methods Mol Biol， 2008，445：77-88.

[16]XU H D， QIN Z H. Beclin 1， bcl-2 and autophagy[J]." Advances in Experimental Medicine and Biology， 2019，1206：109-126.

[17]LAMARK T， SVENNING S， JOHANSEN T. Regulation of selective autophagy： the p62/SQSTM1 paradigm[J]." Essays Biochem， 2017，61（6）：609-624.

[18]GALLUZZI L， BRAVO-SAN PEDRO J M， VITALE I，" et al." Essential versus accessory aspects of cell death：recommendations of the NCCD 2015[J]." Cell Death and Differentiation， 2015，22（1）：58-73.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）