[摘要]目的 探討蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）基因?qū)χ嗵牵↙PS）誘導(dǎo)的人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響。方法 采用LPS誘導(dǎo)HCASMC，實驗分為空白對照組、模型組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染組。采用實時熒光定量PCR（qPCR）和Western blot方法檢測HDAC9 mRNA和蛋白表達;MTT法和流式細胞術(shù)分別檢測細胞增殖和凋亡情況;ELISA檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-8（IL-8）含量。結(jié)果 與空白對照組相比，模型組細胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達水平升高（F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，P<0.05）、細胞活力升高（F=77.940，q=17.819，P<0.05）、凋亡率降低（F=98.321，q=15.563，P<0.05）、TNF-α與IL-1β及IL-8的含量增多（F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，P<0.05）。敲低HDAC9能夠抑制細胞活力和炎癥反應(yīng)，并促進細胞凋亡。結(jié)論 敲低HDAC9可抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC增殖及炎癥反應(yīng)，并促進細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]組蛋白脫乙?；割?基因敲低技術(shù);冠狀血管;肌細胞，平滑肌;細胞增殖;細胞凋亡;炎癥

[中圖分類號]R345.61;R322.12

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0260-05

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the protein deacetylase 9 （HDAC9） gene on lipopolysaccharide （LPS）-induced proliferation， apoptosis， and inflammatory response of human coronary artery smooth muscle cells （HCASMCs）. "Me-thods HCASMCs were induced by LPS， and the cells were divided into blank control group， model group， negative control group， and transfection group. Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of HDAC9; MTT assay and flow cytometry were used to measure cell proliferation and apoptosis; ELISA was used to mea-sure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-8 （IL-8）. "Results Compared with the blank control group， the model group had significant increases in the mRNA and protein expression levels of HDAC9 in cells （F=91.145-185.108，q=19.403-25.646，Plt;0.05）， a significant increase in cell viability （F=77.940，q=17.819，Plt;0.05）， a significant reduction in cell apoptosis rate （F=98.321，q=15.563，Plt;0.05）， and significant increases in the levels of TNF-α， IL-1β， and IL-8 （F=91.145-325.808，q=10.813-15.180，Plt;0.05）. HDAC9 knockdown inhibited cell viability and inflammatory response and promoted cell apoptosis.

Conclusion HDAC9 knockdown can inhibit LPS-induced proliferation and inflammation of HCASMCs and promote cell apoptosis.

[KEY WORDS]histone deacetylases; gene knockdown techniques; coronary vessels; myocytes， smooth muscle; cell proli-feration; apoptosis; inflammation

冠心病是由動脈粥樣硬化（AS）引起的心腦血管疾病，嚴(yán)重影響人類的健康和生命[1]。業(yè)已證實，冠心病是一種慢性炎癥性疾病[2]。有證據(jù)表明，血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和凋亡失衡是AS發(fā)展的關(guān)鍵步驟[3]。蛋白去乙?；?（HDAC9）屬于HDAC家族成員，HDAC9參與心血管疾病發(fā)生和發(fā)展[4-6]。而人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）在外界因子刺激下增殖和凋亡能夠參與AS的發(fā)病過程[7]。目前，有關(guān)HDAC9基因與HCASMC關(guān)系的研究鮮有報道。因此，本文探究HDAC9基因?qū)χ嗵牵↙PS）誘導(dǎo)HCASMC增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，以期為冠心病的治療提供新的靶點?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）購自美國Lifeline公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自賽默飛世爾科技有限公司;噻唑藍（MTT）試劑和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司;二甲基亞砜購自北京索萊寶科技有限公司;LPS購自美國Sigma公司;Trizol試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測試劑盒均購自日本TaKaRa公司;HDAC9 siRNA及陰性對照（siRNA Control）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-8（IL-8）ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒及Western blot檢測所需試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;HDAC9抗體、β-actin抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HCASMC復(fù)蘇后接種到含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將其放置于體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，待細胞貼壁生長融合度達到90%時，使用胰蛋白酶消化細胞，按照1∶3進行傳代。取對數(shù)生長期的HCASMC進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞處理和實驗分組 取對數(shù)生長期的HCASMC以胰蛋白酶消化，收集細胞接種到6孔板中，待細胞單層融合時進行處理。實驗分為4組：空白對照組（A組，未做處理），模型組（B組，以1 mg/L的LPS處理48 h），陰性對照組（C組，轉(zhuǎn)染siRNA Control后以1 mg/L的LPS處理48 h），轉(zhuǎn)染組（D組，轉(zhuǎn)染HDAC9 siRNA后以1 mg/L的LPS處理48 h）。每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔。細胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行，LPS處理HCASMC的濃度和時間參考文獻方法[8-9]及預(yù)實驗結(jié)果，各組細胞處理48 h后進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測HDAC9 mRNA表達水平 采用Trizol試劑分別提取各組HCASMC中總RNA，以RNA為模板使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，再以cDNA為模板使用SYBR premix Ex Taq PCR Kit檢測試劑盒進行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系包括：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR 10 μL，ddH2O 6 μL，避光加樣。短暫離心后放置在熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，程序設(shè)置為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，共設(shè)40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，用相對定量2-△△CT法計算HDAC9 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 Western blot檢測HDAC9蛋白的表達水平

收集各組處理48 h后HCASMC，加入適量細胞裂解液，置冰上裂解并提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白進行定量。取40 μg蛋白樣品進行加樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，分別加入1∶500稀釋的HDAC9一抗，4 ℃過夜雜交，再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光方法顯影和定影后，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin進行標(biāo)定，采用Image J軟件對各條帶灰度值進行分析，計算各組HCASMC中HDAC9蛋白相對表達水平。

1.2.5 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的HCASMC接種到96孔板中，按照上述1.2.2方法分組和處理，每組設(shè)置4個復(fù)孔，48 h后向各孔細胞中分別添加20 μL 的MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，棄上清液，再向細胞中加入150 μL二甲基亞砜，放置在震蕩儀上低速振蕩10 min，待還原物充分溶解以后，在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處吸光度值（A值）。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 處理48 h后各組HCASMC加入胰蛋白酶消化，收集細胞，首先加入Annexin V-FITC重懸細胞，然后加入PI染液，輕輕混勻，室溫下避光孵育10 min，隨機上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 ELISA檢測細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量 各組HCASMC處理48 h后，分別收集細胞培養(yǎng)上清液，參照TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA檢測試劑盒說明書測定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)均以x2±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析。以Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS誘導(dǎo)HCASMC中HDAC9的表達

qRT-PCR和Western blot方法分別檢測各組HCASMC中HDAC9的mRNA和蛋白表達結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（F=91.145、185.108，q=19.403、25.646，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞中HDAC9 mRNA和蛋白表達水平均明顯下調(diào)（q=13.393～20.714，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組兩組相比，細胞中HDAC9的mRNA和蛋白表達水平均無明顯變化（P均>0.05）。提示LPS能夠誘導(dǎo)HCASMC中HDAC9的表達，轉(zhuǎn)染HDAC9 siRNA能夠成功敲低HCASMC中HDAC9的表達。見圖1和表1。

2.2 敲低HDAC9表達對LPS誘導(dǎo)HCASMC活力的影響

MTT檢測的結(jié)果表明，空白對照組、模型組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組細胞的A值分別為0.35±0.03、0.56±0.04、0.55±0.04和0.41±0.03。與空白對照組相比，模型組HCASMC 的A值明顯升高（F=77.940，q=17.819，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組HCASMC的A值明顯降低（q=12.728、11.879，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組相比，HCASMC的A值無明顯改變（P>0.05）。提示LPS能夠提高HCASMC活力，敲低HDAC9基因表達能夠抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC活力增加。

2.3 敲低HDAC9表達對LPS誘導(dǎo)HCASMC凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，空白對照組、模型組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組HCASMC凋亡率分別為（6.64±0.74）%、（2.37±0.26）%、（2.56±0.28）%和（7.61±1.42）%。與空白對照組細胞相比較，模型組HCASMC凋亡率明顯降低（F=98.321，q=15.563，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染組HCASMC凋亡率明顯升高（q=19.098、18.406，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組相比較，HCASMC的凋亡率無顯著變化（P>0.05）。提示LPS可阻礙HCASMC凋亡，而敲低HDAC9基因表達能促進LPS誘導(dǎo)的HCASMC凋亡。見圖2。

2.4 敲低HDAC9基因表達對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子分泌的影響

ELISA檢測培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量顯示，與空白對照組相比，模型組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明顯升高（F=91.145～325.808，q=10.813～15.180，Plt;0.05）;與模型組和陰性對照組相比較，轉(zhuǎn)染組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量均明顯降低（q=7.826～8.941，Plt;0.05）;而模型組和陰性對照組相比，上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量無明顯變化（P>0.05）。提示LPS可誘導(dǎo)HCASMC分泌炎癥因子，而敲低HDAC9基因表達能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的表達。見表2。

3 討 論

冠心病是一種慢性炎癥性疾病。研究表明，內(nèi)皮細胞、VSMCs和炎癥細胞參與冠心病的病理過程[10-15]。VSMCs的增殖失控及凋亡抑制在內(nèi)膜增厚過程中起重要作用，是冠心病的重要致病機制。大量研究結(jié)果已證實，內(nèi)皮細胞參與動脈粥樣硬化過程[16-20]。因此，本實驗選取HCASMC為載體，以探究冠心病的發(fā)病機制。近年來的研究結(jié)果已顯示，體外VSMCs增殖受多種生長因子的刺激，如血管緊張素Ⅱ、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、脂多糖（LPS）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF）-β和成纖維細胞生長因子等[21-25]。因此，本實驗結(jié)合以往研究以LPS誘導(dǎo)HCASMC進行造模，以探究HDAC9基因?qū)PS誘導(dǎo)HCASMC增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)影響。本文研究結(jié)果顯示，LPS能夠上調(diào)HCASMC活力，抑制HCASMC凋亡，促進炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8等分泌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這些結(jié)果與以往研究一致。此外，LPS能夠上調(diào)HCASMC中HDAC9基因的表達。

HDAC9基因位于染色體7p21上，該基因?qū)儆贖DAC家族，在心肌、骨骼肌、胎盤等組織中均有表達。靳洲等[26]報道，HDAC9通過促進AS在大動脈粥樣硬化型腦梗死中發(fā)揮重要作用。成海鵬[27]的研究結(jié)果顯示，沉默HDAC9基因能夠促進炎癥因子分泌及巨噬細胞脂質(zhì)的累積。多項研究表明，HDAC9基因多態(tài)性與冠心病、AS和缺血性卒中等密切相關(guān)[28-29]。本研究通過轉(zhuǎn)染特異性HDAC9 siRNA敲低LPS誘導(dǎo)的HCASMC中HDAC9的表達，結(jié)果顯示，敲低HDAC9能夠部分逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的HCASMC活力升高及凋亡下調(diào)。炎癥反應(yīng)的激活能夠改變內(nèi)皮細胞和VSMCs生物學(xué)行為，炎癥因子可以募集更多的炎性細胞以促進AS病變的形成[30-32]。本實驗結(jié)果顯示，敲低HDAC9基因

可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌，降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。提示HDAC9能夠通過抑制炎癥反應(yīng)的激活抑制動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生和進展，但其具體作用機制仍需深入探究。

綜上所述，敲低HDAC9基因能夠抑制LPS誘導(dǎo)的HCASMC增殖及炎癥反應(yīng)，促進HCASMC凋亡。隨著對HDAC9基因研究的深入，相信其可能成為動脈粥樣硬化性心血管疾病治療新的分子靶向，但HDAC9在動脈粥樣硬化性心血管疾病中的作用機制目前尚不十分明確，有待進一步深入探究。此外，本實驗未在動物體內(nèi)進行探究尚顯不足，后續(xù)實驗將對此補充和驗證。

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（本文編輯 于國藝）