[摘要]目的 探討異氟烷（ISO）預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注（I/R）損傷的影響及其機(jī)制。方法 用線栓法構(gòu)建I/R模型，將50只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（A組）、I/R組（B組）、I/R+ISO組（C組）、I/R+ISO+吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）組（D組）和I/R+ISO+二甲基亞砜（DMSO）組（E組），每組10只。用Longa評(píng)分法評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分和TMS評(píng)分，TTC法檢測(cè)腦組織梗死面積，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，ELISA法檢測(cè)腦組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的含量，Western blot檢測(cè)腦組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3和NF-κB p65蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與A組相比較，B、C、D和E組的TMS評(píng)分、Bcl-2表達(dá)水平均明顯降低，而神經(jīng)功能損傷評(píng)分、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β含量均明顯升高（Plt;0.05）。與B組相比，C、D和E組以上各指標(biāo)有不同程度的逆轉(zhuǎn)（Plt;0.05）。而C組和D組比較、C組與E組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。結(jié)論 ISO預(yù)處理可保護(hù)腦I/R損傷，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]再灌注損傷;腦梗死;異氟醚;細(xì)胞凋亡;炎癥;NF-κB信號(hào)通路;大鼠

[中圖分類號(hào)]R977.6;R364.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2021）02-0255-05

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect and mechanism of isoflurane （ISO） preconditioning on cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury. "Methods The suture method was used to establish an I/R model， and 50 rats were randomly divided into sham-operation group （group A）， I/R group （group B）， I/R+ISO group （group C）， I/R+ISO+pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） group （group D）， and I/R+ISO+dimethyl sulfoxide （DMSO） group （group E）， with 10 rats in each group. The Longa scoring method was used to evaluate the neurological deficit score of each group; the TTC method was used to measure brain infarct area; the TUNEL method was used to measure the apoptosis rate of neural cells; the ELISA method was used to measure the content of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in brain tissue; Western blot was used to measure the protein expression of Bcl-2， cleaved caspase-3， and NF-κB p65 in brain tissue. "Results Compared with group A， groups B， C， D， and E had significant reductions in TMS score and the expression level of Bcl-2 and significant increases in neurological deficit score， apoptosis rate of neural cells， brain infarct area， expression levels of NF-κB p65 and cleaved caspase-3， and levels of TNF-α and IL-1β （Plt;0.05）. Compared with group B， groups C， D， and E had varying degrees of reversal of the above indices （Plt;0.05）. There were no significant differences between group C and group D and between group C and group E （Pgt;0.05）."Conclusion ISO pretreatment can protect the brain against I/R injury， possibly by inhibiting the NF-κB signaling pathway to reduce neural cell apoptosis and alleviate inflammatory response.

[KEY WORDS]reperfusion injury; brain infarction; isoflurane; apoptosis; inflammation; NF-kappa B signaling pathway; rats

腦缺血再灌注（I/R）損傷是一種由多種因素引起的病理過程，與腦細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[1-3]。NF-κB信號(hào)通路是一種與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷（ISO）預(yù)處理可通過抑制腦細(xì)胞凋亡和減弱炎癥反應(yīng)等機(jī)制改善腦I/R損傷[7-8]。但NF-κB信號(hào)通路是否與ISO的保護(hù)機(jī)制有關(guān)尚不清楚。因此，本研究旨在探究ISO對(duì)I/R損傷的影響以及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。本研究利用NF-κB信號(hào)通路抑制劑，通過觀察ISO對(duì)I/R大鼠腦細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討ISO保護(hù)腦I/R損傷的作用機(jī)制是否與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD雄性大鼠（體質(zhì)量260～300 g，2～3周齡）購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，ISO購(gòu)于美國(guó)Baxter公司。細(xì)胞裂解液、硝酸纖維素膜、顯影液、定影液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所，NF-κB p65兔多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)MILLIPORE公司，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）兔多克隆抗體和兔源二抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。NF-κB信號(hào)通路抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購(gòu)于德國(guó)Ramp;D Germany公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 I/R模型的制備、ISO預(yù)處理與實(shí)驗(yàn)分組

I/R模型的制備：以腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉的方法麻醉大鼠，固定大鼠去除頸前毛，并以體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇溶液對(duì)頸部皮膚進(jìn)行消毒。在頸正中做切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈以及頸內(nèi)外動(dòng)脈，將尼龍線栓（直徑0.38 mm）從頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈（約長(zhǎng)20 mm）直至有阻力感。在缺血90 min后，拔出線栓，進(jìn)行再灌注24 h。I/R大鼠模型制備成功的判斷參照LONGA等[9]的標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)處理方法：ISO組在I/R前進(jìn)行ISO預(yù)處理，將大鼠置于自制密閉的實(shí)驗(yàn)艙中，頭端分別連接進(jìn)氣孔和連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀。維持箱內(nèi)溫度35～37 ℃，經(jīng)麻醉機(jī)輸送體積分?jǐn)?shù)0.015的ISO氣體至實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，并調(diào)節(jié)氧體積分?jǐn)?shù)為0.70左右，逐漸升高麻醉氣體濃度，根據(jù)Datex氣體檢測(cè)儀調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)ISO濃度為體積分?jǐn)?shù)0.015時(shí)，維持以上濃度穩(wěn)定15 min后放入大鼠進(jìn)行預(yù)處理。連續(xù)5 d吸入體積分?jǐn)?shù)0.015的ISO氣體，每天1 h。吸入ISO氣體過程中分別監(jiān)測(cè)脈搏氧分壓（SpO2）和脈率。末次預(yù)處理24 h后行I/R。

實(shí)驗(yàn)分組：將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。①假手術(shù)組（A組）：分離血管后不插入線栓。②I/R組（B組）：參照I/R模型的制備方法制備腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型，在缺血90 min后再灌注。③I/R+ISO組（C組）：在缺血前60 min給予體積分?jǐn)?shù)0.02的ISO誘導(dǎo)30 min，之后行I/R。④I/R+ISO+PDTC組（D組）：缺血前60 min給予體積分?jǐn)?shù)0.02的ISO誘導(dǎo)30 min，并于側(cè)腦注射10 μL的NF-κB信號(hào)通路特異性抑制劑PDTC（以二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.3 mg/kg），然后再行I/R。⑤I/R+ISO+DMSO組（E組）：缺血前60 min給予體積分?jǐn)?shù)0.02的ISO誘導(dǎo)30 min，并于側(cè)腦注射10 μL的DMSO，再行I/R。

1.2.2 神經(jīng)功能損傷和TMS評(píng)分 采用Longa評(píng)分法對(duì)缺血再灌注后24 h的各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。神經(jīng)功能損傷評(píng)分：無神經(jīng)損傷記為0分，左前肢出現(xiàn)伸展障礙記為1分，向左打圈記為2分，行走時(shí)向左側(cè)傾斜記為3分，意識(shí)昏迷記為4分，死亡記為5分;評(píng)分越高神經(jīng)功能損傷程度越嚴(yán)重。TMS評(píng)分：各組大鼠在再灌注后2 h進(jìn)行TMS評(píng)分，參照LONGA等[9]報(bào)道的方法對(duì)大鼠抓屏、抓繩和平衡木等3個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，評(píng)分越高表明神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能越好。

1.2.3 TTC法檢測(cè)梗死面積 在各組大鼠處理結(jié)束后，脫臼處死大鼠。取腦組織，并做厚度為2 mm的冠狀組織切片，以10 g/L的TC溶液染色15～20 min，其中呈紅色的為正常腦組織，呈白色的為梗死區(qū)域腦組織。以40 g/L多聚甲醛進(jìn)行固定。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)染色切片進(jìn)行分析。梗死面積（%）=白色區(qū)域面積/（白色區(qū)域面積+紅色區(qū)域面積）×100%。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡 采用40 g/L多聚甲醛對(duì)各組大鼠腦組織固定后，以石蠟進(jìn)行包埋切片。根據(jù)TUNEL試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色。其中，呈綠色熒光的為陽性細(xì)胞。在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值表示神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)海馬組織中NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá) 向各組腦組織勻漿中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA法定量總蛋白后，將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳。待完全分離后，結(jié)束電泳。恒流轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，加入1∶1 000的特異性一抗（NF-κB p65、Bcl-2和Cleaved Caspase-3）4 ℃下孵育2 h。次日，加入1∶2 000的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。暗室內(nèi)顯影曝光后，以GAPDH為對(duì)照，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)腦組織中TNF-α和IL-1β的含量 取各組大鼠的腦組織制備勻漿，嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)各組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x2±s形式表示，多組組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能的比較

與假手術(shù)組比較，其余4組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯升高，而TMS評(píng)分明顯降低（F=38.626、404.130，Plt;0.05）;與I/R組相比，I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分均明顯降低，而TMS評(píng)分明顯升高（q=7.776～15.231，Plt;0.05）;與I/R+ISO組相比，I/R+ISO+PDTC組的神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯降低，而TMS評(píng)分明顯升高（q=4.030、12.124，Plt;0.05），但I(xiàn)/R+ISO+DMSO組無顯著差異（q=0.403、0.501，Pgt;0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與腦組織梗死面積的比較

I/R組、I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積較假手術(shù)組均明顯升高（F=111.952、272.910，Plt;0.05）。I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積較I/R組均明顯降低（q=11.361～19.237，Plt;0.05）;并且，I/R+ISO+PDTC組明顯低于I/R+ISO組（q=5.248、9.211，Plt;0.05），而I/R+ISO+DMSO組與I/R+ISO組比較差異無顯著意義（q=1.040、1.348，Pgt;0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織中NF-κB p65、Bcl-2以及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

與假手術(shù)組大鼠相比，其余4組中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（F=43.929～114.750，Plt;0.05）。同時(shí)，與I/R組相比，除假手術(shù)組外的另外3組中NF-κB p65和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高（q=9.192～12.328，Plt;0.05）;并且，在I/R+ISO+PDTC組中上述變化幅度明顯小于I/R+ISO組（q=5.527～9.900，Plt;0.05），而I/R+ISO組與I/R+ISO+DMSO組無顯著差異（q=0.850～1.414，Pgt;0.05）。見圖1和表3。

2.4 各組大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β含量的比較

與假手術(shù)組相比，其余4組中TNF-α和IL-1β含量均明顯升高（F=20.613、30.197，Plt;0.05）。I/R+ISO組、I/R+ISO+PDTC組和I/R+ISO+DMSO組中TNF-α和IL-1β含量較I/R組均明顯降低（q=5.244～7.381，Plt;0.05）。同時(shí)，I/R+ISO+PDTC組明顯低于I/R+ISO組（q=3.580、3.628，Plt;0.05），而I/R+ISO+DMSO組與I/R+ISO組比較差異無顯著性（q=0.218、0.636，Pgt;0.05）。見表4。

3 討 論

在I/R過程中，中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等可通過釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加重細(xì)胞損傷，而炎癥因子的釋放受多種信號(hào)通路調(diào)控[10-13]。另外，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦I/R損傷的重要環(huán)節(jié)，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的重要前提[14-15]。因此，尋找有效抑制細(xì)胞凋亡和改善炎癥反應(yīng)的信號(hào)靶點(diǎn)對(duì)減輕腦I/R損傷具有重要意義。

眾所周知，NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的多效核轉(zhuǎn)錄因子，p65是其重要的功能性亞單位，翻譯后修飾能夠精細(xì)地激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞基因，參與細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡、炎癥和免疫反應(yīng)等過程[16-17]。目前多項(xiàng)研究顯示，NF-κB與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和心血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-20]，是多種藥物介入方面潛在的靶標(biāo)。

ISO是一種揮發(fā)性麻醉劑，一項(xiàng)研究證實(shí)ISO預(yù)處理可通過激活A(yù)kt/mTOR/s6K信號(hào)通路減輕I/R損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)功能缺損、梗死體積、腦水腫和細(xì)胞凋亡等[7]。PENG等[21]指出，ISO通過TGF-β2/Smad3信號(hào)通路增強(qiáng)VEGF和CD34的活化來減輕I/R損傷。此外，ISO還能夠有效緩解大鼠腦I/R損傷[22]。ZHAO等[23]研究結(jié)果顯示，在腦I/R損傷后大鼠腦組織中NF-κB信號(hào)通路被激活，腦梗死體積增大和病理改變加重，神經(jīng)功能障礙明顯，而

抑制NF-κB信號(hào)通路后，大鼠腦I/R損傷可明顯減輕。ZHANG等[24]研究顯示，脂聯(lián)素通過抑制海馬中的P38-MAPK信號(hào)通路來改善ISO引起的老年大鼠認(rèn)知功能障礙。另一項(xiàng)研究顯示，ISO誘導(dǎo)CUMS小鼠中BDNF-TrkB信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抗抑郁作用[25]。以上研究提示，ISO能夠調(diào)控不同信號(hào)通路在多種疾病中發(fā)揮作用。

本研究通過構(gòu)建I/R損傷大鼠模型，ISO預(yù)處理后I/R損傷大鼠TMS評(píng)分、Bcl-2表達(dá)水平均明顯升高，而神經(jīng)功能損傷評(píng)分、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β含量均明顯降低。Bcl-2是公認(rèn)的抑凋亡基因，Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行因子，活化的Caspase-3以Cleaved Caspase-3形式存在;兩者均在腦I/R損傷的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[26-27]。本文結(jié)果提示，ISO預(yù)處理可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減弱炎癥反應(yīng)以發(fā)揮保護(hù)腦I/R損傷的作用。而以NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC作用后，I/R損傷大鼠的TMS評(píng)分、Bcl-2表達(dá)水平均進(jìn)一步升高，而神經(jīng)功能損傷評(píng)分、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和腦組織梗死面積、NF-κB p65和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β含量進(jìn)一步降低。本文研究結(jié)果表明，ISO對(duì)腦I/R損傷的保護(hù)作用進(jìn)一步增強(qiáng)。提示，ISO可通過抑制NF-κB信號(hào)通路減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕腦I/R損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，NF-κB信號(hào)通路在腦I/R損傷過程中發(fā)揮著重要作用，ISO預(yù)處理可通過抑制其激活抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來減輕腦I/R損傷。本研究為腦I/R損傷發(fā)病機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為ISO用于腦I/R損傷治療提供一定的理論基礎(chǔ)。然而，本實(shí)驗(yàn)未涉及ISO是否調(diào)控其他信號(hào)通路尚顯不足，后續(xù)研究將對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充和完善，且大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)也有一定差距，ISO用于腦I/R損傷治療仍然需要大量的研究。

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