[摘要]目的 探討7，8-二羥基黃酮（7，8-DHF）對大鼠心肌缺血-再灌注（I/R）損傷的影響及機制。方法 選取雄性健康Wistar大鼠18只，隨機分為3組，每組6只。假手術(shù)組（Sham組）大鼠開胸，左冠狀動脈前降支（LAD）只穿線不結(jié)扎;I/R組先結(jié)扎LAD缺血30 min，再恢復(fù)血供3 h;I/R+7，8-DHF組先缺血30 min，恢復(fù)血供前10 min腹腔注射7，8-DHF（10 mg/kg）。心臟恢復(fù)血供3 h后處死大鼠，對血清中乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的活力進行檢測，取結(jié)扎線下方的心肌組織采用Western blot方法檢測與凋亡有關(guān)的蛋白。結(jié)果與Sham組相比較，I/R組大鼠血清中LDH和CK-MB的活力分別升高35%和71%，7，8-DHF預(yù)處理則部分抑制了上述變化（F=18.770、5.422，q=3.788～7.800，P<0.05）。Western blot檢測顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達顯著降低，而Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著增加;與I/R組相比，I/R+7，8-DHF組Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著減少（F=6.217～14.720，q=3.797～7.546，P<0.05）。結(jié)論 7，8-DHF預(yù)處理對大鼠的心肌I/R損傷具有保護作用，該作用可能與其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]黃酮類;心肌再灌注損傷;細(xì)胞凋亡;大鼠

[中圖分類號]R337.1;R542.2

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0210-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of 7，8-dihydroxyflavone （7，8-DHF） on myocardial ischemia-reperfusion （I/R） injury in rats and its mechanism. "Methods A total of 18 healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into sham-operation group （sham group）， I/R group， and I/R+7，8-DHF group， with 6 rats in each group. The rats in the sham-operation group were given thoracotomy without ligation of the left anterior descending coronary artery （LAD）， those in the I/R group were given ligation of the LAD for 30 min of ischemia， followed by the restoration of blood supply for 3 h， and those in the I/R+7，8-DHF group were given ischemia for 30 min， followed by intraperitoneal injection of 7，8-DHF （10 mg/kg） at 10 min before the restoration of blood supply. The rats were sacrificed at 3 h after the restoration of blood supply， and the serum levels of lactate dehydrogenase （LDH） and creatine kinase-MB （CK-MB） were measured. The myocardial tissue below the ligature was collected to measure apoptosis-related proteins by Western blot."Results Compared with the sham group， the I/R group had significant increases in the serum levels of LDH and CK-MB （increased by 35% and 71%， respectively）， and these changes were partially inhibited by 7，8-DHF pretreatment （F=18.770 and 5.422，q=3.788-7.800，Plt;0.05）. Western blot showed that compared with the sham group， the I/R group had a significant reduction in the protein expression of Bcl-2 and significant increases in the protein expression of Bax and cleaved caspase-3 in myocardial tissue; compared with the I/R group， the I/R+7，8-DHF group had a significant increase in the protein expression of Bcl-2 and significant reductions in the protein expression of Bax and cleaved caspase-3 （F=6.217-14.720，q=3.797-7.546，Plt;0.05）.Conclusion Pretreatment with 7，8-DHF has a protective effect against myocardial I/R injury in rats， possibly by inhibiting cardiomyocyte apoptosis.

[KEY WORDS]flavones; myocardial reperfusion injury; apoptosis; rats

心肌缺血通常由冠狀動脈的狹窄或阻塞所引發(fā)。心肌組織中血流的減少或者阻斷會引起冠狀動脈所支配區(qū)域的營養(yǎng)物質(zhì)供給和氧氣供應(yīng)減少，最終使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死[1-2]。但是缺血部位心肌組織的血供恢復(fù)后，由于細(xì)胞內(nèi)活性氧增多、鈣離子失衡、細(xì)胞能量代謝異常、炎癥反應(yīng)等原因[3]，會使得心肌細(xì)胞遭受更為嚴(yán)重的損傷[4]，即缺血-再灌注（I/R）損傷。I/R損傷通常會引發(fā)心肌頓抑、室內(nèi)壓下降等心肌功能的抑制，其預(yù)防與治療長期以來都是心血管研究領(lǐng)域的重要課題。7，8-二羥基黃酮（7，8-DHF）是黃酮化合物之一。最近有研究表明，7，8-DHF是酪氨酸激酶B（TrkB）受體的特異性激動劑[5]，具有強大的神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用[6]。在心血管疾病的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，苯腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠胸主動脈收縮可被7，8-DHF顯著抑制， 而且該作用與降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平和激活一氧化氮/環(huán)鳥苷酸信號通路有關(guān)[7]。此外，7，8-DHF還能拮抗過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。但是7，8-DHF對I/R損傷是否具有保護作用尚未見報道。本研究通過對大鼠左冠狀動脈前降支（LAD）進行結(jié)扎處理，建立心肌I/R損傷的動物模型，探討恢復(fù)血供前7，8-DHF預(yù)處理對再灌注心肌是否具有保護作用，并初步探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品和儀器

7，8-DHF（D1916）購自東京化成工業(yè)株式會社?？笲cl-2抗體（AB112）、抗Bax抗體（AF0057）和BCA蛋白檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司，抗cleaved caspase-3（CST-9661）抗體購自美國CST公司，抗β-actin抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司，實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。所用實驗儀器包括小動物呼吸機（型號ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司）、Eppendorf高速離心機、SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀、微量分析天平和Western 顯影儀等。

1.2 動物分組及處理

實驗選用8～10周齡的雄性Wistar大鼠18只，體質(zhì)量（250±10）g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（許可證號：SCXK（魯）20190003）。實驗開始前，大鼠先在23～25 ℃、12 h/12 h明暗周期環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，自由飲水和進食。造模前，大鼠先禁食12 h，期間自由飲水。將大鼠隨機分為3組，每組6只。①假手術(shù)組（Sham組，A組）：大鼠麻醉并且固定后，通過口腔接入呼吸機輔助其呼吸;打開胸腔，將縫合線穿過LAD下方但不結(jié)扎，20 min后腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)0.05二甲基亞砜（DMSO）的磷酸鹽緩沖液（PBS），10 min后縫合傷口。②I/R組（B組）：開胸，結(jié)扎LAD 20 min后腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)0.05 DMSO的PBS，10 min后取出結(jié)扎線，即缺血30 min后恢復(fù)血供。③I/R+7，8-DHF組（C組）：在結(jié)扎LAD 20 min后腹腔注射7，8-DHF（10 mg/kg），其他處理與I/R組相同。所有大鼠均在恢復(fù)血供3 h后處死。本實驗過程遵循國際實驗動物使用標(biāo)準(zhǔn)和倫理學(xué)要求。

1.3 血清及心肌標(biāo)本制備

大鼠心臟恢復(fù)血供3 h后，通過尾靜脈取血約1.0 mL，先存放于4 ℃冰箱中靜置1 h，隨后再以3 000 r/min離心15 min，分離血清于新EP管中，凍存于-80 ℃冰箱備用。將心臟快速取出，放入預(yù)冷的PBS中清洗，保留結(jié)扎線以下的部分，剪去右心室，其余部分（左心室為主）用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）活力檢測

血清標(biāo)本送至海軍青島第一療養(yǎng)院檢驗科測定。血清中LDH的活力采用速率法測定，CK-MB的活力采用免疫抑制法測定。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)蛋白的Western blot檢測

取20～30 mg心肌組織，將其充分剪碎后放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入200～300 μL蛋白裂解液充分研磨，以12 000 r/min離心20 min，留取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。每個樣本的蛋白上樣量均為20 μg，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用100 g/L脫脂奶粉室溫慢搖封閉90 min，分別加入抗Bcl-2抗體（1∶1 000）、抗Bax抗體（1∶1 000）、抗cleaved caspase-3抗體（1∶1 000）和抗β-actin抗體（1∶10 000）。在4 ℃冰箱內(nèi)的搖床上慢速搖動孵育過夜，隨后以TBST洗膜3次，每次10 min，再加入二抗，室溫孵育1 h后，以TBST洗膜3次，最后用ECL發(fā)光液顯影。用軟件Image J對條帶的灰度值進行分析。結(jié)果以目的蛋白灰度值與相對應(yīng)的β-actin灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以x2±s的形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey法。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 7，8-DHF對血清LDH和CK-MB活力的影響

與Sham組相比，I/R組大鼠血清中LDH的活力升高了35%（F=18.770，q=7.167，P<0.01）;與I/R組相比，I/R+7，8-DHF組LDH活力下降了28%（q=7.800，P<0.01）。血清CK-MB活力的變化與LDH類似，與Sham組相比較，I/R組大鼠血清中CK-MB的含量升高了71%（F=5.422，q=4.240，P<0.05）。與I/R組大鼠相比，I/R+7，8-DHF組CK-MB活力下降了37%（q=3.788，P<0.05）。提示7，8-DHF抑制了I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。見表1。

2.2 7，8-DHF對心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)蛋白表達影響

與Sham組相比，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白的表達顯著降低（F=6.217，q=4.698，P<0.05），Bax和cleaved caspase-3蛋白表達顯著增加（F=14.720、7.653，q=7.546、4.975，P<0.01），表明I/R損傷會導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。與I/R組相比，I/R+7，8-DHF組Bcl-2蛋白表達升高了86%（q=3.797，P<0.05），Bax蛋白表達減少了45%（q=4.977，P<0.01），cleaved caspase-3蛋白表達減少了42%（q=4.584，P<0.05），說明7，8-DHF有效抑制了I/R損傷造成的心肌細(xì)胞凋亡。見表2和圖1。

3 討 論

急性心肌梗死（AMI）通常由冠狀動脈內(nèi)血流急劇減少或中斷造成，會導(dǎo)致心肌組織中血液供應(yīng)的減少，從而引發(fā)嚴(yán)重后果。近年來AMI的防治已取得較大進展[9]，但是缺血后的心肌組織在血流恢復(fù)之后，依然會出現(xiàn)生理功能的進一步損傷，稱為心肌I/R損傷。I/R損傷會導(dǎo)致心肌頓抑、心律失常和心肌壞死等惡性后果，其預(yù)防與治療一直是AMI治療中的重要環(huán)節(jié)，但是目前還無特別有效的防治方法。

心肌I/R損傷存在明顯的心肌細(xì)胞凋亡，這可能與氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[10-11]。細(xì)胞凋亡受到多種信號通路和蛋白的調(diào)控。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族蛋白成員，Bax蛋白形成二聚體后可增加線粒體膜通透性，促進線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2蛋白則通過抑制Bax二聚體形成抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡中最重要的效應(yīng)酶是caspase-3，它激活后可以裂解形成分子量為17 000～19 000的片段，稱為cleaved caspase-3。所以通過檢測Bcl-2、Bax以及cleaved caspase-3蛋白水平，可以評估心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。

7，8-DHF是黃酮家族中的一員，具有神經(jīng)保護[13]、抗氧化[14]、抗炎癥[15]、抗腫瘤[16]、抗增殖[17]等多種生物學(xué)作用。黃酮類化合物的心血管保護作用已有較多研究[18]。例如，黃芩苷可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號途徑以及抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號傳導(dǎo)來抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥[19]，從而抑制心肌I/R損傷。但是，7，8-DHF對I/R造成的心肌組織損傷是否具有保護作用尚無相關(guān)研究。

心肌細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞膜通透性增強，細(xì)胞內(nèi)的某些酶釋放入血，血清中這些酶活力的升高程度則反映出了心肌壞死的程度[20]。本研究首先通過測定血清中LDH和CK-MB的變化，觀察7，8-DHF預(yù)處理對缺血心肌損傷的保護作用。結(jié)果顯示，I/R組大鼠血清中LDH和CK-MB的活力均明顯升高，7，8-DHF預(yù)處理則部分抑制了上述變化，提示7，8-DHF預(yù)處理對再灌注的心肌組織具有一定的保護作用。為了進一步探討7，8-DHF保護作用的機制，本研究通過檢測Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達來評估心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。結(jié)果顯示，I/R組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達降低，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達升高，提示I/R大鼠心肌存在明顯的細(xì)胞凋亡，7，8-DHF預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化，進一步驗證了7，8-DHF的心肌保護作用，并且表明該作用與其抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果為7，8-DHF應(yīng)用于心肌I/R損傷的防治提供了一定的實驗依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）